Arteria embólico cerebral media oclusión (MCAO) para el ictus isquémico con homólogas coágulos de sangre en las ratas

Resumen

In this paper, we demonstrate a standard method for producing an embolic middle cerebral artery occlusion with homologous blood clots (fibrin-rich) in adult rat. This model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical study of thrombolytic therapy for ischemic stroke.

Resumen

Terapia Clínicamente, trombolítico con el uso del activador del plasminógeno tisular recombinante (tPA) sigue siendo el tratamiento más eficaz para el accidente cerebrovascular isquémico agudo. Sin embargo, el uso de tPA está limitada por su estrecha ventana terapéutica y por el aumento de riesgo de transformación hemorrágica. Hay una necesidad urgente de desarrollar modelos de carrera adecuados para estudiar nuevos agentes trombolíticos y estrategias para el tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico. En la actualidad, hay dos tipos principales de modelos de accidente cerebrovascular isquémico se han desarrollado en ratas y ratones: MCAO sutura intraluminal y embólico MCAO. Aunque los modelos MCAO a través de la técnica de sutura intraluminal han sido ampliamente utilizados en mecanismo impulsado investigación del accidente cerebrovascular, estos modelos de sutura no imitan la situación clínica y no son adecuados para estudios trombolíticos. Entre estos modelos, el modelo de MCAO embólico imita estrechamente accidente cerebrovascular isquémico humano y es adecuado para la investigación preclínica de la terapia trombolítica. Este modelo embólico fue desarrollado por primera vez en ratas por Overgaard et al. ¹ en 1992 y caracterizado además por Zhang et al. en 1997 ^2. Aunque embólico MCAO ha ganado cada vez más atención, hay problemas técnicos que enfrentan muchos laboratorios. Para satisfacer las crecientes necesidades de investigación trombolítico, se presenta un modelo altamente reproducible de embólico MCAO en ratas, lo que puede desarrollar un volumen de infarto predecible dentro del territorio de la ACM. En resumen, un PE-50 tubo modificado se avanza suavemente desde la arteria carótida externa (ACE) en el lumen de la arteria carótida interna (ACI) hasta que la punta del catéter alcanza el origen de la MCA. A través del catéter, un solo coágulo de sangre homóloga se coloca en el origen de la MCA. Para identificar el éxito de oclusión de la ACM, el flujo sanguíneo cerebral regional se controló, se midieron los déficits neurológicos y los volúmenes de infarto. Las técnicas que se presentan en este documento deben ayudar a los investigadores a superar los problemas técnicos para el establecimiento de este modelo para la investigación de un accidente cerebrovascular. </ P>

Introducción

El accidente cerebrovascular es la tercera causa principal de muerte en los Estados Unidos, pero las opciones de tratamiento para el accidente cerebrovascular agudo permanece limitada. En la actualidad, la infusión intravenosa de activador de plasminógeno tisular recombinante (tPA) para disolver los coágulos de sangre es la terapia más eficaz para el accidente cerebrovascular isquémico agudo. Sin embargo, el uso de tPA está limitada por su estrecha ventana terapéutica y por el aumento de riesgo de hemorragia intracerebral. Por lo tanto, se necesita urgentemente un modelo de accidente cerebrovascular adecuado para la investigación trombolítico.

La arteria cerebral media (MCA) es la arteria ocluida más a menudo en el accidente cerebrovascular en los seres humanos. Centrado en esta arteria, se han establecido muchos modelos animales de accidente cerebrovascular isquémico. En la actualidad, se han desarrollado dos tipos principales de modelos de isquemia focal de roedores por la oclusión de la MCA: sutura modelo MCAO y embólico MCAO modelo. Aunque los modelos MCAO a través de la técnica de sutura intraluminal han sido ampliamente utilizados en mecanismo impulsado investigación del accidente cerebrovascular, estos modelos de sutura no lo hacenderrame cerebral humano imitador, como hasta el 80% de los ictus humanos son causados ​​por trombosis o embolia. Sin embargo, embólico modelo de accidente cerebrovascular usando coágulos de sangre imita estrechamente derrame cerebral humano y se considera adecuada para el estudio trombolítico. Este modelo embólico fue desarrollado por primera vez en ratas por Overgaard et al. ¹ en 1992 y se caracteriza por Zhang et al. En 1997 ² y por Dinapoli et al. En 2006 ^3. Aunque embólico MCAO ha ganado cada vez más atención, hay problemas técnicos que enfrentan por muchos laboratorios.

