栓塞性脑梗塞（缺血）的大鼠缺血性中风与血同源凝块

摘要

In this paper, we demonstrate a standard method for producing an embolic middle cerebral artery occlusion with homologous blood clots (fibrin-rich) in adult rat. This model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical study of thrombolytic therapy for ischemic stroke.

摘要

在临床上，溶栓治疗用重组组织型纤溶酶原激活剂（tPA）的仍然是最有效的治疗急性缺血性中风。然而，tPA的使用是由它的治疗窗狭窄和出血性转化的危险性增加的限制。目前迫切需要开发适合中风模型来研究新的溶栓药物和战略进行治疗缺血性中风的。目前，缺血性脑卒中模型两大类，已经开发了大鼠和小鼠:线栓缺血及栓塞缺血。虽然经由所述管腔内缝合技术MCAO模型已被广泛地应用于机械驱动冲程的研究，这些缝合模型不模仿临床情况，因此并不适合用于血栓溶解研究。在这些模型中，栓塞MCAO模型密切模仿人的缺血性中风和适合溶栓治疗的临床前研究。大鼠OV最早开发此栓塞模型ergaard 等^。1于1992年，其特征在于:张某等人于1997年²虽然栓塞缺血已经获得了越来越多的关注，也有面临许多实验室的技术问题。为了满足溶栓的研究日益增加的需求，我们提出栓塞缺血的高度重复性的模型大鼠，可开发马华境内可预见的梗死体积。简言之，改性PE-50管轻轻地从颈外动脉（ECA）被推进到颈内动脉（ICA），直至导管尖端的内腔到达MCA的来源。通过导管，单个同源血液凝块被放置在MCA的来源。为了找出大脑中动脉闭塞的成功，局部脑血流监测，神经功能缺损及梗死体积进行了测量。本文提出的技术将有助于研究人员克服了建立这一模式中风研究技术问题。</ P>

引言

中风是死亡，在美国的第三大原因，但对于急性中风的治疗选择仍然有限。目前，静脉内输注重组组织型纤溶酶原激活物（tPA）的溶解血块是最有效的治疗急性缺血性中风。然而，tPA的使用是由它的治疗窗狭窄和脑出血的危险性增加的限制。因此，迫切需要行程适合溶栓研究的典范。

大脑中动脉（MCA）是最常见的吸留在中风在人类的动脉。集中在这个动脉缺血性中风的许多动物模型已经建立。目前，已开发的啮齿动物脑缺血模型通过阻断马华两大类:缝合缺血模型和栓塞性脑缺血模型。虽然经由所述管腔内缝合技术MCAO模型已被广泛地应用于机械驱动冲程的研究，这些缝合模式不模仿人的行程，因为高达80％的人的中风是由血栓或栓塞所引起的。但是，使用血栓栓塞性中风模型密切模仿人类的​​行程，被认为适合溶栓研究。大鼠被首先开发这栓塞模型Overgaard 等^。1于1992年，其特征在于:张某等人在1997年第²和Dinapoli 等人于2006年³虽然栓塞缺血已经获得了越来越多的关注，也有面临技术难题许多实验室。

在本文中，我们展示了用于生产栓塞缺血与同源血块在成年大鼠，可开发马华境内可预测心肌梗死的标准方法。在这篇文章中介绍的技术将有助于研究人员克服技术难题，为建立这个模型中风的研究。

研究方案

道德声明:成年雄性SD大鼠（体重330-380克），在此协议中使用。该协议被批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）在路易斯安那州立大学健康科学中心 - 什里夫波特，是符合"指南的护理和使用实验动物"（第八版，国家科学院，2011 ）。

1，制备改性PE-50管

1. 保持30厘米长的PE-50管上方的气体火手，渐渐软化管。轻轻拉伸管。
2. 选择使用数字卡尺（ 图1）拉伸管的一个点，它标记，并削减了改性PE-50管到25厘米长的段有1厘米长的尖（外直径:0.30-0.34毫米）。

