ラットにおける同種血血栓による虚血性脳卒中のための塞栓中大脳動脈閉塞（MCAO）

要約

In this paper, we demonstrate a standard method for producing an embolic middle cerebral artery occlusion with homologous blood clots (fibrin-rich) in adult rat. This model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical study of thrombolytic therapy for ischemic stroke.

要約

組み換え組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）を用いた臨床的には、血栓溶解療法は、急性虚血性脳卒中のための最も効果的な治療のままである。しかし、tPAの使用は、その狭い治療窓によって及び出血性変化のリスクの増大によって制限されます。虚血性脳卒中の治療のための新たな血栓溶解剤や戦略を研究するための適切な脳卒中モデルを開発する緊急の必要性がある。腔内縫合MCAO塞栓MCAO：現在、虚血性脳卒中モデルの2つの主要なタイプはラットおよびマウスにおいて開発されてきた。管腔内縫合技術によってMCAOモデルが広く機構駆動のストロークの研究で使用されてきたが、これらの縫合糸モデルは、臨床状況を模倣せず、血栓溶解の研究には適していないでください。これらのモデルの中では、塞栓MCAOモデルは、密接に人間の虚血性脳卒中を模倣し、血栓溶解療法の前臨床研究に適しています。この塞栓モデルは、最初にOVによるラットで開発されましたergaard らは 1992年の^1、さらにZhang らによって特徴付け1997 ^2。塞栓MCAOがますます注目を集めているが、多くの研究室が直面する技術的な問題がある。血栓溶解研究のための増加のニーズを満たすために、MCA領域内の予測可能な梗塞体積を開発することができ、ラットにおける塞栓MCAOの再現性の高いモデルを提示する。簡単に述べると、修飾されたPE-50チューブを穏やかにMCAの起点に到達​​するカテーテルの先端まで内頸動脈（ICA）の内腔に外頸動脈（ECA）から前進する。カテーテルを介して、単一の相同血餅はMCAの起点に配置される。 MCA閉塞の成功を識別するために、局所脳血流量をモニターし、神経学的欠損および梗塞体積を測定した。本論文で示された技術は、研究者は、脳卒中の研究のためにこのモデルを確立するための技術的な問題を克服するのに役立つはずです。</ pの>

概要

脳卒中は米国における死因の第3位であるが、急性脳卒中治療の選択肢は限られて残っている。現在では、血餅を溶解する組み換え組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）の静脈内注入は、急性虚血性脳卒中のための最も効率的な療法である。しかし、tPAの使用は、その狭い治療窓によって及び脳内出血のリスクの増大によって制限されます。このため、血栓溶解研究するのに適したストロークのモデルが緊急に必要とされている。

中大脳動脈（MCA）は、ほとんどの場合、ヒトでの行程に閉塞した動脈である。この動脈を中心に、虚血性脳卒中の多くの動物モデルが確立されている。現在では、MCAを閉塞することにより齧歯類局所虚血モデルの二つの主要な種類が開発されている：縫合MCAOモデルおよび塞栓MCAOモデル。管腔内縫合技術によってMCAOモデルが広く機構駆動のストロークの研究で使用されてきたが、これらの縫合糸のモデルはない人間のストロークの最大80％が血栓症または塞栓症によって引き起こされるように、ヒトの脳卒中を模倣する。しかし、血の塊を使用して、塞栓性脳卒中モデルは、密接に人間のストロークを模倣し、血栓溶解の研究に適していると考えられる。この塞栓モデルは、最初1992年にオーバーガードら^。1によってラットにおいて開発され、さらにZhang らにより特徴付けられた1997年²およびディナポリらによって2006年^3。塞栓MCAOは、ますます注目を集めているが、直面する技術的問題がある多くの研究室による。