En este artículo, se demuestra un método estándar para la producción de embólico MCAO con coágulos de sangre homóloga en la rata adulta, lo que puede desarrollar un infarto predecible dentro del territorio de la ACM. Las técnicas presentadas en este artículo deben ayudar a los investigadores a superar los problemas técnicos que permitan determinar este modelo para la investigación de un accidente cerebrovascular.

Protocolo

Declaración de Ética: ratas macho adultas Sprague-Dawley (330-380 g de pesaje) se utilizaron en este protocolo. Este protocolo fue aprobado por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) en la LSU Health Science Center-Shreveport y está en conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio "(octava edición, la Academia Nacional de Ciencias, 2011 ).

1 Preparación de modificación Tubo PE-50

1. Mantenga un largo tubo PE-50 de 30 cm por encima de una estufa de gas con las manos, suavizar gradualmente el tubo. Estire suavemente el tubo.
2. Seleccionar un punto en el tubo estirado usando un calibre digital (Figura 1), marcarlo, y cortar el tubo de PE-50 modificado en un segmento de 25 cm de largo con una punta de 1 cm de largo (diámetro exterior: ,30-,34 mm).

2 Preparación de homólogos coágulos sanguíneos

1. Anestesiar la rata con isoflurano (5% para la inducción, 2-3% para mantenimiento) en el 70% de N ₂ O y 30% O _{2 por una mascarilla antes de la recogida de sangre. Confirmar la anestesia por una pizca dedo del pie.}
2. Realizar canulación arterial femoral de una rata donante con método publicado ⁴ y transferir sangre de la arteria femoral directamente en un 20 cm de largo PE-50 tubos. Colocar el tubo durante 2 horas a temperatura ambiente para coagular la sangre, y después retener el tubo durante 22 horas a 4 ° C. Nota: La canulación se realiza utilizando una técnica aséptica como se describe en el paso 3.1. La rata donante se recupera para su posterior muestreo.
3. Cortar el tubo de PE-50 en segmentos de 50 mm y enjuagar el coágulo desde el tubo en una placa de Petri estéril que contiene solución salina normal.
4. La transferencia de los 50 mm de largo en un coágulo de 60 mm de largo tubo de PE-10 y conectar cada extremo del tubo de PE-10 a un 20 cm de largo PE-50 tubo conectado a la jeringa de 1 ml que contiene solución salina normal con 23 T de la aguja (Figura 2) .
5. Desplazar el coágulo mediante movimiento alternativo continuo de una jeringa a la otra durante 5 min, lo que puede eliminar las células de sangre deel coágulo y minimizar el frágil del coágulo coagulada extravascular, sin interrumpir el núcleo de fibrina.
6. Cortar el coágulo en un segmento de 40 mm de largo y transferir el segmento de coágulo en un catéter PE-50 modificado como se describe en el paso 1.2 en condiciones asépticas. Nota: Todos los tubos PE se esteriliza con óxido de etileno.

3. embólico arteria cerebral media oclusión (Figura 3A, B)