2，准备同源血块

1. 麻醉与异氟醚（感应5％，为维护2-3％）的70％，N _{2 O}和30％的澳鼠<子> 2通过在采血前面罩。确认麻醉用脚趾捏。
2. 与已发表 ​​的方法进行⁴供体大鼠股动脉插管，并直接传输股动脉的血变成20厘米长的PE-50管。将管2小时，在室温下凝块血，然后保持该管22小时，在4℃。注:插管使用无菌技术，如步骤3.1所述进行。供体鼠被回收，用于进一步取样。
3. 切PE-50管成50mm的段和冲洗掉从该管的凝块到含有生理盐水的无菌培养皿中。
4. 传送50mm长凝块成60毫米长的PE-10管和PE-10管的每一端连接到包含有23政针生理盐水20厘米长的PE-50管连接至1ml注射器（ 图2） 。
5. 从一个针筒转移凝块由连续交替运动到另一个5分钟，这可以从除去血细胞凝块和最小化的脆弱血管外凝结的血块，而不破坏纤维蛋白核心。
6. 切血块成40毫米长的段，如在无菌条件下，在步骤1.2中所述的血块段式转换成改性PE-50导管。注:所有的PE管进行灭菌与环氧乙烷。

3，栓塞大脑中动脉闭塞（图3A，B）

1. 通过高压灭菌（最小121℃，15磅，15分钟）灭菌所有的外科手术工具。消毒手术表，并使用70％的乙醇相关的外科手术设备。
2. 麻醉与异氟醚对大鼠按照步骤2.1所述。测试麻醉深度上都前后脚进行脚趾捏和观察到的任何动作（收回爪子）表示该动物是没有足够的麻醉做手术。适用于双眼少量兽医药膏，以防止干燥时在麻醉下。剃了毛的腹侧颈和头重地区码与电推剪到皮肤区域暴露。
3. 将大鼠在一个加热垫仰卧位。插入直肠探头，控制和使用恒温电热毯控制单元之间保持36.5-37.5℃的体温。
4. 消毒的剃光皮肤和周围的毛，用10％聚维酮碘接着用70％乙醇。
5. 请在解剖显微镜下脖子上有2厘米长的正中切口。使用牵引器，以暴露手术野和解剖右颈总动脉（CCA），颈外动脉（ECA），颈内动脉（ICA），以及翼腭动脉（PPA）的分类从周围神经和筋膜（ 图3A）。注意事项:手术前，改变无菌手套，如果没有助手帮助准备的动物。
6. 解剖CCA不受周围神经（不伤害迷走神经），然后将动脉下无菌5-0丝线缝合。打个活结（＃1），用一个小hemos把握缝合李永达和拉教授向身体。
7. 剖析非洲经济委员会和它的两个分支，枕动脉（OA）和甲状腺上动脉（STA）。使用兽药电单元凝结两个分支。将两片无菌6-0丝线缝合非洲经委会下。
8. 分开的两个丝的动脉，朝向头部一体成型（前端），另一个朝向身下放置。领带系得过紧（＃2）在最近的一侧头部，抓住丝绸小止血和拉教授向头部。准备一个松散的结（＃3）与其他丝绸以后使用。
9. 解剖ICA和PPA从周围神经（而不损害迷走神经）。领带的PPA与6-0缝线（＃4）。做一个活结与周围的ICA（＃5），6-0缝合。另外，采用微血管夹子夹在ICA。
10. 切一小口（半直通）到非洲经委会紧（＃2）和一个Vannas式弹簧剪刀宽松（＃3）结扎线之间。将改性PE-50桶ê含血凝块放入切口并进入文建会分叉。拧松的绑带（＃3）围绕所述内腔刚够固定保持在留置管的迁移率。
11. 切断非洲经委会在小孔部位释放的树桩和定位ECA和ICA分叉下方的树桩;这将允许改性管容易滑入ICA。打开ICA和轻轻推进从ECA的腔管进入ICA，直到导管的前端到达MCA的原点（〜17毫米的分叉处）。注意:在插入管的末端进入非洲经委会，管，用70％乙醇消毒外表面，然后洗净，用无菌生理盐水。
12. 注入通过改性PE-50导管的血块随着10微升生理盐水在10秒内用100微升Hamilton注射器（ 图3B）。
13. 从非洲经委会5分钟后拔出导管。配合非洲经委会并重新打开CCA。缝合切口在颈部。

4，监测局部脑血流量（rCBF）

1. 在此之前大脑中动脉闭塞，使1.2厘米长的正中切口在头皮暴露颅骨。用牙刮和无菌棉互换取下颅骨骨组织。注意:在手术前，暴露的头皮区域和周围的毛皮被消毒，用10％聚维酮碘接着用70％乙醇。
2. 钻设为2mm后到5毫米的横向使用0.7mm的球形不锈钢毛刺（ 图4）的前囟1.5毫米直径的钻孔。
   注意:保持硬脑膜完整。
3. 把探头0.5毫米硬脑膜表面之上。监测脑血流量在0（基线），5，15，30，60，90，和栓塞后120分钟，并继续在5，15，30，45，和tPA的静脉内给药后的60分钟。脑血流量的最后测量之后，对头皮切口被缝合闭合。注:在颈部切开我们测量脑血流量为马华occlus前的基​​线离子。发表大脑中动脉闭塞，我们衡量颈部切口缝合关闭后局部脑血流量。因此，颈部切口保持无菌。

