تحليل الوقت الحقيقي ايض الملف في<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافات ماوس المعوية سرداب عضي

Summary

مثقف organoids سرداب صغير في الأمعاء فيفو السابقين توفير نظام زراعة الأنسجة الذي يلخص نمو أقبية تعتمد على الخلايا الجذعية ومكانها المناسب. أنشأنا طريقة لفحص الملف الشخصى الأيض في الوقت الحقيقي في الماوس الأساسي organoids سرداب. وجدنا organoids الحفاظ على الخصائص الفسيولوجية التي يحددها مصدرها.

Abstract

الغشاء المخاطي في الأمعاء الصغيرة يسلك العمارة المتكررة تنظيمها في اثنين من الهياكل الأساسية: الزغب، وإسقاط في لمعة الأمعاء وتتألف من المعوية ناضجة، والخلايا الكأسية والخلايا enteroendocrine. والأقبية، ويقيم الأقرب إلى تحت المخاطية والعضلية، بإيواء الجذعية البالغة والخلايا الاولية والخلايا الناضجة بانيت، وكذلك انسجة والخلايا المناعية للالمكروية سرداب. حتى السنوات القليلة الماضية، في الدراسات المختبرية من الأمعاء الدقيقة اقتصر على خطوط الخلايا المشتقة من الأورام إما حميدة أو خبيثة، ولم تمثل فسيولوجيا الظهارة المعوية الطبيعية وتأثير المكروية التي يقيمون فيها. هنا، ونحن لشرح طريقة مقتبسة من ساتو وآخرون (2009) لزراعة organoids سرداب الماوس المعوية الأولية المستمدة من C57BL / 6 الفئران. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم استخدام الثقافات عضي سرداب لفحص الملف الشخصى الأيض سرداب في الوقت الحقيقي من خلال قياسمنة من استهلاك الأكسجين القاعدية، ومعدل حال السكر، وإنتاج ATP والقدرة التنفسية. Organoids الحفاظ على الخصائص التي حددها مصدرها والاحتفاظ جوانب التكيف الأيض الخاصة التي تعكسها معدلات استهلاك الأوكسجين وتحمض خارج الخلية. في الوقت الحقيقي الدراسات الأيضية في هذا سرداب عضي نظام الثقافة هي أداة قوية لدراسة سرداب استقلاب الطاقة عضوي الشكل، وكيف يمكن التضمين من قبل العوامل الغذائية والدوائية.

Introduction

سرطان القولون (CRC) هو ثالث سبب رئيسي لوفيات السرطان ذات الصلة في الولايات المتحدة. سرطان القولون متفرقة - أي أن تنشأ في وقت لاحق في الحياة (> 50 سنة من العمر) مع وجود عوامل وراثية واضحة المهيئة - حسابات ل~ 80٪ من جميع الحالات، مع حدوث يتأثر بقوة الأنماط الغذائية على المدى الطويل ^1،2. هذه الأورام تظهر تحولا الأيض نحو الاعتماد على تحلل الأكسدة، والمعروفة باسم تأثير اربورغ، والتي قد تجعل جزء في تركيزات أعلى من اللبنات الخلوية والطاقة المتوفرة (من خلال glutaminolysis) للسماح وربما دفع معدلات عالية من انتشار الخلايا السرطانية ^3-5 . دراسات الإصابة بسرطان القولون وكذلك سرطانات الجهاز الهضمي الأخرى بما في ذلك سرطانات الأمعاء الصغيرة توفر نظرة متبصرة في قضية تشكيل الورم. التحقيق في الخلافات بين الدول الأيض العادية، الموالية للمكون للأورام ومكون للأورام من نظم الجهاز الهضمي قد تساعد ديتermination من الخطر النسبي لتطور الورم، وكذلك الكشف المبكر عن الأورام. وعلاوة على ذلك، فإن فهم عملية الأيض الطاقة البيولوجية التي تنطوي على التنفس الميتوكوندريا وتحلل توفير البصيرة الأساسية في كيفية يشوش فسيولوجيا الخلايا والشيخوخة والمرض حالة توازن الأمعاء. الاستفادة من تكنولوجيا الطاقة الحيوية الفحص لتحليل تدفق خارج الخلية يمكن تقييم معدلات التنفس الميتوكوندريا وتحلل في وقت واحد في الخلايا نموا في الثقافة في الوقت الحقيقي ^6،7.