本稿では、MCA領域内の予測可能な梗塞を開発することができ、成体ラットにおける同種血の塊と塞栓MCAOを製造するための標準的な方法を示しています。この記事で紹介した技術は研究者が脳卒中研究のためのこのモデルを確立するための技術的な問題を克服するのに役立つはずです。

プロトコル

倫理に関する声明：オスの成体Sprague-Dawleyラット（330〜380グラムの重さ）が、このプロトコルで使用されていた。このプロトコルは、LSUの健康科学センター、シュリーブポートで施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認され、（第8版、全米科学アカデミー「実験動物の管理と使用に関する指針」に準拠している、2011た）。

変性PE-50チューブの調製

1. 徐々チューブを柔らかく、手でガス火の上に長さ30cm、PE-50チューブを握り。静かにチューブを伸ばす。
2. デジタルノギス（ 図1）を使用して、延伸管上のポイントを選択し、それをマークし、長さ1cmの先端部（外径：0.30〜0.34ミリメートル）で長さ25cmのセグメントに修正されたPE-50チューブをカット。

同種血の塊の調製

1. 70％N ₂ Oおよび30％O中のイソフルランでラット（誘導のための5％、維持2-3％）で麻酔<採血前フェイスマスクによるサブ> 2。つま先のピンチによって麻酔を確認してください。
2. 発表された方法⁴でドナーラットの大腿動脈カニュレーションを行い、20cm長のPE-50チューブに直接大腿動脈の血液を移す。血液を凝固さ、室温で2時間チューブを配置し、その後、4℃で22時間、チューブを保持している。注：ステップ3.1で説明したようにカニューレ挿入は無菌技術を用いて行われる。ドナーラットをさらにサンプリングのために回収する。
3. 50ミリメートルのセグメントに、PE-50チューブをカットし、生理食塩水を含む滅菌ペトリ皿にチューブから血餅を洗い流す。
4. 長さ60mmのPE-10チューブに50ミリメートルに長い凝血塊を移し、23Gの針を用いて、通常の生理食塩水を含有する1ミリリットルの注射器に接続された20cm長のPE-50管に、PE-10チューブの両端を接続します（ 図2） 。
5. から血液細胞を除去することができる5分間の他の1つのシリンジからの連続交互運動によって血餅をシフト血餅とフィブリンコアを破壊することなく、血管外凝固血餅の壊れやすいを最小限に抑えます。
6. 40ミリメートル長いセグメントに血餅をカットし、無菌条件下でステップ1.2で説明したように修正されたPE-50カテーテル内に血塊セグメントを転送します。注：すべてのPEチューブはエチレンオキシドで滅菌する。

