אמיתי ניתוח זמן של פרופיל המטבולי ב<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבויות עכבר המעיים קריפטה Organoid

Summary

organoids קריפטה מעי הדק תרבית ex vivo לספק מערכת תרבית רקמה שמשחזרת צמיחה של מאורות תלויים בתאי גזע והנישה שלהם. הקמנו שיטה לassay הפרופיל המטבולי בזמן אמת בorganoids קריפטה עכבר העיקרי. מצאנו organoids לשמור על מאפיינים פיסיולוגיים שהוגדרו על ידי המקור שלהם.

Abstract

רירית המעי הקטנה מציגה ארכיטקטורה חוזר על עצמו מחולק לשני מבנים בסיסיים: villi, מקרינים לתוך חלל המעי ומורכב מenterocytes הבוגר, תאי גביע ותאי enteroendocrine; ובכוכים, המתגוררים הפרוקסימלי לsubmucosa וmuscularis, חסת גזע בוגרים ובתאים ותאים הבוגר פנט, כמו גם סטרומה ותאי חיסון של מייקרו-סביבת קריפטה. עד השנים האחרונות, במחקרי מבחנה של מעי דק היה מוגבל לשורות תאים שמקורם בגידולים או שפיר או ממאיר, ואינו מייצג את הפיסיולוגיה של אפיתלים מעיים רגילים ואת השפעתם של מייקרו-הסביבה שבה הם מתגוררים. הנה, אנחנו מדגימים שיטה המותאמת מאל סאטו ואח. (2009) לculturing organoids קריפטה העיקרי מעיים עכבר נגזר מעכברי C57BL / 6. בנוסף, אנו מציגים את השימוש בתרבויות organoid קריפטה לassay הפרופיל המטבולי קריפטה בזמן אמת על ידי מדדment של הצריכה בסיסית חמצן, קצב glycolytic, ייצור ATP ויכולת נשימה. Organoids לשמור על מאפיינים שהוגדרו על ידי המקור שלהם ולשמר היבטים של ההסתגלות המטבולית שלהם באו לידי ביטוי בצריכת חמצן ושיעורי החמצה תאיים. מחקרים מטבוליים בזמן אמת בorganoid מערכת תרבות קריפטה זה הם כלי רב עוצמה כדי לחקור את חילוף החומרים של אנרגיית organoid קריפטה, ואיך זה יכול להיות מווסת על ידי גורמים תזונתיים ותרופתיים.

Introduction

סרטן מעי גס (CRC) הוא הגורם המוביל השלישי של מקרי מוות מסרטן הקשורים בארצות הברית. סרטן מעי גס לא סדיר - כלומר, שנובע מאוחר יותר בחיים (> 50 שנים) וללא גורמים גנטיים לנטייה ברורה - חשבונות ל~ 80% מכל המקרים, עם שכיחות מאוד מושפעות דפוסי תזונה ארוך טווח ^1,2. גידולים אלה תערוכת משמרת חילוף חומרים לכיוון התלות בגליקוליזה חמצוני, הידוע בשם האפקט ורבורג, שעשוי בחלק לעשות ריכוזים גבוהים יותר של בלוקים סלולריים בניין זמינים ואנרגיה (באמצעות glutaminolysis) להתיר ואולי לנהוג שיעור גבוה של תאים סרטניים התפשטות ^3-5 . מחקרים של סרטן המעי הגס, כמו גם סוגי סרטן אחרים במערכת העיכול, כולל סרטן המעי דק מספקים תובנה חשובה לסיבת היווצרות גידול. חוקר את ההבדלים מטבוליים בין מדינות נורמליות, פרו-סרטניות וסרטניות של מערכות איברים במערכת העיכול עשוי לסייע determination של סיכון יחסי להתפתחות גידולים, כמו גם גילוי המוקדם של גידולים. יתר על כן, הבנת חילוף חומרים ביו-אנרגטיים הכוללים נשימה וגליקוליזה המיטוכונדריה תספק תובנה בסיסית לתוך איך מדינת פיזיולוגיה של תא, הזדקנות והמחלה מדאיגה את הומאוסטזיס מעיים. ניצול של טכנולוגית assay ביו-האנרגיה לניתוח שטף תאי יכול להעריך את השיעורים של נשימה וגליקוליזה המיטוכונדריה בו זמנית בתאי גידול בתרבות בזמן אמת ^6,7.