5，术后护理

1. 注入2.5的生理盐水溶液皮下注射毫升，以防止脱水，并在外科手术，并根据需要缓解疼痛的每6-12小时后，立即注入BUPRENEX（0.05毫克/千克，皮下注射）。
2. 停止异氟醚麻醉。将鼠在37℃兽医恢复室（让动物温暖），并保持观察。它一般需要10分钟的大鼠从麻醉中恢复。然后，把动物带进无菌笼子里，放置一些湿的食物在培养皿中，在笼子里，然后返回笼子的动物消毒室。
3. 中风后24小时，安乐死的大鼠用戊巴比妥钠（100毫克/千克体重，腹腔注射）过量。

6，神经功能缺损评分

1. 之前和在栓塞后2小时进行Bederson得分。使用分级Š0-3 Cale的先前所描述的^5:0，由尾提高大鼠，延伸的两个前肢在地上，没有表现出其它缺陷的动物（正常运动）; 1，通过尾部提高大鼠，弯曲对侧前肢; 2，降低抗侧推（和前肢屈曲），而不盘旋; 3，同样的行为，与盘旋2级。
   注:显示大鼠在栓塞后2小时Bederson评分= 0（无赤字）被排除在进一步的研究中。

结果

激光多普勒血流仪（LDF）用于诱导脑缺血^6,7的过程中监测脑血流量。许多实验室，包括我们的实验室一直在使用局部脑血流量来识别动物的成功大脑中动脉闭塞，但基线的阈值，这是关系到测量现场实验室之间变化。探针的LDF被定位为2mm后方和5mm横向于前囟如前面⁶所述。脑血流量在0监测，5，15，30，60，90，和120分钟注射凝块后。在这个数据的基础上，只有表现出局部脑血流量减?...

讨论

在这项研究中，我们发现在大鼠，在马华的起源是由纤维蛋白凝块丰富闭塞进行栓塞缺血中风模型的标准方法。这种模式的主要优点是:MCA的用富含纤维蛋白的​​血凝块杆的咬合是类似于在人类中血栓栓塞性中风，栓塞中风模型是适合于执行溶栓治疗的临床前研究，并且该模型可以开发由民政部提供的境内可重复和可预测的梗死体积。

用于进行栓塞MCAO模型，该凝块引入，稳...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
rh-tPA	Chemical	Genentech
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Chemical	Sigma	T8877
Anesthesia vaporizer	Equipment	Soma Technology	Drager Vapor 19.1
Rechargeable high speed micro drill	Equipment	Fine Science Tools	18000-17
Curved scissors	Equipment	Fine Science Tools	14117-14
Dumont forceps (Medical #7)	Equipment	Fine Science Tools	11270-20
Dumont forceps (Medical #5)	Equipment	Fine Science Tools	11251-35
Vannas-style spring scissors	Equipment	Fine Science Tools	15000-03
Veterinary recovery chamber	Equipment	Peco Services	V1200
Genie plus syringe pump	Equipment	Kent Scientific Corporation
Rat brain matrix	Equipment	Kent Scientific Corporation	RBMA-310C
Digital caliper	Equipment	World Precision Instruments	501601
Dissecting microscope	Equipment	World Precision Instruments	PZMTIII-BS-LWD
Hamilton syringe	Equipment	Hamilton	model 710
Homeothermic blanket control unit	Equipment	Harvard Apparatus
Electric clipper	Equipment	Braintree Scientific	CLP-9931
Veterinary electrosurgical unit	Equipment	MACAN Manufacturing Company	MV-9
Blood flowmeter	Equipment	Adinstruments
PowerLab 4/30	Equipment	Adinstruments
LabChart 7.2	software	Adinstruments
1 ml syringe	Consumable	Becton, Dickinson and Company	309659
23 G needle	Consumable	Becton, Dickinson and Company	305143
30 G needle	Consumable	Becton, Dickinson and Company	305106
PE-50 tubing	Consumable	Becton, Dickinson and Company	427517
PE-10 tubing	Consumable	Becton, Dickinson and Company	427400
6-0 Silk suture	Consumable	Harvard apparatus	723287
5-0 Silk suture	Consumable	Harvard Apparatus	517607