1. Esterilizar todas las herramientas quirúrgicas en autoclave (mínimo 121 ° C, 15 PSI, durante 15 min). Desinfectar la mesa de cirugía y equipo quirúrgico asociado utilizando etanol al 70%.
2. Anestesiar la rata con isoflurano como se describe en el paso 2.1. Pon a prueba la profundidad de la anestesia mediante la realización de una pizca dedo del pie en ambos pies traseros, y cualquier movimiento observado (la retirada de la pata) indica que el animal no es suficientemente anestesiado para hacer la cirugía. Aplique una pequeña cantidad de ungüento veterinario en ambos ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. Afeitarse la piel en el cuello y la cabeza ventral reregiones con maquinilla eléctrica para exponer las áreas de la piel.
3. Coloque la rata en la posición supina sobre una almohadilla térmica. Inserte una sonda rectal, controlar y mantener la temperatura corporal entre 36,5 a 37,5 ° C utilizando una unidad de control manta homeotérmica.
4. Desinfectar la piel afeitada y piel circundante con un 10% de povidona-yodo seguido de etanol al 70%.
5. Hacer una incisión de 2 cm de largo en el cuello con un microscopio de disección. Utilice separadores para exponer el campo quirúrgico y disecar la arteria carótida común derecha (CCA), la arteria carótida externa (ACE), la arteria carótida interna (ACI), y la arteria pterigopalatino (PPA) libres de los nervios circundantes y fascia (Figura 3A). Nota: Antes de la cirugía, cambiar los guantes estériles si no hay asistente ayuda a preparar el animal.
6. Diseccionar la CCA libres de los nervios que lo rodean (sin dañar el nervio vago) y colocar una sutura de seda 5-0 estéril debajo de la arteria. Ate un nudo corredizo (# 1) y captar la sutura utilizando unos pequeños: hemostat y tire enseñó hacia el cuerpo.
7. Diseccionar la ECA y sus dos ramas, la arteria occipital (OA) y la arteria tiroidea superior (STA). Coagular dos ramas utilizando una unidad de electrocirugía veterinaria. Coloque dos trozos de 6-0 suturas de seda estériles en el ACA.
8. Separar las dos sedas colocados debajo de la arteria, de una sola pieza hacia la cabeza (extremo distal) y el otro hacia el cuerpo. Ate una ligadura apretada (# 2) en el lado más cercano a la cabeza, agarre la seda con pequeñas pinzas y tire enseñado hacia la cabeza. Preparar un nudo flojo (# 3) con la otra seda para su uso posterior.
9. Diseccionar el ICA y PPA de los nervios que lo rodean (sin dañar el nervio vago). Ate la PPA con una sutura 6-0 (# 4). Haga un nudo corredizo con 6-0 sutura alrededor del ICA (# 5). Alternativamente, una pinza de la ICA usando un clip microvascular.
10. Corte un agujero pequeño (1/2 a través) en el ACE entre la apretada (# 2) y (# 3) ligaduras sueltas con unas tijeras de primavera al estilo Vannas. Inserte la PE-50 modificado bañerae que contiene coágulo de sangre dentro de la incisión y avanzar a la bifurcación de la CCA. Apriete la ligadura floja (# 3) alrededor de la luz lo suficiente como para asegurar preservar la movilidad del tubo-en la vivienda.
11. Cortar la ECA en el lugar del pequeño agujero para liberar el muñón y colocar el muñón por debajo de la bifurcación de la ECA y el ICA; esto permitirá que el tubo modificado deslice fácilmente en el ICA. Abra la ACI y avanzar suavemente el tubo del lumen de la ECA en el ICA hasta que la punta del catéter alcanza el origen de la MCA (~ 17 mm de la bifurcación). Nota: Antes de insertar la punta del tubo en el ECA, estéril la superficie exterior del tubo con etanol al 70%, y luego se lava con solución salina normal estéril.
12. Inyectar el coágulo a través de la PE-50 modificado catéter junto con 10 l de solución salina durante 10 s usando una jeringa Hamilton de 100 l (Figura 3B).
13. Retire la sonda de la ECA 5 minutos más tarde. Ate la ECA y volver a abrir CCA. Suturar la incisión en el cuello.

4. Supervisión del flujo sanguíneo cerebral regional (rCBF)

1. Antes de la oclusión de la MCA, hacer una incisión de línea media 1.2 cm de longitud en el cuero cabelludo para exponer el hueso del cráneo. Quite los tejidos del hueso del cráneo con un raspador dental y swaps de algodón estériles. Nota: Antes de la cirugía, la zona del cuero cabelludo y la piel circundante expuesta se desinfectan con un 10% de povidona-yodo seguido de etanol al 70%.
2. Perforar un agujero de trépano de diámetro 1,5 mm situado en 2 mm posterior y 5 mm lateral al bregma usando una fresa de 0,7 mm esférica de acero inoxidable (Figura 4).
   NOTA: Mantenga la duramadre intacta.
3. Coloque la sonda de 0,5 mm por encima de la superficie dura. Monitorear la rCBF a 0 (línea de base), 5, 15, 30, 60, 90, y 120 min después de la embolización y continuar en 5, 15, 30, 45, y 60 min después de la administración intravenosa de tPA. Después de la última medición de rCBF, la incisión del cuero cabelludo se cierra mediante sutura. Nota: Antes de la incisión en el cuello medimos rCBF como línea de base antes de MCA Occlusde iones. Mensaje MCA oclusión medimos rCBF después del cierre de sutura de incisión del cuello. Por lo tanto, la incisión en el cuello se mantiene estéril.

