Embolic occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) per l'ictus ischemico con omologhi coaguli di sangue nei ratti

Riepilogo

In this paper, we demonstrate a standard method for producing an embolic middle cerebral artery occlusion with homologous blood clots (fibrin-rich) in adult rat. This model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical study of thrombolytic therapy for ischemic stroke.

Abstract

Clinicamente, la terapia trombolitica con uso di ricombinante attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) rimane il trattamento più efficace per ictus ischemico acuto. Tuttavia, l'uso di tPA è limitata dalla sua stretta finestra terapeutica e da un aumento del rischio di trasformazione emorragica. Vi è un urgente bisogno di sviluppare modelli di ictus adatti per lo studio di nuovi agenti trombolitici e strategie per il trattamento di ictus ischemico. Allo stato attuale, due tipi principali di modelli di ictus ischemico sono stati sviluppati in ratti e topi: intraluminale sutura MCAO e embolico MCAO. Sebbene i modelli MCAO tramite la tecnica di sutura intraluminale sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca ictus meccanismo-driven, questi modelli di sutura non imitano la situazione clinica e non sono adatti per gli studi trombolitici. Tra questi modelli, il modello MCAO embolico imita strettamente ictus ischemico umano ed è adatto per l'indagine preclinica della terapia trombolitica. Questo modello embolico è stato sviluppato nei ratti da Overgaard et al. ¹ del 1992 e caratterizzata da Zhang et al. nel 1997 ^2. Nonostante embolico MCAO ha acquisito sempre maggiore attenzione, ci sono problemi tecnici affrontati da molti laboratori. Per soddisfare le crescenti esigenze di ricerca trombolitica, vi presentiamo un modello altamente riproducibile di embolica MCAO nel ratto, che può sviluppare un volume di infarto prevedibile all'interno del territorio MCA. In breve, una modifica PE-50 tubo è leggermente avanzata dalla carotide esterna (ECA) nel lume della carotide interna (ICA) finché la punta del catetere raggiunge l'origine del MCA. Tramite il catetere, un singolo omologa coagulo di sangue è posto all'origine della MCA. Per identificare il successo di MCA occlusione, flusso ematico cerebrale regionale è stata monitorata, deficit neurologici e volumi di infarto sono stati misurati. Le tecniche presentate in questo documento dovrebbero aiutare gli investigatori a superare i problemi tecnici per la creazione di questo modello per la ricerca ictus. </ P>

Introduzione

L'ictus è la terza causa di morte negli Stati Uniti, ma le opzioni di trattamento per l'ictus acuto rimane limitata. Allo stato attuale, l'infusione endovenosa di ricombinante attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) per dissolvere i coaguli di sangue è la terapia più efficace per ictus ischemico acuto. Tuttavia, l'uso di tPA è limitata dalla sua stretta finestra terapeutica e da un aumento del rischio di emorragia intracerebrale. Pertanto, è urgente un modello di ictus adatto per la ricerca trombolitica.

L'arteria cerebrale media (MCA) è l'arteria più spesso occluso in ictus negli esseri umani. Incentrato su questa arteria, sono stati stabiliti numerosi modelli animali di ictus ischemico. Allo stato attuale, sono state sviluppate due principali tipi di roditori focale modelli di ischemia da occlusione MCA: sutura modello MCAO e embolico MCAO modello. Sebbene i modelli MCAO tramite la tecnica di sutura intraluminale sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca ictus meccanismo-driven, questi modelli di sutura non lo fannoictus umana imitare, come fino al 80% degli ictus umani sono causati da trombosi o embolia. Tuttavia, il modello ictus embolico con coaguli di sangue imita strettamente corsa umana ed è considerato adatto per lo studio trombolitica. Questo modello embolico è stato sviluppato nel ratto da Overgaard et al. ¹ del 1992 e caratterizzata da Zhang et al. Nel 1997 ² e Dinapoli et al. Nel 2006 ^3. Nonostante embolico MCAO ha acquisito sempre maggiore attenzione, ci sono problemi tecnici affrontati da molti laboratori.

In questo articolo, si dimostra un metodo standard per la produzione di embolico MCAO con omologhi coaguli di sangue nel ratto adulto, che possono sviluppare un infarto prevedibile all'interno del territorio MCA. Le tecniche presentate in questo articolo dovrebbero aiutare gli investigatori a superare i problemi tecnici per la creazione di questo modello per la ricerca ictus.

