Sıçanlar Homolog Kan pıhtısı ile İskemik İnme emboli Orta Serebral Arter Tıkanıklığı (MCAO)

Özet

In this paper, we demonstrate a standard method for producing an embolic middle cerebral artery occlusion with homologous blood clots (fibrin-rich) in adult rat. This model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical study of thrombolytic therapy for ischemic stroke.

Özet

Rekombinant doku plazminojen aktivatörü (tPA) kullanımı ile Klinik, trombolitik tedavi akut iskemik inme için en etkili tedavi yöntemidir. Bununla birlikte, tPA ve kullanımı bu yakın tedavi açısı ile ve hemorajik transformasyon riski ile sınırlıdır. Iskemik inme tedavisi için yeni trombolitik ajanlar ve stratejiler incelemek için uygun inme modeller geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır. Intraluminal sütür MCAO'dan ve embolik MCAO'dan: Şu anda, iskemik inme modelleri başlıca iki türü sıçanlar ve farelerde geliştirilmiştir. Intraluminal sütür tekniği ile MCAO modeller yaygın mekanizması odaklı inme araştırmalarında kullanılan rağmen, bu sütür modelleri klinik durumu taklit değil ve trombolitik çalışmalar için uygun değillerdir. Bu modeller arasında, emboli MCAO modeli yakından insan iskemik inme taklit ve trombolitik tedavinin klinik öncesi araştırma için uygundur. Bu emboli modelin ilk Ov tarafından sıçanlarda geliştirilen1992 yılında diğ. ¹ ergaard ve ayrıca Zhang ve arkadaşları tarafından karakterize edilir. 1997 ^2'de. embolik MCAO artan ilgi kazanmış olmasına rağmen, çok sayıda laboratuarlar tarafından karşılaşılan sorunlar vardır. Trombolitik araştırma için artan ihtiyaçlarını karşılamak için, biz MCA topraklarında öngörülebilir bir enfarktüs hacmini geliştirmek sıçan, embolik MCAO'dan son derece tekrarlanabilir model sunuyoruz. Kısaca, bir tadil edilmiş 50-PE tüp hafifçe MCA kökenini ulaşır kateterin ucuna kadar iç karotid arterin (ICA) lümenine dış karotid arter (ECA) ilerletilir. Kateter sayesinde, tek bir homolog kan pıhtısı MCA kökeni yerleştirilir. MCA tıkanıklığının başarısını belirlemek için, bölgesel serebral kan akımı izlendi, nörolojik açıkları ve enfarktüs hacimleri ölçüldü. Bu çalışmada sunulan teknikler inme araştırma için bu modeli kurulması için teknik sorunların üstesinden gelmek için araştırmacılara yardımcı olmalıdır. </ P>

Giriş

İnme ABD'de ölüm üçüncü önde gelen nedenidir, ancak akut inme için tedavi seçenekleri sınırlı kalmıştır. Şu anda, kan pıhtıları çözmek için yeniden birleştirici doku plazminojen aktivatörü (tPA) intravenöz infüzyon akut iskemik inmenin en etkili yöntemdir. Bununla birlikte, tPA ve kullanımı bu yakın tedavi açısı ile ve intraserebral kanama riski ile sınırlıdır. Bu nedenle, trombolitik araştırma için uygun inme bir modeli acilen ihtiyaç vardır.

Orta serebral arter (OSA) en sık insanlarda inme tıkalı arter olduğunu. Bu arter üzerinde duruldu, iskemik inme birçok hayvan modelleri kurulmuştur. Şu anda, MCA tıkanarak kemirgen fokal iskemi modelleri başlıca iki tip geliştirilmiştir: sütür MCAO modeli ve embolik MCAO modeli. Intraluminal sütür tekniği ile MCAO modeller yaygın mekanizması odaklı inme araştırmalarında kullanılan olmasına rağmen, bu dikiş modelleri yokİnsan strok% 80'ine kadar olan mimik insan felç, tromboz veya embolizmden kaynaklanır. Ancak, kan pıhtıları kullanarak embolik inme modeli yakından insan inme taklit ve trombolitik çalışma için uygun kabul edilir. Bu model, embolik ilk olarak 1992 yılında Overgaard ve ark. ¹ ile sıçanlarda geliştirilmiş ve Zhang ve arkadaşları tarafından karakterize edildi. 1997 ² ve Dinapoli ve ark. 2006 ^3'te. Embolik MCAO artan bir ilgi kaynağı haline gelmiş olmasına rağmen, karşılaşılan sorunlar vardır, birçok laboratuvar.