3塞栓中大脳動脈閉塞（図3A、B）

1. （15分の最低121℃、15 PSI）オートクレーブにより、すべての手術器具を滅菌する。 70％エタノールを用いて、手術テーブルと関連した手術用機器を消毒。
2. ステップ2.1で説明したようにイソフルランでラットを麻酔。両後脚につま先のピンチを実行することによって、麻酔の深さをテストし、（足を引き抜く）のいずれか観察した運動は、動物が手術を行うのに十分に麻酔をかけないことを示します。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、両眼に獣医軟膏の少量を適用します。腹側首と頭の再上の毛皮を剃る皮膚領域を露出させ、電気バリカンでgions。
3. 加熱パッド上に仰臥位でラットを置きます。直腸プローブ、コントロールを挿入し、恒温ブランケット制御ユニットを使用して36.5から37.5℃の間の体温を維持する。
4. 70％エタノールに続いて、10％ポビドンヨードで剃毛した皮膚や周囲の毛を消毒。
5. 解剖顕微鏡下で首に2センチ長い正中切開を行います。手術野を露出し、右総頸動脈（CCA）、外頚動脈（ECA）、内頸動脈（ICA）、および神経および筋膜（ 図3A）の周囲から遊離翼口蓋動脈（PPA）を解剖するために使用するリトラクター。注：アシスタントが動物を準備するのに役立ちますしない場合は、手術の前に、滅菌手袋を変更してください。
6. （迷走神経を傷つけることなく）、周囲の神経から無料でCCAを解剖し、動脈の下で無菌の5-0絹縫合糸を配置します。スリップノット（＃1）を接続し、小さなHEMOSを使用して縫合糸を把握tatおよび身体に向かって教えたプル。
7. ECAとその2つの枝、後頭動脈（OA）と上甲状腺動脈（STA）を解剖。獣医電気外科ユニットを用いて二つの枝を凝固させる。 ECAの下で無菌の6-0絹縫合糸を2枚配置します。
8. 動脈の下に配置された二つのシルク、本体に向かってヘッド（先端）と他に向けて一枚を分離します。 （2＃）の頭に最も近い側に、小さな止血とシルクをつかみ、頭に向かって教えたプルタイトな合字を接続します。後で使用するために他の絹糸で緩い結び目（＃3）を準備します。
9. （迷走神経を傷つけることなく）、周囲の神経からのICAとPPAを解剖。 6-0縫合糸（＃4）PPAを接続します。 ICA（＃5）の周りに6-0縫合糸で引き結びを作る。あるいはまた、微小血管クリップを使用してICAをクリップ。
10. Vannasスタイルの春のはさみとの緊密な（＃2）ルーズ（＃3）合字間のECAに小さな穴（スルー1/2）カット。変性PE-50用浴槽を挿入CCAの分岐に切開して、事前に血液凝固を含む電子。 （＃3）だけで十分な内腔の周りに留置チューブの移動性を維持確保するために緩い結紮糸を締めます。
11. 切り株を解放し、ECAとICAの分岐下の切り株を配置するために小さな穴の部位にECAをカット。これは修正されたチューブが簡単にICAにスライドできるようになります。 ICAを開いて、静かに、カテーテルの先端がMCA（分岐から〜17ミリメートル）の原点に到達するまで、ICAにECAの内腔からチューブを進める。注：前の70％エタノールで滅菌した、ECA内管の外面をチューブの先端を挿入し、滅菌生理食塩水で洗浄した。
12. 100μlのハミルトンシリンジ（ 図3B）を使用して、10秒以上の生理食塩水を10μlと一緒に修正されたPE-50カテーテルを通して血塊を注入。
13. 5分後、ECAからカテーテルを撤回。 ECAを結ぶと、CCAを再度開く。首に切開を縫合。

4。監視局所脳血流量（rCBFの）

1. MCA閉塞の前に、頭蓋骨を露出させ、頭皮が1.2センチ正中切開を行います。歯科スクレーパーおよび滅菌綿スワップで頭蓋骨上の組織を削除します。注：手術の前に、露出した頭皮エリアと周囲の毛を70％エタノールに続いて、10％ポビドンヨードで消毒されています。
2. 2mmの後部と0.7ミリメートルの球状のステンレス製バリ（ 図4）を使用して、ブレグマから5mm横に位置して1.5ミリメートルの直径のバーホールを開けます。
   注：無傷の硬膜にしてください。
3. 0.5ミリメートル硬膜表面の上にプローブを配置します。塞栓後の0（ベースライン）、5、15、30、60、90、および120分で脳血流量を監視し、5、15、30、45、およびtPAの静脈内投与後60分で続ける。脳血流の最後の測定後、頭皮切開を縫合によって閉じられている。注：首の切開の前に私たちは、MCAのocclus前ベースラインとして脳血流を測定イオン。ポストMCA閉塞私たちは首の切開の縫合閉鎖後のrCBFを測定します。したがって、頸部切開を無菌に保たれる。