עד לאחרונה, מחקרים במבחנה של מעי דק היו מוגבלים לשורות תאים שמקורם בגידולים או שפיר או ממאיר ^8,9 ואינו מייצגים את הפיסיולוגיה של אפיתלים מעיים רגילים ואת השפעתם של מייקרו-הסביבה שבה הם מתגוררים. בשינה 2009, סאטו et al. ¹⁰ הציג מערכת ex vivo תרבות לגדול organoids אפיתל במעי עכבר תלת-ממדי (3D), או epith"מיני-אומץ" elial, מתאים לחקירות ניסיוניות, אבחון וטיפול ^10,11. יתר על כן, מאורות מבודדים מעכברים מוגבלים calorically לשמור על מאפייני הצמיחה שינו כorganoids בתרבויות כגון ^12. בהשוואה לשורות תאים הפכו, ניתן להשתמש תרבויות organoid קריפטה להפיק נתונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית הצגת מודל הרבה יותר טוב כדי להבין את מצב in vivo.

מתאמנים את טכנולוגיית ניתוח ביו-אנרגיה לassay חילוף חומרים של אנרגיה של organoids קריפטה מעיים. organoids קריפטה המעיים העכבר היה בתרבית ex vivo לפתח מחקרי חילוף חומרים של אנרגיית קריפטה organoid הוצגו. שיעור צריכת החמצן (OCR) והמחיר תאי החמצה (ECAR) של organoids קריפטה נמדדו בהעדר ונוכחותם של שני מעכבים שונים חילוף חומרים (oligomycin, rotenone) ונושאת יון (ציאניד-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone קרבוניל). Orga קריפטהתגובה המטבולית noid לתרכובות כימיות אלה באו לידי ביטוי בהצלחה באמצעות ECAR משתנה וערכי OCR.

מחקרים ביו-אנרגטיים תאיים יבהירו את יחסי הגומלין ההדדיים בין מצב מטבולים וסיכון למחלות ופנוטיפ בסרטן, השמנת יתר, סוכרת, הפרעות בחילוף חומרים ומחל מיטוכונדריאליות ולעזור שיטות הקרנה מראש עם השלכות ישירות על רפואת translational. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבודד את מאורות מעי דקים וorganoids קריפטה התרבות. יתר על כן, אנו מציגים שיטה חדשה לשימוש תרבויות organoid קריפטה למבחנים מטבולים.

Protocol

מחקר זה בוצע בהתאם להמלצות במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות. הפרוטוקול אושר על ידי הוועדה לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של אלברט איינשטיין קולג 'לרפואה.