Bu yazıda, MCA topraklarında öngörülebilir bir enfarktüs gelişebilir yetişkin sıçan homolog kan pıhtısı ile embolik MCAO'dan üretilmesi için standart bir yöntem ortaya koymaktadır. Bu makalede sunulan teknikler Araştırmacılar felç araştırma için bu modeli kurulması için teknik sorunların üstesinden gelmek için yardımcı olmalıdır.

Protokol

Etik Beyanı: (330-380 g ağırlığında) Sprague-Dawley sıçanları bu protokolde kullanılmıştır. Bu protokol LSU Sağlık Bilimleri Merkezi-Shreveport Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve (sekizinci baskı, Ulusal Bilimler Akademisi, 2011 'Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı için Kılavuz' ile uyumlu olduğunu edildi ).

Modifiye PE-50 Tube 1. Hazırlık

1. Yavaş yavaş tüp yumuşatmak, El bir gaz ateş üzerinde bir 30 cm uzunluğunda PE-50 tüpü tutmak. Yavaşça tüp germek.
2. Bir dijital kumpas (Şekil 1) kullanarak gerilmiş tüp üzerinde bir nokta seçin, işaretlemek ve (dış çapı: 0,30-0,34 mm) 1 cm uzunluğunda ucu 25 cm uzunluğunda segmentine modifiye PE-50 tüp kesti.

Homolog kan pıhtılaşması 2. Hazırlık

1. % 70, N ₂ O ve% 30 Ç izofluran (indüksiyon için 5%, bakım için 2-3%) olan sıçan anestezisi 2. Bir ayak tutam tarafından anestezi onaylayın.
2. Yayımlanmış yöntemle ⁴ ile bir donör sıçan femoral arter kateterizasyonu gerçekleştirin ve 20 cm uzunluğunda PE-50 tüp içine doğrudan femoral arter kan aktarın. Pıhtı kan, oda sıcaklığında 2 saat boyunca Tüp, ve daha sonra 4 ° C'de 22 saat boyunca muhafaza tüpü. Not: sokulmuş adım 3.1 de tarif edildiği gibi, aseptik teknikle gerçekleştirilir. Donör sıçan başka numuneler için elde edilir.
3. 50 mm'lik parçalar halinde PE-50 tüpü kesip, normal tuz içeren steril bir Petri kabı içine tüpten pıhtı dışarı floş.
4. 60 mm uzunluğunda PE-10 tüpü içine 50 mm uzunluğunda bir pıhtı aktarın ve 23 G iğne ile, normal tuzlu su ihtiva eden 1 ml şırınga bağlı olan bir 20 cm uzunluğunda PE-50 tüpü için PE-10 tüp her biri ucunu (Şekil 2) .
5. Kan hücreleri çıkarmak için, hangi 5 dakika boyunca diğer bir şırınga sürekli alternatif hareket ile pıhtı Shiftpıhtı ve fibrin çekirdek bozmadan, ekstravasküler pıhtılaşmış pıhtı kırılgan en aza indirmek.
6. 40 mm uzunluğunda segmentine pıhtı kesin ve aseptik koşullar altında adım 1.2 de tarif edildiği gibi bir tadil edilmiş 50-PE kateter yoluyla pıhtı segmentini aktarın. Not: Tüm PE boru etilen oksit ile sterilize edilir.