حتى وقت قريب، في الدراسات المختبرية من الأمعاء الدقيقة اقتصرت على خطوط الخلايا المشتقة من الأورام إما حميدة أو خبيثة ^8،9 ولا تمثل فسيولوجيا الظهارة المعوية الطبيعية وتأثير المكروية التي يقيمون فيها. في عام 2009، قدم ساتو وآخرون. ¹⁰ وخارج الحي نظام الثقافة في النمو ثلاثي الأبعاد (3D) الماوس organoids الظهارية في الأمعاء، أو epithelial "مصغرة الشجاعة"، ومناسبة للالتحقيقات التجريبية والتشخيصية والعلاجية ^10،11. وعلاوة على ذلك، الأقبية المعزولة من الفئران مقيدة بالوحدات الحرارية تحافظ على خصائص النمو المتغيرة كما organoids في مثل هذه الثقافات ^12. بالمقارنة مع خطوط الخلايا تحولت والثقافات عضي سرداب يمكن استخدامها لتوليد البيانات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية تقديم نموذج أفضل بكثير لفهم الدولة في الجسم الحي.

نحن تكييفها تكنولوجيا تحليل الطاقة الحيوية لفحص استقلاب الطاقة من organoids سرداب الأمعاء. كان الفأر organoids سرداب الأمعاء مثقف فيفو السابقين لتطوير الدراسات استقلاب الطاقة عضي سرداب المقدمة. تم قياس معدل استهلاك الأكسجين (OCR)، و سعر تحمض خارج الخلية (ECAR) من organoids سرداب في غياب وجود اثنين من مثبطات مختلفة الأيض (أوليغوميسين، روتينون) وحاملة أيون (الكربونيل السيانيد-P-trifluoromethoxyphenylhydrazone). وORGA سردابوقد عكست استجابة الأيض NOID لهذه المركبات الكيميائية بنجاح من خلال تغيير ECAR والقيم OCR.

ودراسات الطاقة البيولوجية الخلوية توضيح التفاعلات المتبادلة بين دولة الأيض ومخاطر المرض والنمط الظاهري في السرطان، والسمنة، والسكري، والاضطرابات الأيضية وأمراض الميتوكوندريا وتساعد أساليب الفحص مسبقة مع آثار مباشرة على الطب متعدية. هنا، نحن تصف بروتوكول مفصلة لعزل الأقبية الأمعاء الصغيرة وللثقافة organoids سرداب. وعلاوة على ذلك، ونحن نقدم طريقة جديدة لاستخدام الثقافات عضي سرداب لفحوصات الأيض.

Protocol

وقد أجريت هذه الدراسة وفقا للتوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة. وتمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة الأخلاق للتجارب على الحيوانات في كلية ألبرت أينشتاين للطب.