Cuidado 5. postoperatoria

1. Inyectar 2,5 ml de solución salina por vía subcutánea para evitar la deshidratación e inyectar Buprenex (0,05 mg / kg, SC) inmediatamente después de la cirugía y cada 6-12 horas según sea necesario para aliviar el dolor.
2. Deje de anestesia con isoflurano. Coloque la rata en una cámara de recuperación veterinaria 37 ° C (mantener animales caliente) y mantener la observación. Generalmente se tarda 10 min para la rata para recuperarse de la anestesia. Luego, se coloca el animal en una jaula esterilizada, coloque un poco de comida humedecida en una placa de Petri en la jaula, y volver a la jaula para sala de esterilización de animales.
3. 24 hr después del accidente cerebrovascular, la rata eutanasia con una sobredosis de pentobarbital sódico (100 mg / kg de peso corporal, ip).

6. neurológico de Déficit de Score

1. Realizar la puntuación Bederson antes ya las 2 horas después de la embolización. Use un s de calificacióncale de 0-3 como se ha descrito previamente ^5: 0, elevando la rata por la cola, el animal se extiende ambas patas delanteras en el suelo y no exhiben otros déficits (movimiento normal); 1, el aumento de la rata por la cola, flexionar la extremidad anterior contralateral; 2, disminución de la resistencia al empuje lateral (y la flexión de la extremidad anterior) y sin vueltas; 3, el mismo comportamiento que el grado 2 con círculos.
   NOTA: Las ratas que muestran Bederson puntuación = 0 (sin déficit) a las 2 horas después de la embolización se excluyen de mayor estudio.

Resultados

Flujometría láser Doppler (LDF) se utilizó para controlar rCBF durante la inducción de la isquemia cerebral ^6,7. Muchos laboratorios incluyendo nuestro laboratorio han estado utilizando rCBF para identificar animales con éxito la oclusión MCA, pero los umbrales de la línea de base variaron entre los laboratorios que están relacionados con el sitio de medición. La sonda de la LDF se coloca en 2 mm posterior y 5 mm lateral a la bregma como se ha descrito previamente ^6. rCBF se monitorizó a ...

Discusión

En este estudio, hemos demostrado un método estándar para la realización de un modelo de accidente cerebrovascular embólico MCAO en la rata, en el que el origen de la MCA se ocluye por un coágulo rico en fibrina. La principal ventaja de este modelo es: la oclusión del tronco de MCA con un rico en fibrina del coágulo de sangre es similar al ictus tromboembólico en los seres humanos, el modelo de accidente cerebrovascular embólico es adecuada para realizar investigación preclínica de la terapia fibrinolítica, ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
rh-tPA	Chemical	Genentech
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Chemical	Sigma	T8877
Anesthesia vaporizer	Equipment	Soma Technology	Drager Vapor 19.1
Rechargeable high speed micro drill	Equipment	Fine Science Tools	18000-17
Curved scissors	Equipment	Fine Science Tools	14117-14
Dumont forceps (Medical #7)	Equipment	Fine Science Tools	11270-20
Dumont forceps (Medical #5)	Equipment	Fine Science Tools	11251-35
Vannas-style spring scissors	Equipment	Fine Science Tools	15000-03
Veterinary recovery chamber	Equipment	Peco Services	V1200
Genie plus syringe pump	Equipment	Kent Scientific Corporation
Rat brain matrix	Equipment	Kent Scientific Corporation	RBMA-310C
Digital caliper	Equipment	World Precision Instruments	501601
Dissecting microscope	Equipment	World Precision Instruments	PZMTIII-BS-LWD
Hamilton syringe	Equipment	Hamilton	model 710
Homeothermic blanket control unit	Equipment	Harvard Apparatus
Electric clipper	Equipment	Braintree Scientific	CLP-9931
Veterinary electrosurgical unit	Equipment	MACAN Manufacturing Company	MV-9
Blood flowmeter	Equipment	Adinstruments
PowerLab 4/30	Equipment	Adinstruments
LabChart 7.2	software	Adinstruments
1 ml syringe	Consumable	Becton, Dickinson and Company	309659
23 G needle	Consumable	Becton, Dickinson and Company	305143
30 G needle	Consumable	Becton, Dickinson and Company	305106
PE-50 tubing	Consumable	Becton, Dickinson and Company	427517
PE-10 tubing	Consumable	Becton, Dickinson and Company	427400
6-0 Silk suture	Consumable	Harvard apparatus	723287
5-0 Silk suture	Consumable	Harvard Apparatus	517607