3. Embolizan Orta Serebral Arter Tıkanıklığı (Şekil 3A, B)

1. (En az 121 ° C, 15 dakika boyunca 15 PSI) otoklav ile tüm cerrahi aletleri sterilize. % 70 etanol kullanılarak ameliyat masası ve ilişkili cerrahi ekipmanı sterilize.
2. Adım 2.1 açıklandığı gibi izofluran ile sıçan anestezisi. Her iki arka ayakları üzerinde bir ayak tutam yaparak anestezi derinliği test ve (pençe çekilmesi) gözlenen herhangi bir hareketi hayvan ameliyatı yapmak için yeterli anestezi olmadığını gösterir. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için her iki göze de veteriner merhem küçük bir miktar uygulayın. Ventral boyun ve baş re kürk Tıraşelektrik kesme makineleri ile bölgelerini cilt alanları ortaya çıkarmak için.
3. Bir ısıtma yastığı yatar pozisyonda sıçan yerleştirin. Bir rektal prob, kontrolü yerleştirin ve bir homotermik battaniye kontrol ünitesi kullanılarak 36.5-37.5 ° C arasında vücut ısısını korumak.
4. % 70 etanol ile takip% 10 povidon-iyot ile traş cildi ve çevresindeki kürk dezenfekte edin.
5. Bir mikroskop altında boyun üzerinde 2 cm uzunluğunda orta hat kesi olun. Cerrahi alanında ortaya çıkarmak ve sağ karotis arter (CCA), eksternal karotid arter (ECA), internal karotid arter (ICA) ve pterigopalatin arter (KİK) çevresindeki sinirler ve fasya (Şekil 3A) ücretsiz teşrih Ekartörleri kullanın. Not: hiçbir Yardımcısı hayvan hazırlamak için yardımcı olur Ameliyattan önce, steril eldiven değiştirmek.
6. (Vagus siniri zarar vermeden) çevreleyen sinirler CCA serbest incelemek ve arterin altında steril 5-0 ipek sütür koyun. Bir kayma düğüm (# 1) kravat ve küçük HEMOS kullanarak dikiş kavramaktat ve vücuda bakan tarafta öğretilen çekin.
7. ECA ve onun iki şubesi, oksipital arter (OA) ve superior tiroid arter (STA) ayır. Bir veteriner elektrocerrahi ünitesi kullanılarak iki şubesi coagulate. ECA altında steril 6-0 ipek dikişlerle iki adet yerleştirin.
8. Arter, kafasına doğru tek parça (uzak ucu) ve vücuda dönük alt alta yerleştirilmiş iki ipek ayırın. (2 #) başlığına en yakın olan tarafında, küçük bir hemostat olan ipek kavrama ve çekme kafasına doğru öğretilen sıkı bitişik harfleri bağla. Daha sonra kullanmak için başka ipek ile gevşek bir düğüm (# 3) hazırlayın.
9. (Vagus siniri zarar vermeden) çevreleyen sinirler ICA ve PPA parçalara ayır. 6-0 sütür (# 4) ile PPA kravat. ICA (# 5) etrafında 6-0 sütür ile bir kayma düğüm yapın. Alternatif olarak, bir mikrovasküler klibi kullanarak ICA klibi.
10. Bir Vannas tarzı yaylı makas ile sıkı (# 2) ve gevşek (# 3) ligatures arasındaki ECA içine küçük bir delik (sokmak 1/2) kesin. Modifiye PE-50 küvet yerleştirinCCA çatallanma kesi ve önceden içine kan pıhtısı içeren e. (3 #) yeterli lümen etrafında içinde yaşayan tüp hareketliliğini korumak sağlamak için gevşek ligatürün sıkın.
11. Güdük özgür ve ECA ve ICA çatallanma altında güdük konumlandırmak için küçük deliğin yerinde ECA kesti; Bu modifiye tüp kolayca ICA slayt sağlayacaktır. ICA açın ve kateterin ucu MCA kökenini ulaşıncaya kadar yavaşça (~ 17 mm bifurkasyondan) ICA ECA'nın lümeninden tüp önceden. Not: Önce ECA,% 70 etanol ile borunun steril dış yüzeyi borunun ucu yerleştirin ve daha sonra steril fizyolojik tuzlu su ile yıkayın.
12. 100 ul Hamilton şırıngası (Şekil 3B) ile 10 saniye boyunca 10 ul tuzlu su ile birlikte modifiye edilmiş PE-50 kateterden pıhtı enjekte edilir.
13. 5 dakika sonra ECA kateteri. ECA kravat ve CCA açın. Boyun kesi dikin.

4. İzleme Bölgesel Beyin Kan Akışı (bBKA)

1. Önceki MCA oklüzyon, kafatası kemiği ortaya çıkarmak için kafa derisi 1.2 cm uzunluğunda orta hat kesi yapmak. Bir diş kazıyıcı ve steril pamuk swapları ile kafatası kemik üzerinde dokuları çıkartın. Not: Ameliyattan önce, maruz kafa derisi alanı ve çevresindeki kürk% 70 etanol ile takip% 10 povidon-iyot ile dezenfekte edilir.
2. 2 mm posterior ve 0.7 mm'lik bir küresel paslanmaz çelik çapak (Şekil 4) kullanılarak 5 mm bregma yanal yerleştirilmiş bir 1,5 mm çapında bir çapak delik delin.
   NOT: sağlam dura tutun.
3. Prob dura yüzeyinden 0.5 mm yerleştirin. 0 (taban çizgisi) en kan akımında, 5, 15, 30, 60, 90 Monitör, emboli ve sonra 120 dakika devam 5, 15, 30, 45, ve tPA intravenöz uygulanmasından sonra 60 dk. RCBF'nin son ölçümden sonra, kafa derisi kesi dikiş ile kapatılır. Not: boyun kesi öncesinde biz MCA occlus önce taban olarak kan akımında ölçümiyonu temsil etmektedir. Mesaj MCA tıkanıklığı biz boyun kesi dikiş kapatılmasından sonra kan akımında ölçmek. Böylece boyun kesi steril tutulur.