1. القبو العزلة والثقافة

1. عزل الأقبية من الأمعاء الدقيقة:
   1. عزل الأقبية الأمعاء من أي نموذج الفئران من الفائدة. الموت ببطء الفئران مع CO ₂ تليها خلع عنق الرحم.
   2. فتح البطن طوليا وملء الأمعاء الدقيقة (SI) بمحلول ملحي بارد الجليد الفوسفات مخزنة، PBS (-Ca ^2+، -Mg ²⁺⁾ مع 2X للمضادات الحيوية مضاد فطري (مكافحة المضادة). بسرعة عزل الأمعاء الدقيقة.
   3. تشريح دقيق خال من الدهون المساريقي باستخدام مشرط. احرص على عدم خرم الأنسجة - في جميع الأوقات الحفاظ على الأنسجة رطبة مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. فتح الأسواق العالمية ضغطهاستاين طوليا ويغسل جيدا بالماء والثلج البرد PBS.
   4. قطع الأمعاء الدقيقة إلى قسمين وتتسطح بها باستخدام تلميح القطن مبللة، بلطف كشط الزوائد باستخدام شريحة تبريد مسبقا. يغسل بقوة في الجليد الباردة PBS عدة مرات.
   5. احتضان 3 دقائق في 20 مل 1X PBS في 3 ملي حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) /0.5 ملي dithiothreitol (DTT) لتفارق غير الأنزيمية للأنسجة.
   6. قطع الأنسجة الى قطع صغيرة (2-4 ملم) باستخدام شفرة حلاقة على شريحة تبريد مسبقا. نقل قطع في أنبوب 50 مل تحتوي على 20 مل PBS الباردة الجليد.
   7. ماصة بلطف صعودا ونزولا 10X باستخدام 10 مل ماصة معقمة المتاح. السماح شظايا الأنسجة الرواسب بفعل الجاذبية. إزالة طاف مع ماصة. كرر ثلاث مرات إضافية؛ التأكد من طاف هو واضح.
   8. إضافة 20 مل من برنامج تلفزيوني في 2 ملي EDTA. دوامة واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع هزاز لطيف.
   9. ترك رواسب الأنسجة وتجاهل طاف. إضافة 15 مل PBS الجليد البارد وماصةصعودا وهبوطا 5X مع ماصة 10 مل. السماح للشظايا الأنسجة الرواسب وجمع طاف كما الكسر 1 (F1). تكرار جمع F2-F5، كل جزء على حدة المحافظة.
   10. إضافة 15 مل PBS الجليد الباردة وهذه المرة هزة بقوة باليد لمدة 15 ثانية. جمع F6 وتكرار لF7، F8. إذا قطع الأنسجة تبدأ تطفو، انقر لمساعدتهم على الاستقرار.
   11. تفقد قسامة من كل جزء تحت المجهر. بركة تلك الكسور التي تحتوي الأقبية.
   12. تمرير الكسور المجمعة خلال 70 ميكرون خلية النايلون مصفاة، وجمع الأقبية في أنبوب 50 مل.
   13. الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف و resuspend بيليه في 10 مل PBS الجليد الباردة مع 2X أقبية مكافحة معاداة ونقل إلى أنبوب 15 مل. تكرار غسل واحد لمزيد من الوقت.
   14. غسل الخبايا مرة واحدة مع 10 مل من الجليد البارد ADF، DMEM المتقدم / F-12 (Dulbecco "ليالي التعديل النسر متوسطة / هام" ليالي F-12) - 2X مكافحة المضادة.
   15. غسل الخبايا مرة واحدة مع 10 مل وDF - 1x أخرى مضادة للمكافحة.
   16. عد الخبايا باستخدام عدادة الكريات. ضبط مستوى الصوت حل سرداب ونقل إلى أنبوب 1.5 مل بحيث تركز سرداب النهائي عندما معلق سيكون 100-500 الأقبية في 50 ميكرولتر من مزيج هلامي البروتين (Matrigel). الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية و resuspend الأقبية في خليط من البروتين هلامي.
   17. لوحة 50 ميكرولتر من سرداب - هلامي تعليق خليط من البروتين لكل بئر في لوحة 24-جيدا (منطقة النمو: 2 سم ^2)، ووضع بعناية قطرة تعليق في وسط كل بئر. الحفاظ على لوحة في CO _2، 37 ° C حاضنة لل~ 30 دقيقة حتى يتصلب تعليق.
   18. إضافة 500 ميكرولتر وسائل الإعلام ثقافة الجليد الباردة كاملة (متقدم DMEM / F12 مع 1X المضادة - المعادي، 10 ملم 4- (2-هيدروكسي إيثيل) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES)، 1X GlutaMAX، 1X B27 الملحق، الملحق 1X N2، 1 ملم N-أسيتيل-L-سيستين (NAC)، 50 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (صندوق تعديل العولمة الأوروبي)، و 100 نانوغرام / ملرأس، و 500 نانوغرام / مل R-Spondin).
       1. إعادة تشكيل عوامل النمو في 0.1٪ الأبقار مصل الزلال (BSA) في برنامج تلفزيوني.
2. سرداب عضي الثقافة والممر:
   1. مرور organoids سرداب 14-21 يوما بعد البذر (أو حسب الحاجة) على النحو التالي:
      1. تغيير وسائل الاعلام كل يوم جمعة والاثنين. يوم الأربعاء، استبدال نصف وسائل الإعلام مع وسائل الاعلام الطازج.
   2. إزالة مستنبت. غسل العينة مرتين مع 500 ميكرولتر PBS في فترات 5 دقائق.
   3. إزالة برنامج تلفزيوني وكسر بلطف صعودا وخليط من البروتين هلامي باستخدام ماصة معقمة P1000 الحافة الصغيرة.
   4. إضافة 1 مل كامل وسائل الإعلام ثقافة لبئر واحد و resuspend organoids في 1 مل سائل الإعلام.
   5. تعطيل بلطف organoids باستخدام P1000 pipetting صعودا وهبوطا 20-30x (فحص تحت المجهر للتفكك عضوي الشكل الصحيح مع تحقيق عائد جيد حتى سرداب تقنية متسقة تم تطويرها).
   6. نقل الخبايا لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل.الطرد المركزي في 100 x ج في 4 درجات مئوية، 5 دقائق.
   7. يغسل بيليه مرتين مع 1 مل كامل وسائل الإعلام الثقافة.
   8. انقسام في نسبة 1: 3 أو 1: 6 حسب الحاجة، أقبية إعادة التعليق في 50 ميكرولتر Matrigel لكل بئر. المضي قدما على النحو المبين أعلاه (القسم 1.1.16-18).
3. سرداب تجميد عضي:
   1. إزالة مستنبت. غسل العينة في 500 ميكرولتر PBS.
   2. تفريق خليط من البروتين هلامي باستخدام طرف P1000 ماصة.
   3. إضافة 1 مل سائل الإعلام لبئر واحد و resuspend organoids في 1 مل سائل الإعلام.
   4. كسر بلطف حتى organoids باستخدام P1000 pipetting صعودا وهبوطا 20-30x.
   5. نقل organoids إلى أنبوب 1.5 مل. الطرد المركزي في 100 x ج في 4 درجات مئوية، 5 دقائق.
   6. يغسل بيليه مرتين مع 1 مل كامل وسائل الإعلام الثقافة.
   7. أقبية resuspend في 500 ميكرولتر تجميد وسائل الإعلام.
   8. أقبية نقل إلى cryotube، ووضع أنبوب في وعاء تجميدها وتخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية overniGHT.
   9. نقل إلى أقبية السائل N ₂ خزان.
      1. استعادة organoids سرداب المجمدة من قبل ذوبان بسرعة في 37 ° C حمام الماء. يغسل مع 500 ميكرولتر كامل وسائل الإعلام ثقافة واحدة، الطرد المركزي في 100 x ج، 5 دقائق و resuspend في هلامي خليط من البروتين، والثقافة كما هو موضح أعلاه. لاستعادة أفضل، إضافة مثبط ROCK (Y-27632) لوسائل الإعلام التجميد.

