עורקי תסחיפים התיכון מוחין ספיגה (MCAO) לשבץ איסכמי עם קרישי דם הומולוגיים בחולדות

Summary

In this paper, we demonstrate a standard method for producing an embolic middle cerebral artery occlusion with homologous blood clots (fibrin-rich) in adult rat. This model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical study of thrombolytic therapy for ischemic stroke.

Abstract

טיפול קליני, הטרומבוליטיות עם שימוש בactivator plasminogen רקמות רקומביננטי (tPA) נשאר הטיפול היעיל ביותר עבור שבץ איסכמי חריף. עם זאת, השימוש בtPA מוגבל על ידי החלון הטיפולי הצר שלה ועל ידי עלייה בסיכון לשינוי המורגי. יש צורך דחוף לפתח מודלים שבץ מתאימים ללמוד סוכנים הטרומבוליטיות חדשים ואסטרטגיות לטיפול בשבץ איסכמי. נכון לעכשיו, שני סוגים עיקריים של מודלים שבץ איסכמי פותחו בחולדות ועכברים: MCAO התפר intraluminal ותסחיפים MCAO. למרות שדגמי MCAO באמצעות טכניקת תפר intraluminal היו בשימוש נרחב במחקר שבץ מונע מנגנון, מודלים תפר אלה אינם מחקים את המצב הקליני ואינם מתאימים ללימודים הטרומבוליטיות. בין הדגמים הללו, מודל MCAO תסחיפים מחקה באופן הדוק שבץ איסכמי אנושי ומתאים לחקירה פרה קלינית של טיפול טרומבוליטי. מודל תסחיפים זו פותח לראשונה בחולדות על ידי אובergaard et al. ¹ ב1992 ומאופיין יותר על ידי Zhang et al. בשנת 1997 ^2. למרות MCAO תסחיפים צבר הגדלת תשומת לב, יש בעיות טכניות שעומדות בפני מעבדות רבות. כדי לענות על הצרכים גוברים למחקר הטרומבוליטיות, אנו מציגים מודל לשחזור ביותר של MCAO תסחיפים בחולדה, אשר יכול לפתח צפוי אוטם נפח בתוך שטח MCA. בקיצור, PE-50 צינור שונה הוא מתקדם בעדינות מעורק התרדמה החיצונית (ECA) לתוך לומן של עורק התרדמה הפנימי (ICA) עד קצה הצנתר מגיע למקורו של MCA. דרך הצנתר, קריש דם הומולוגי יחיד ממוקם במוצאו של MCA. כדי לזהות את ההצלחה של חסימת MCA, זרימת דם במוח האזורית הייתה פיקוח, גירעונות נוירולוגיות וכרכי אוטם נמדדו. הטכניקות שהוצגו במאמר זה אמורות לעזור לחוקרים להתגבר על בעיות טכניות להקמת מודל זה למחקר שבץ. </ P>

Introduction

שבץ הוא הגורם המוביל השלישי למוות בארצות הברית, אבל אפשרויות טיפול בשבץ חריף יישארו מוגבלות. נכון לעכשיו, עירוי תוך ורידי של activator plasminogen רקמות רקומביננטי (tPA) לפזר את קרישי הדם הוא הטיפול יעיל ביותר לשבץ איסכמי חריף. עם זאת, השימוש בtPA מוגבל על ידי החלון הטיפולי הצר שלה ועל ידי עלייה בסיכון לדימום תוך מוחי. לכן, יש צורך במודל של שבץ מתאים למחקר הטרומבוליטיות בדחיפות.

עורק אמצע המוח (MCA) הוא העורק לרוב האפיל בשבץ בבני אדם. התמקד בעורק זה, מודלים של בעלי חיים רבים של שבץ איסכמי הוקמו. נכון לעכשיו, שני סוגים עיקריים של מודלים איסכמיה מכרסמים מוקד על ידי הגורם לחסימת MCA פותחו: מודל תפר מודל MCAO ותסחיפי MCAO. למרות שדגמי MCAO באמצעות טכניקת תפר intraluminal היו בשימוש נרחב במחקר שבץ מונע מנגנון, מודלים תפר אלה לאשבץ אדם לחקות, כעד 80% ממקרי שבץ אדם נגרמים על ידי פקקת או תסחיף. עם זאת, מודל שבץ תסחיפים באמצעות קרישי דם מחקה באופן הדוק שבץ אדם ונחשב מתאים למחקר הטרומבוליטיות. מודל תסחיפים זו פותח לראשונה בחולדות על ידי et Overgaard אל. ¹ ב1992 ועוד מאופיין בet ג'אנג אל. בשנת 1997 ² ועל ידי Dinapoli et al. ב2006 ^3. למרות MCAO תסחיפים זכה לתשומת לב גוברת, יש בעיות טכניות מתמודדות על ידי מעבדות רבות.