1. בידוד קריפטה ותרבות

1. בידוד של מאורות מהמעי הדק:
   1. לבודד מאורות מעיים מכל מודל עכברים של עניין. להרדים את העכברים עם CO ₂ ואחריו נקע בצוואר הרחם.
   2. פתח את בטן אורכית ולמלא את המעי דק (SI) עם פוספט הקר כקרח שנאגרו, PBS (-Ca ^{2 +;} -Mg ²⁺⁾ עם (אנטי-אנטי) אנטיביוטיקה antimycotic 2x. מהירות לבודד מעי דק.
   3. ביסודיות לנתח ללא שומן mesenteric באמצעות אזמל. היזהר שלא לנקב את הרקמה - בכל העת לשמור על הרקמה לחה עם PBS הקר כקרח. פתח את inteStine אורכית ולשטוף ביסודיות עם קרח הקר PBS.
   4. חותך מעי דק לשני חלקים ולרדד באמצעות קצה צמר גפן רטוב, בעדינות לגרד את villi באמצעות שקופיות מקוררות מראש. לשטוף במרץ כמה פעמים PBS קר כקרח.
   5. דגירה 3 דקות ב 20 מיליליטר 1x PBS לכל חומצת ethylenediaminetetraacetic 3 מ"מ (EDTA) /0.5 dithiothreitol מ"מ (DTT) לניתוק אינו אנזימטית של הרקמה.
   6. חיתוך ברקמה לחתיכות קטנות (2-4 מ"מ) באמצעות סכין גילוח בשקופית מקורר מראש. העבר את החתיכות לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר קר PBS קרח.
   7. פיפטה מעלה ומטה בעדינות 10x באמצעות פיפטה חד פעמית סטרילי 10 מיליליטר. בואו ברי רקמה משקעים על ידי כוח הכבידה. הסר את supernatant עם טפטפת. חזור שלוש פעמים נוספות; להפוך את supernatant בטוח הוא ברור.
   8. להוסיף 20 מיליליטר של PBS לכל 2 מ"מ EDTA. מערבולת ודגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם נדנדה עדינה.
   9. בואו משקעי רקמות ולהשליך supernatant. להוסיף 15 מיליליטר קרח PBS ופיפטה הקריםלמעלה ולמטה 5x עם פיפטה 10 מיליליטר. בואו ברי רקמת משקעים ולאסוף את supernatant כבר 1 (F1). חזור על איסוף F2-F5, כל חלקן בנפרד.
   10. להוסיף 15 מיליליטר קרח הקר PBS ולרעוד הפעם במרץ ביד במשך 15 שניות. לאסוף F6 ולחזור לF7, F8. אם חתיכות רקמה מתחילות לצוף, הקש כדי לעזור להם להתיישב.
   11. בדוק aliquot של כל חלק מתחת למיקרוסקופ. בריכת שברים המכילים כוכים.
   12. להעביר את השברים ונקוו דרך מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר, איסוף מאורות בשפופרת 50 מיליליטר.
   13. צנטריפוגה בלמשך 5 דקות 100 XG ב 4 מעלות צלזיוס, זורקת את כדור supernatant וגלול ב-10 PBS קר כקרח מיליליטר עם מאורות אנטי-אנטי והעברת 2x לצינור 15 מיליליטר. חזור על לשטוף עוד פעם אחת.
   14. שטוף את מאורות פעם אחת עם 10 מיליליטר ADF קר כקרח, מתקדם DMEM / ("נשר בינוני / חם של שינוי" Dulbecco של F-12) F-12 - 2x אנטי-אנטי.
   15. שטוף את מאורות פעם אחת עם 10 מיליליטרDF - 1x אנטי-אנטי.
   16. לספור את מאורות באמצעות hemocytometer. התאם את קריפטה פתרון הנפח ומעביר לצינור 1.5 מיליליטר, כך שריכוז קריפטה הסופי כאשר resuspended יהיה 100-500 מאורות לכל 50 μl של תערובת דביקה חלבון (Matrigel). צנטריפוגה בלמשך 5 דקות 100 XG ב 4 מעלות צלזיוס ומאורות גלולים בתערובת החלבונים הדביקה.
   17. צלחת 50 μl של קריפטה - השעיה תערובת חלבונים דביקה לכל גם בצלחת 24 גם (אזור גידול: ² סנטימטר 2), הצבה בזהירות טיפת ההשעיה במרכז כל אחד. לשמור את הצלחת בCO _2, 37 ° C חממה ל~ 30 דקות עד שההשעיה מתמצקת.