5. Post-operatif Bakım

1. Su kaybını önlemek ve hemen cerrahi ve ağrının giderilmesi için gerektiği kadar 6-12 saat sonra Buprenex (0,05 mg / kg, sc) enjekte etmek için salin solüsyonu, deri altında, 2.5 ml enjekte edilir.
2. Izofluran anestezi durdurun. 37 ° C veteriner kurtarma odasında sıçan yerleştirin (hayvan sıcak tutmak) ve gözlem tutmak. Sıçan anestezi kurtarmak için genellikle 10 dakika sürer. Ardından, steril bir kafes içine hayvan koymak kafes içinde bir Petri kabındaki bazı ıslatılmış yemek yerleştirmek, ve hayvan sterilizasyon odasına kafesi dönmek.
3. Inme sonrası 24 saat, sodyum pentobarbital (100 mg / kg vücut ağırlığı, IP) aşırı dozda sıçan euthanize.

6. Nörolojik Eksikliği Puan

1. Öncesi ve embolizasyon sonrası 2 saatte Bederson skoru gerçekleştirin. Bir sınıflandırma kullanabilirsiniz s0-3 cale olarak daha önce ⁵ açıklandığı: kuyruk sıçan yükselterek, 0, zemine hem ön ayakları uzanan ve başka hiçbir açıkları sergileyen hayvan (normal hareket); 1, kuyruk tarafından sıçan yükselterek, kontralateral ön ayakları esnetin; 2, çizerek olmadan yanal itme (ve ön ayakları fleksiyon) karşı dirençte azalma; 3, çizerek ile grade 2 aynı davranış.
   NOT: embolizasyondan sonra 2 saatte Bederson skoru = 0 (yok açığını) gösteren Sıçanlar daha fazla çalışma dışında tutulmuştur.

Sonuçlar

Lazerli Doppler flowmetri (LDF), serebral iskemi ^6,7 indüksiyonu sırasında kan akımında izlemek için kullanıldı. Bizim laboratuvar dahil pek çok laboratuar başarılı MCA tıkanıklığı olan hayvanları tanımlamak için kan akımında kullanarak edilmiştir, ancak bazal eşikleri ölçüm site ile ilgili laboratuarlar arasında değişiyordu. LDF bir prob 2 mm'lik posterior konumlandırılmış ve daha önce ⁶ açıklandığı gibi 5 mm'lik bregma lateral. CBF, 0 ° C'de iz...

Tartışmalar

Bu çalışmada, MCA kökeni, bir fibrin pıhtısı zengin tarafından kapatılan edildiği sıçan, bir embolik MCAO felç modelinde gerçekleştirmek için standart bir yöntem gösterilmiştir. Bu modelin en büyük avantajı ise: fibrin-zengin kan pıhtısı ile MCA kök tıkanıklığı insanlarda tromboembolik inme benzer, embolik inme modeli fibrinolitik tedavinin klinik öncesi soruşturma yapılması için uygundur, ve bu model geliştirmek olduğunu MCA tarafından sağlanan topraklarında bir tekrarlanabilir ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
rh-tPA	Chemical	Genentech
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Chemical	Sigma	T8877
Anesthesia vaporizer	Equipment	Soma Technology	Drager Vapor 19.1
Rechargeable high speed micro drill	Equipment	Fine Science Tools	18000-17
Curved scissors	Equipment	Fine Science Tools	14117-14
Dumont forceps (Medical #7)	Equipment	Fine Science Tools	11270-20
Dumont forceps (Medical #5)	Equipment	Fine Science Tools	11251-35
Vannas-style spring scissors	Equipment	Fine Science Tools	15000-03
Veterinary recovery chamber	Equipment	Peco Services	V1200
Genie plus syringe pump	Equipment	Kent Scientific Corporation
Rat brain matrix	Equipment	Kent Scientific Corporation	RBMA-310C
Digital caliper	Equipment	World Precision Instruments	501601
Dissecting microscope	Equipment	World Precision Instruments	PZMTIII-BS-LWD
Hamilton syringe	Equipment	Hamilton	model 710
Homeothermic blanket control unit	Equipment	Harvard Apparatus
Electric clipper	Equipment	Braintree Scientific	CLP-9931
Veterinary electrosurgical unit	Equipment	MACAN Manufacturing Company	MV-9
Blood flowmeter	Equipment	Adinstruments
PowerLab 4/30	Equipment	Adinstruments
LabChart 7.2	software	Adinstruments
1 ml syringe	Consumable	Becton, Dickinson and Company	309659
23 G needle	Consumable	Becton, Dickinson and Company	305143
30 G needle	Consumable	Becton, Dickinson and Company	305106
PE-50 tubing	Consumable	Becton, Dickinson and Company	427517
PE-10 tubing	Consumable	Becton, Dickinson and Company	427400
6-0 Silk suture	Consumable	Harvard apparatus	723287
5-0 Silk suture	Consumable	Harvard Apparatus	517607