במאמר זה, אנו מדגימים שיטה סטנדרטית לייצור MCAO תסחיפים עם קרישי דם הומולוגיים בחולדה הבוגרת, אשר יכול לפתח אוטם צפוי בתוך שטח MCA. הטכניקות שהוצגו במאמר זה אמורות לעזור לחוקרים להתגבר על בעיות טכניות להקמת מודל זה למחקר שבץ.

Protocol

הצהרת אתיקה: חולדות ספראג-Dawley מבוגרת זכר (במשקל 330-380 ז) היו בשימוש בפרוטוקול זה. פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) במדעי בריאות LSU המרכז-Shreveport ועומד ב'המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה "(מהדורה השמינית, האקדמיה לאומית למדעים, 2011 ).

.1 הכנת Tube PE-50 השתנה

1. החזק צינור PE-50 ארוכי 30 סנטימטר מעל אש גז על ידי ידיים, לרכך את הצינור בהדרגה. בעדינות למתוח את הצינור.
2. בחר נקודה על הצינור נמתח באמצעות קליפר דיגיטלי (איור 1), לסמן אותו, ולחתוך את PE-50 הצינור הותאם למגזר ארוך 25 סנטימטר עם קצה 1 סנטימטר ארוך (מחוץ קוטר: .30-0.34 מ"מ).

2 הכנת קרישי דם ההומולוגי

1. להרדים את העכברוש עם isoflurane (5% לזירוז, 2-3% לתחזוקה) בN 70% ₂ O ו30% O <תת> 2 על ידי מסיכת פנים לפני איסוף דם. לאשר הרדמה על ידי קמצוץ הבוהן.
2. בצע cannulation עורקי הירך של עכברוש תורם עם שיטה שפורסמה ⁴ ולהעביר דם עורק הירך ישירות לתוך PE-50 צינור ארוך 20 סנטימטר. מניחים את הצינור לשעה 2 בטמפרטורת חדר לדם להיקרש, ולאחר מכן לשמור על הצינור ל22 שעות ב 4 ° C.. הערה: Cannulation מבוצע באמצעות טכניקת ספטית, כמתואר בשלב 3.1. עכברוש התורם הוא התאושש לדגימה נוספת.
3. חותך את צינור PE-50 ל50 מגזרי מ"מ ולשטוף את הקריש מהצינור לתוך צלחת פטרי המכילה סטרילי מלח רגיל.
4. העבר את 50 מ"מ הקריש ארוך לתוך ארוך 60 מ"מ PE-10 צינור ולחבר את כל קצה של PE-10 צינור לצינור ארוך 20 סנטימטר PE-50 מחובר למזרק 1 מ"ל המכיל מלח רגיל עם 23 מחט G (איור 2) .
5. Shift הקריש על ידי תנועה לסירוגין רציפה ממזרק אחד למשנהו במשך 5 דקות, אשר יכולה להסיר את תאי דם שלהקריש ולמזער השביר של קריש קרוש extravascular, מבלי לשבש את ליבת הפיברין.
6. חותך את הקריש למגזר ארוך 40 מ"מ ולהעביר את קטע הקריש לPE-50 קטטר שונה כמתואר בשלב 1.2 בתנאי ספטית. הערה: כל צינורות PE מעוקרים עם אתילן אוקסיד.

.3 חסימת עורק תסחיפים התיכון מוחין (איור 3 א ', ב')