Protocollo

Dichiarazione Etica: Maschio adulto Sprague-Dawley (del peso di 330-380 g) sono stati utilizzati in questo protocollo. Questo protocollo è stato approvato dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) presso la LSU Health Science Center-Shreveport ed è in conformità con la 'Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio "(ottava edizione, Accademia Nazionale delle Scienze 2011 ).

1 Preparazione di Modified tubo PE-50

1. Tenere un 30 centimetri lungo tubo PE-50 sopra un fuoco di gas da mani, gradualmente ammorbidire il tubo. Allungare delicatamente il tubo.
2. Selezionare un punto sul tubo allungato con un calibro digitale (Figura 1), segnarlo, e tagliare il modificato PE-50 tubo in un segmento lungo 25 centimetri con una lunga punta di 1 cm (diametro esterno: ,30-,34 mm).

2 Preparazione di omologhi coaguli di sangue

1. Anestetizzare ratto con isoflurano (5% per l'induzione, 2-3% per la manutenzione), nel 70% N ₂ O e il 30% O _{2 da una maschera viso prima della raccolta del sangue. Confermare l'anestesia da un pizzico punta.}
2. Eseguire incannulamento arterioso femorale di un topo donatore con metodo pubblicato ⁴ e trasferire il sangue dell'arteria femorale direttamente in un 20 cm di lunghezza PE-50 tubo. Porre la provetta per 2 ore a temperatura ambiente per coagulo di sangue, e quindi mantenere la provetta per 22 ore a 4 ° C. Nota: Cannulazione viene eseguita utilizzando una tecnica asettica come descritto al punto 3.1. Il ratto donatore viene recuperato per ulteriori campionamenti.
3. Tagliare il tubo PE-50 in 50 segmenti mm e scovare il coagulo dal tubo in una piastra di Petri sterile contenente soluzione fisiologica.
4. Trasferire 50 mm di lunghezza coagulo in una lunghezza di 60 mm Tubo PE-10 e collegare ciascuna estremità del tubo in PE-10 ad un 20 cm PE-50 tubo collegato alla siringa da 1 ml contenente soluzione fisiologica con 23 ago G (figura 2) .
5. Spostare il coagulo dal movimento alternato continuo da una siringa all'altra per 5 minuti, che può rimuovere le cellule del sangue dail coagulo e ridurre al minimo la fragile extravascolare coagulo coagulato, senza interrompere il nucleo fibrina.
6. Tagliare il coagulo in un segmento lungo 40 mm e trasferire il coagulo in un segmento modificato PE-50 catetere come descritto al punto 1.2 in condizioni asettiche. Nota: Tutti i tubi in PE è sterilizzato con ossido di etilene.