2. القبو عضي الأيض الفحص

1. 24-الآبار إعداد اللوحة:
   1. عزل الأقبية والاعتماد وفقا لبروتوكول (انظر القسم 1.1 لعزل سرداب والقسم 1.2 للسرداب مرور).
   2. resuspend في أقبية هلامي خليط من البروتين (100-200 الأقبية في 20 ميكرولتر).
   3. لوحة-سرداب هلامي خليط من البروتين تعليق في لوحة الفحص 24-جيدا (للتأكد من أن هناك على الأقل ثلاث نسخ لكل عينة) والسماح للتعليق على يصلب عند 37 درجة مئوية في CO ₂حاضنة. ثم إضافة 500 ميكرولتر الكامل سائل الإعلام والثقافة.
   4. أقبية الثقافة (كما هو موضح في القسم 1.1) ونلاحظ تحت المجهر حتى تنمو في أقبية organoids تطويره بالكامل.
2. خارج الخلية الجريان الفحص:
   1. خرطوشة هيدرات بين عشية وضحاها في ₂ غير CO (0٪ CO _2)، 37 درجة مئوية الحاضنة.
   2. إزالة مستنبت وغسل organoids مرتين مع 500 DMEM ميكرولتر (بدون: الجلوكوز والجلوتامين L-، البيروفات الصوديوم وبيكربونات الصوديوم، ومع: أحمر الفينول). انتظر 5 دقائق.
   3. إضافة 675 ميكرولتر لكل المتوسطة الفحص جيدا (DMEM مع 2 مم L-الجلوتامين و 5 ملي مد الجلوكوز) إلى كل بئر.
   4. تحقق سرداب organoids التشكل المجهري للتأكد من أن organoids وخليط من البروتين هلامي وسليمة بعد يغسل. احتضان 1 ساعة في غير ثاني _2، 37 درجة مئوية الحاضنة.
   5. إعداد 10 ميكرومتر المركبات عن طريق الحقن (أوليغوميسين، الكربونيل السيانيد-P-trifluoro-ميثوكسي فينيل هيدرازون (FCCP)، صotenone) في مقايسة المتوسطة.
   6. انشاء خرطوشة عن طريق تحميل 75 ميكرولتر من 10 ميكرومتر المركبات عن طريق الحقن في موانئ بالتتابع خرطوشة: ميناء A - أوليغوميسين. ميناء ب - FCCP. وميناء C - روتنون (تركيزات النهائية خلال الفحص سوف يكون 1 ميكرومتر).
   7. احتضان خرطوشة 30 دقيقة - 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة _2-CO غير.
   8. في نفس الوقت، تشغيل محلل XF وخلق القالب بروتوكول الفحص.
   9. ضع خرطوشة والمرافق في لوحة XF محلل وتشغيل "معايرة" خرطوشة.
   10. تحقق organoids سرداب مجهريا للتأكد من أنها هي التي تعلق إلى خليط من البروتين هلامي.
   11. لوحة الثقافة خلية الحمل في بروتوكول أداة فحص وتشغيل.