1. לעקר את כל הכלים כירורגיים ידי מעוקר (מינימום 121 מעלות צלזיוס, 15 PSI, ל15 דקות). לטהר את שולחן הניתוחים וציוד כירורגי הקשורים באמצעות אתנול 70%.
2. להרדים את העכברוש עם isoflurane כמתואר בשלב 2.1. בדוק את עומק ההרדמה על ידי ביצוע קמצוץ הבוהן על שני רגליים האחוריות, וכל תנועה שנצפתה (משיכת הכפה) מצביעה על כך שבעלי החיים הוא לא מספיק בהרדמה לעשות ניתוח. למרוח כמות קטנה של משחה וטרינר בשני העיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. לגלח את הפרווה על הגחון הצוואר והראש מחדשgions עם קוצץ חשמלי לחשוף את אזורי העור.
3. מניחים את החולדה במצב שכיבה על כרית חימום. הכנס בדיקה, שליטה בפי הטבעת ולשמור על טמפרטורת גוף בין 36.5-37.5 מעלות צלזיוס באמצעות יחידת שמיכת שליטת homeothermic.
4. לחטא את העור המגולח ופרווה המקיפה עם 10% povidone- יוד ואחריו 70% אתנול.
5. לעשות חתך קו האמצע של 2 סנטימטר ארוך על הצוואר תחת מיקרוסקופ לנתח. השתמש בכלי כתיבה כדי לחשוף את שדה הניתוח ולנתח את העורק הימני הנפוץ תרדמה (CCA), עורק תרדמה חיצוני (ECA), עורק תרדמה פנימי (ICA), ועורק pterygopalatine (PPA) חופשי מעצבים שמסביב וfascia (איור 3 א). הערה: לפני הניתוח, לשנות כפפות סטריליות אם לא עוזר עוזר להכין את בעלי החיים.
6. לנתח את המרכז לאמנות עכשווית חופשית מהעצבים שמסביב (מבלי לפגוע בעצב המחנק) ומקום תפר 5-0 משי סטרילי תחת העורק. לקשור קשר תלוש (מס '1) ולתפוס את התפר באמצעות hemos קטןמידה ולמשוך לימדה כלפי הגוף.
7. לנתח את ECA ושני הסניפים שלה, את העורק העורפי (OA) ועורק מעולה בלוטת התריס (STA). להקריש שני סניפים באמצעות יחידת electrosurgical וטרינרים. הנח שתי חתיכות של תפרי משי סטרילי 6-0 תחת ECA.
8. להפריד בין שני המשי ממוקם מתחת לעורק, חתיכה אחת לכיוון הראש (קצה הדיסטלי) והשני לכיוון הגוף. לקשור קשירה הדוקה (מס '2) בצד הקרוב ביותר לראש, לתפוס את המשי עם hemostats הקטן ולמשוך לימד לכיוון הראש. הכן קשר רופף (# 3) עם המשי האחר לשימוש מאוחר יותר.
9. לנתח את ICA וPPA מהעצבים שמסביב (מבלי לפגוע בעצב המחנק). לקשור את PPA עם תפר 6-0 (מס '4). הפוך קשר להחליק עם 6-0 תפר סביב ICA (המס '5). לחלופין, קליפ ICA באמצעות קליפ כלי דם.
10. חותך חור קטן (1/2 thru) לתוך ECA בין ההדוק (המס '2) ו( # 3) חיבורי אותיות רופפות עם מספריים באביב בסגנון Vannas. הכנס את PE-50 אמבטיה שונהדואר המכיל קריש דם לתוך החתך ומראש להסתעפות של המרכז לאמנות העכשווית. הדק את המייתר הרופף (# 3) סביב לומן מספיק כדי לאבטח לשמר את הניידות של צינור שוכני ב.
11. חותך את ECA באתר של חור קטן כדי לשחרר את הגדם ומקם את הגדם מתחת להסתעפות של ECA ויק"א; זה יאפשר הצינור הותאם להחליק בקלות לתוך ICA. פתח את ICA ובעדינות לקדם את הצינור מלומן של ECA לתוך ICA עד קצה הצנתר מגיע למקורו של MCA (~ 17 מ"מ מההסתעפות). הערה: לפני הכנס את קצה הצינור לתוך ECA, על פני השטח החיצוניים של צינור סטרילי עם 70% אתנול, ולאחר מכן לשטוף עם מלח רגיל סטרילי.
12. הזרק את הקריש באמצעות PE-50 קטטר שונה יחד עם 10 μl של תמיסת מלח מעל 10 שניות באמצעות מזרק המילטון 100 μl (איור 3 ב).
13. למשוך את הצנתר מECA 5 דקות מאוחר יותר. לקשור את ECA ולפתוח מחדש מרכז לאמנות עכשווית. לתפור את החתך בצוואר.

.4 ניטור דם אזורי במוח זרימה (rCBF)

1. לפני חסימת MCA, לעשות חתך קו האמצע ארוך 1.2 סנטימטר בקרקפת כדי לחשוף את עצם הגולגולת. הסר את הרקמות על עצם הגולגולת עם מגרד שיניים ועסקות חלף גפן סטרילי. הערה: לפני הניתוח, אזור הקרקפת החשופה ופרווה מסביב לחטא עם 10% povidone- יוד ואחריו 70% אתנול.
2. לקדוח חור בר קוטר 1.5 מ"מ הממוקם ב2 מ"מ אחורי ו 5 מ"מ לרוחב גבחת באמצעות בר 0.7 מ"מ כדורי נירוסטה (איור 4).
   הערה: שמור את הדורה ללא פגע.
3. מניחים את החללית 0.5 מ"מ מעל פני השטח הדורה. צג rCBF ב 0 (בסיס), 5, 15, 30, 60, 90, ו120 דקות לאחר אמבוליזציה ולהמשיך ב5, 15, 30, 45, ו60 דקות לאחר עירוי לוריד של tPA. לאחר המדידה האחרונה של rCBF, החתך בקרקפת סגור על ידי תפר. הערה: לפני חתך צוואר אנו מודדים rCBF כבסיס לפני occlus MCAיון. חסימת ההודעה MCA אנו מודדים rCBF לאחר סגירת איחוי החתך בצוואר. כך, חתך הצוואר נשמר סטרילי.