3. Embolic occlusione dell'arteria cerebrale media (Figura 3A, B)

1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici da autoclave (minimo 121 ° C, 15 PSI, per 15 min). Sterilizzare il tavolo operatorio e attrezzature chirurgiche associate con il 70% di etanolo.
2. Anestetizzare il ratto con isoflurano come descritto al punto 2.1. Verificare la profondità dell'anestesia eseguendo un pizzico punta su entrambi i piedi posteriori, e qualsiasi movimento osservato (il ritiro della zampa) indica che l'animale non è sufficientemente anestetizzato a fare un intervento chirurgico. Applicare una piccola quantità di vet unguento su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Accorciare il pelo sul collo e la testa ventrale riregioni con tagliatori elettrici per esporre le zone della pelle.
3. Posizionare il ratto in posizione supina su una piastra elettrica. Inserire una sonda rettale, il controllo e mantenere la temperatura corporea tra i 36,5-37,5 ° C utilizzando una centralina coperta omeotermi.
4. Disinfettare la pelle e la pelliccia rasata circostante con il 10% povidone-iodio seguito da etanolo al 70%.
5. Fare un 2-cm-lunga incisione mediana sul collo sotto un microscopio da dissezione. Utilizzare divaricatori per esporre il campo operatorio e sezionare il diritto arteria carotide comune (CCA), carotide esterna (ECA), carotide interna (ICA), e pterigopalatino arteria (PPA) esente da nervi circostanti e fascia (Figura 3A). Nota: Prima di un intervento chirurgico, cambiare i guanti sterili se non assistente aiuta a preparare l'animale.
6. Sezionare il CCA libera dai nervi circostanti (senza danneggiare il nervo vagale) e posizionare una sterile sutura 5-0 seta sotto l'arteria. Legare un nodo scorsoio (# 1) e afferrare la sutura con un piccolo hemostat e tirare insegnato verso il corpo.
7. Sezionare la Corte dei conti e dei suoi due rami, l'arteria occipitale (OA) e l'arteria tiroidea superiore (STA). Coagulare due rami con un elettrobisturi veterinario. Mettere due pezzi di sterili 6-0 punti di sutura in seta sotto l'ECA.
8. Separate le due sete posti sotto l'arteria, un pezzo verso la testa (estremità distale) e l'altro verso il corpo. Legare una legatura stretta (# 2) sul lato più vicino alla testa, afferrare la seta con piccole hemostats e tirare insegnato verso la testa. Preparare un nodo sciolto (# 3) con l'altra seta da utilizzare in seguito.
9. Sezionare l'ICA e PPA dai nervi circostanti (senza danneggiare il nervo vagale). Legare il PPA con un 6-0 sutura (# 4). Fare un nodo scorsoio con 6-0 sutura intorno alla ICA (# 5). In alternativa, ritagliare la ICA utilizzando una clip microvascolare.
10. Tagliare un piccolo foro (mezzo attraverso) nella ECA tra la stretta (2 #) e sciolti (# 3) le legature con stile Vannas forbici a molla. Inserire il modificato 50 PE-vascae contenente coagulo di sangue nella incisione e passare alla biforcazione del CCA. Stringere la legatura allentata (# 3) intorno il lume appena sufficienti per garantire preservare la mobilità del tubo in-abitazione.
11. Tagliare la Corte dei conti presso il sito del piccolo foro per liberare il moncone e posizionare il moncone sotto la biforcazione della Corte dei conti e ICA; questo permetterà il tubo modificato facilmente scivolare nella ICA. Aprire la ICA e far avanzare delicatamente il tubo dal lume della Corte dei conti nella ICA fino a che la punta del catetere raggiunge l'origine del MCA (~ 17 millimetri dalla biforcazione). Nota: Prima di inserire la punta del tubo nel ECA, sterile la superficie esterna del tubo con il 70% di etanolo, e poi lavare con soluzione fisiologica sterile.
12. Iniettare il coagulo attraverso la modifica PE-50 catetere con 10 ml di soluzione salina oltre 10 secondi utilizzando una siringa Hamilton 100 microlitri (Figura 3B).
13. Ritirare il catetere dalla Corte dei conti 5 minuti più tardi. Legare la Corte dei conti e riaprire CCA. Suturare la incisione sul collo.

4 Monitoraggio Regionale Cerebral Blood Flow (rCBF)

1. Prima di MCA occlusione, fare un lungo 1,2 centimetri incisione mediana nel cuoio capelluto per esporre l'osso del cranio. Rimuovere i tessuti con l'osso del cranio con un raschietto dentale e swap di cotone sterili. Nota: Prima di un intervento chirurgico, la zona del cuoio capelluto esposto e pellicce circostante vengono disinfettati con il 10% povidone-iodio seguito da etanolo al 70%.
2. Eseguire un foro di diametro 1,5 millimetri bava situata a 2 mm posteriormente e 5 mm lateralmente al bregma utilizzando una bava sferica in acciaio inox 0,7 millimetri (Figura 4).
   NOTA: Mantenere la dura intatta.
3. Posizionare la sonda 0,5 millimetri sopra la superficie dura. Monitorare il rCBF a 0 (baseline), 5, 15, 30, 60, 90 e 120 minuti dopo l'embolizzazione e continuare in 5, 15, 30, 45, e 60 minuti dopo la somministrazione endovenosa di tPA. Dopo l'ultima misura di rCBF, l'incisione cuoio capelluto è chiusa da sutura. Nota: Prima di collo incisione misuriamo rCBF come linea di base prima MCA Occlusione. Messaggio MCA occlusione misuriamo rCBF dopo la chiusura di sutura al collo incisione. Così, l'incisione collo è mantenuta sterile.