النتائج

تم إنشاء organoids سرداب من 8 أشهر من العمر C57BL / 6 الفئران التي غذيت تنقية القوارض الحمية المعهد الأمريكي للتغذية 76A (AIN76A). يمكن زراعتها organoids سرداب الأمعاء في الثقافة لفترات طويلة من سرداب واحد (الشكل 1A، السهم الأحمر واحد). Organoids تنمو خارج هياكل شبيهة سرداب في 18-20 أي?...

Discussion

نحن اختبار معدل استهلاك الأوكسجين (OCR)، و سعر تحمض خارج الخلية (ECAR) من الأقبية المعزولة من الفئران البالغة 8 أشهر ونمت لتصبح organoids خارج الحي، وبعد قياس معدل القاعدية، تم تقييم الأيض سرداب بإضافة أوليغوميسين، الكربونيل السيانيد -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) وروتينون، با?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free	BD Biosciences	356231
PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2	Life Technologies	20012-027
Advanced DMEM/F-12 (1x)	Life Technologies	12634-028
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium w/o glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	D5030
Phenol red sodium salt	Sigma-Aldrich	P4758	Final Concentration 15 mg/l in DMEM (D5030) - step 2.2.2
Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml	Life Technologies	15240-062	Final concentration 1x or 2x
Penicilin-Streptomycin, liquid	Life Technologies	15140-122	Final concentration 1x
Gibco® GlutaMAX™ supplement	Life Technologies	35050061	Final concentration 1x
Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M	Life Technologies	15630-080	Final concentration 10 mM
N-acetyl-L-cysteine, 25 g	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Final concentration 1 mM
100x N-2 supplement, liquid	Invitrogen	17502-048	Final concentration 1x
50x B-27® supplement minus Vitamin A, liquid	Invitrogen	12587-010	Final concentration 1x
Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50 μg	R&D Systems	3474-RS-050	Final concentration 500 ng/ml
Recombinant Murine EGF, 100 μg	Peprotech	315-09	Final concentration 50 ng/ml
Recombinant Murine Noggin, 20 μg	Peprotech	250-38	Final concentration 100 ng/ml
Gibco® L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Final concentration 2 mM
Gibco® glucose powder	Life Technologies	15023-021	Final concentration 5 mM
Ambion® 0.5 M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0	Life Technologies	AM9260G	Final concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8
[header]
DTT (dithiothreitol), 1M	Life Technologies	P2325	Final concentration 3 mM
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	0.1% in PBS
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044	1% in PBS
Recovery™ Cell Culture Freezing Medium	Life Technologies	12648-010
ROCK inhibitor (Y-27632)	Sigma-Aldrich	Y0503	Final concentration 10 μM
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	Final concentration 1 μM
Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	Final concentration 1 μM
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Final concentration 1 μM
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465	Final concentration 0.1 N in PBS
XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)	Seahorse Bioscience