טיפול .5 לאחר ניתוח

1. הזרק 2.5 מ"ל של תמיסת מלח תת עורי על מנת למנוע התייבשות ולהזריק Buprenex (0.05 מ"ג / קילוגרם, SC) מייד לאחר הניתוח וכל שעה 6-12 בהתאם לצורך להקלה על כאב.
2. תפסיק הרדמה isoflurane. מניחים את החולדה בחדר התאוששות וטרינרי 37 ° C (לשמור על חום בעלי חיים) ולשמור על תצפית. זה בדרך כלל לוקח 10 דקות לחולדה להתאושש מהרדמה. לאחר מכן, הכניס את בעלי החיים לכלוב מעוקר, למקם את מזון רטוב כמה בצלחת פטרי בכלוב, ולהחזיר את הכלוב לחדר עיקור בעלי החיים.
3. 24 שעות לאחר שבץ, להרדים את העכברוש עם מנת יתר של נתרן pentobarbital (100 מ"ג / קילוגרם משקל גוף, IP).

.6 ציון גירעון נוירולוגיות

1. בצע את ציון Bederson לפני ובשעה 2 לאחר אמבוליזציה. השתמש של דירוגקייל של 0-3 כפי שתואר בעבר ^5: 0, העלאת העכברוש בזנב, בעלי החיים המשתרעים שני forelimbs לרצפה ושאינם מראים שום גירעונות אחרים (תנועה רגילה); 1, העלאת העכברוש בזנב, כופף את forelimb הנגדי; 2, ירד התנגדות לדחיפה לרוחב (וכיפוף forelimb) בלי שחג; 3, אותה ההתנהגות כמו בדרגה 2 עם חג.
   הערה: חולדות מראים ציון = 0 (אין גירעון) Bederson בשעה 2 לאחר אמבוליזציה אינן נכללות במחקר נוסף.

תוצאות

Flowmetry הלייזר דופלר (LDF) שימש כדי לפקח rCBF במהלך האינדוקציה של איסכמיה המוחית ^6,7. מעבדות רבות, כולל המעבדה שלנו כבר משתמשים rCBF לזהות בעלי חיים עם חסימת MCA מוצלחת, אבל הספים של תחילת המחקר נעו בין מעבדות הקשורים לאתר של מדידה. הבדיקה של LDF ממוקמת באחורי 2 מ"מ ו 5 מ"מ ...

Discussion

במחקר זה, שהדגמנו שיטה סטנדרטית לביצוע מודל שבץ MCAO תסחיפים בחולדה, שבמקורו של MCA הוא occluded על ידי קריש הפיברין העשיר. היתרון העיקרי של מודל זה הוא: החסימה של הגזע של MCA עם קריש דם הפיברין העשיר דומה לשבץ תרומבו בבני אדם, מודל שבץ תסחיפים הוא מתאים לביצוע חקירה פרה קלינית ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
rh-tPA	Chemical	Genentech
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Chemical	Sigma	T8877
Anesthesia vaporizer	Equipment	Soma Technology	Drager Vapor 19.1
Rechargeable high speed micro drill	Equipment	Fine Science Tools	18000-17
Curved scissors	Equipment	Fine Science Tools	14117-14
Dumont forceps (Medical #7)	Equipment	Fine Science Tools	11270-20
Dumont forceps (Medical #5)	Equipment	Fine Science Tools	11251-35
Vannas-style spring scissors	Equipment	Fine Science Tools	15000-03
Veterinary recovery chamber	Equipment	Peco Services	V1200
Genie plus syringe pump	Equipment	Kent Scientific Corporation
Rat brain matrix	Equipment	Kent Scientific Corporation	RBMA-310C
Digital caliper	Equipment	World Precision Instruments	501601
Dissecting microscope	Equipment	World Precision Instruments	PZMTIII-BS-LWD
Hamilton syringe	Equipment	Hamilton	model 710
Homeothermic blanket control unit	Equipment	Harvard Apparatus
Electric clipper	Equipment	Braintree Scientific	CLP-9931
Veterinary electrosurgical unit	Equipment	MACAN Manufacturing Company	MV-9
Blood flowmeter	Equipment	Adinstruments
PowerLab 4/30	Equipment	Adinstruments
LabChart 7.2	software	Adinstruments
1 ml syringe	Consumable	Becton, Dickinson and Company	309659
23 G needle	Consumable	Becton, Dickinson and Company	305143
30 G needle	Consumable	Becton, Dickinson and Company	305106
PE-50 tubing	Consumable	Becton, Dickinson and Company	427517
PE-10 tubing	Consumable	Becton, Dickinson and Company	427400
6-0 Silk suture	Consumable	Harvard apparatus	723287
5-0 Silk suture	Consumable	Harvard Apparatus	517607