Cura 5. post-operatorio

1. Iniettare 2,5 ml di soluzione salina per via sottocutanea per prevenire la disidratazione e iniettare Buprenex (0,05 mg / kg, SC) subito dopo l'intervento chirurgico e ogni 6-12 ore, se necessario per alleviare il dolore.
2. Smettere di anestesia isoflurano. Posizionare il ratto in un 37 ° C camera di recupero veterinario (tenere caldo animale) e continuare l'osservazione. Di solito, occorrono 10 minuti per il ratto per recuperare da anestesia. Poi, mettere l'animale in una gabbia sterilizzato, mettere un po 'di cibo bagnato in una capsula di Petri nella gabbia, e restituire la gabbia per camera di sterilizzazione degli animali.
3. 24 ore dopo l'ictus, eutanasia il ratto con una dose eccessiva di sodio pentobarbital (100 mg / kg di peso corporeo, IP).

6 Deficit neurologico Score

1. Eseguire il punteggio Bederson prima e durante 2 ore dopo l'embolizzazione. Utilizzare una classificazione scale di 0-3 come descritto in precedenza ^5: 0, alzando il topo dalla coda, l'animale che si estende entrambe le zampe anteriori a terra e non presentano alcun altri deficit (movimento normale); 1, alzando il topo da coda, flettere la zampa anteriore controlaterale; 2, diminuita resistenza alla spinta laterale (arti anteriori e flessione), senza circuitazione; 3, lo stesso comportamento di grado 2 con circuitazione.
   NOTA: I ratti che mostrano Bederson punteggio = 0 (nessun deficit) a 2 ore dopo l'embolizzazione sono esclusi da ulteriori studi.

Risultati

Laser Doppler (LDF) è stato utilizzato per monitorare rCBF durante l'induzione di ischemia cerebrale ^6,7. Molti laboratori tra cui il nostro laboratorio hanno utilizzato rCBF per identificare gli animali con successo occlusione MCA, ma le soglie di riferimento variavano tra i laboratori che sono collegati al sito di misurazione. La sonda della LDF è posizionato alle 2 mm posteriormente a 5 mm lateralmente al bregma, come descritto in precedenza ^6. rCBF stata monitorata a 0, 5, 15, 30, 60, 90 ...

Discussione

In questo studio, abbiamo dimostrato un metodo standard per l'esecuzione di un modello di ictus embolico MCAO nel ratto, in cui l'origine del MCA è occlusa da un coagulo di fibrina ricco. Il principale vantaggio di questo modello è: l'occlusione del gambo di MCA con un ricco di fibrina coagulo di sangue è simile a tromboembolica ictus negli esseri umani, il modello di ictus embolico è adatto per l'esecuzione di indagini precliniche di terapia fibrinolitica, e che questo modello può sviluppare un vol...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
rh-tPA	Chemical	Genentech
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Chemical	Sigma	T8877
Anesthesia vaporizer	Equipment	Soma Technology	Drager Vapor 19.1
Rechargeable high speed micro drill	Equipment	Fine Science Tools	18000-17
Curved scissors	Equipment	Fine Science Tools	14117-14
Dumont forceps (Medical #7)	Equipment	Fine Science Tools	11270-20
Dumont forceps (Medical #5)	Equipment	Fine Science Tools	11251-35
Vannas-style spring scissors	Equipment	Fine Science Tools	15000-03
Veterinary recovery chamber	Equipment	Peco Services	V1200
Genie plus syringe pump	Equipment	Kent Scientific Corporation
Rat brain matrix	Equipment	Kent Scientific Corporation	RBMA-310C
Digital caliper	Equipment	World Precision Instruments	501601
Dissecting microscope	Equipment	World Precision Instruments	PZMTIII-BS-LWD
Hamilton syringe	Equipment	Hamilton	model 710
Homeothermic blanket control unit	Equipment	Harvard Apparatus
Electric clipper	Equipment	Braintree Scientific	CLP-9931
Veterinary electrosurgical unit	Equipment	MACAN Manufacturing Company	MV-9
Blood flowmeter	Equipment	Adinstruments
PowerLab 4/30	Equipment	Adinstruments
LabChart 7.2	software	Adinstruments
1 ml syringe	Consumable	Becton, Dickinson and Company	309659
23 G needle	Consumable	Becton, Dickinson and Company	305143
30 G needle	Consumable	Becton, Dickinson and Company	305106
PE-50 tubing	Consumable	Becton, Dickinson and Company	427517
PE-10 tubing	Consumable	Becton, Dickinson and Company	427400
6-0 Silk suture	Consumable	Harvard apparatus	723287
5-0 Silk suture	Consumable	Harvard Apparatus	517607