5。術後ケア

1. 脱水を防ぐ、すぐに手術や痛みの軽減のために必要に応じて、すべての6〜12時間後にBuprenex（0.05ミリグラム/ kgで、SC）を注入するために生理食塩水を皮下2.5mlの注入する。
2. イソフルラン麻酔を停止します。 37℃獣医回収室（動物を暖かく保つ）にラットを置き、観察を続ける。ラットが麻酔から回復することは一般的に10分かかります。次に、滅菌したケージに動物を入れるケージにペトリ皿にいくつ濡れる食べ物を置き、動物滅菌室にケージを返す。
3. 脳卒中後24時間は、ペントバルビタールナトリウム（100 mg / kg体重、IP）の過剰投与によりラットを安楽死させる。

6。神経学的欠損スコア

1. 塞栓後の2時間前とでBedersonスコアを実行します。グレーディングsを使用0-3のCALEは、先に説明した^5：尾によってラットを上げ、0を、床に両方の前肢を拡張し、他の障害を示さない動物（通常の移動）; 1、尾によってラットを高め、対側前肢を曲げ; 2、旋回することなく、横方向のプッシュ（および前肢の屈曲）に対する耐性を減少した。 3、旋回とグレード2と同じ動作。
   注：塞栓後の2時間後にBedersonスコア= 0（なし赤字）示さないラットは、さらなる研究から除外されます。

結果

レーザードップラーフローメトリー（LDF）は脳虚血^6,7の誘導の間脳血流量をモニターした。私たちの研究室を含む多くの研究室が成功したMCA閉塞を有する動物を識別するために、局所脳血流を使用しているが、ベースラインのしきい値は、測定部位に関連している研究室間で変化した。以前に説明したように⁶ LDFのプローブは、2mmの後部とブレグマに対して横5mmと配置されて?...

ディスカッション

本研究では、MCAの起源は、フィブリンに富む血餅により閉塞されたラットの塞栓MCAO脳卒中モデルを実行するための標準的な方法を、実証した。このモデルの主な利点は：フィブリンに富む血餅によるMCAのステムの閉塞は、ヒトにおける血栓塞栓性脳卒中に似て、塞栓性脳卒中モデルは、線溶療法の前臨床研究を行うのに適しており、このモデルが開発できることMCAによって供給された領域内...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
rh-tPA	Chemical	Genentech
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Chemical	Sigma	T8877
Anesthesia vaporizer	Equipment	Soma Technology	Drager Vapor 19.1
Rechargeable high speed micro drill	Equipment	Fine Science Tools	18000-17
Curved scissors	Equipment	Fine Science Tools	14117-14
Dumont forceps (Medical #7)	Equipment	Fine Science Tools	11270-20
Dumont forceps (Medical #5)	Equipment	Fine Science Tools	11251-35
Vannas-style spring scissors	Equipment	Fine Science Tools	15000-03
Veterinary recovery chamber	Equipment	Peco Services	V1200
Genie plus syringe pump	Equipment	Kent Scientific Corporation
Rat brain matrix	Equipment	Kent Scientific Corporation	RBMA-310C
Digital caliper	Equipment	World Precision Instruments	501601
Dissecting microscope	Equipment	World Precision Instruments	PZMTIII-BS-LWD
Hamilton syringe	Equipment	Hamilton	model 710
Homeothermic blanket control unit	Equipment	Harvard Apparatus
Electric clipper	Equipment	Braintree Scientific	CLP-9931
Veterinary electrosurgical unit	Equipment	MACAN Manufacturing Company	MV-9
Blood flowmeter	Equipment	Adinstruments
PowerLab 4/30	Equipment	Adinstruments
LabChart 7.2	software	Adinstruments
1 ml syringe	Consumable	Becton, Dickinson and Company	309659
23 G needle	Consumable	Becton, Dickinson and Company	305143
30 G needle	Consumable	Becton, Dickinson and Company	305106
PE-50 tubing	Consumable	Becton, Dickinson and Company	427517
PE-10 tubing	Consumable	Becton, Dickinson and Company	427400
6-0 Silk suture	Consumable	Harvard apparatus	723287
5-0 Silk suture	Consumable	Harvard Apparatus	517607