   18. הוסף 500 מדיה μl תרבות השלמה קרה כקרח (מתקדם DMEM / F12 עם אנטי 1x - אנטי, 10 מ"מ 4 (2-hydroxyethyl) חומצת -1-piperazineethanesulfonic (HEPES), 1x Glutamax, מוסף 1x B27, מוסף 1x N2, 1 מ"מ N-Acetyl-L-ציסטאין ng / ml (NAC), 50 ng / ml גורם גדילה באפידרמיס (EGF), 100גולגולת של, R-Spondin 500 ng / ml).
       1. מחדש גורמי גדילה ב0.1% הסרום אלבומין שור (BSA) ב- PBS.
2. קריפטה Organoid תרבות ומעבר:
   1. organoids קריפטה לאחר זריעת 14-21 יום מעבר (או לפי צורך) באופן הבא:
      1. תקשורת שינוי בכל יום שישי וביום שני. בימי רביעי, להחליף מחצית התקשורת עם תקשורת טרי.
   2. הסר את מדיום התרבות. לשטוף את המדגם פעמיים עם 500 μl PBS ב 5 דקות במרווחים.
   3. הסר PBS ועדינות לשבור את תערובת חלבונים הדביקה באמצעות קצה פיפטה מייקר P1000 סטרילי.
   4. הוסף מדיה תרבות 1 מיליליטר מלאה וליחיד וresuspend organoids ב 1 מיליליטר תקשורת.
   5. בעדינות לשבש organoids באמצעות P1000 על ידי pipetting למעלה ולמטה 20-30x (לבדוק מתחת למיקרוסקופ לניתוק organoid נכון עם תשואת קריפטה טובה עד שיטה עקבית מפותח).
   6. העבר את המאורות לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge;צנטריפוגות ב 100 XG ב 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות.
   7. שטוף את הכדור פעמיים עם 1 מיליליטר תקשורת ותרבות שלמה.
   8. פיצול ביחס של 1: 3 או 1: 6 במידת צורך מאורות resuspending, ב -50 μl Matrigel לכל טוב. המשך כפי שתואר לעיל (סעיף 1.1.16-18).
3. הקפאת Organoid קריפטה:
   1. הסר את מדיום התרבות. לשטוף את המדגם ב500 μl PBS.
   2. לפזר את תערובת חלבונים הדביקה באמצעות קצה פיפטה P1000.
   3. הוסף 1 מיליליטר תקשורת ולאחת וresuspend organoids ב 1 מיליליטר תקשורת.
   4. בעדינות לשבור את organoids באמצעות P1000 על ידי pipetting למעלה ולמטה 20-30x.
   5. העבר את organoids לצינור 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב 100 XG ב 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות.
   6. שטוף את הכדור פעמיים עם 1 מיליליטר תקשורת ותרבות שלמה.
   7. מאורות גלולים ב500 μl הקפאת תקשורת.
   8. העברת מאורות לcryotube, במקום הצינור במכל וחנות הקפאה ב-80 ° C מקפיא overnight.
   9. העבר את הכוכים לN ₂ טנק נוזלי.
      1. לשחזר organoids קריפטה קפואה במהירות הפשרה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לשטוף עם 500 μl מדיה מלאה תרבות אחת, צנטריפוגות ב 100 XG, 5 דקות וגלולות בתערובת חלבונים דביקה, ותרבות כפי שתואר לעיל. להתאוששות טובה יותר, להוסיף מעכב רוק (Y-27632) לתקשורת ההקפאה.

2. קריפטה Organoid מטבוליזם Assay

1. הכנת צלחת 24 גם:
   1. לבודד ולספור מאורות בהתאם לפרוטוקול (ראה סעיף 1.1 לבידוד קריפטה וסעיף 1.2 למעבר קריפטה).
   2. מאורות גלולים בתערובת חלבונים דביקה (100-200 מאורות לכל 20 μl).
   3. השעיה צלחת קריפטה-דביקה תערובת חלבונים בצלחת 24 גם assay (לוודא שיש בtriplicates לפחות עבור כל דגימה) ולאפשר ההשעיה לבסס על 37 מעלות צלזיוס בCO ₂חממה; לאחר מכן להוסיף 500 μl תקשורת ותרבות השלמה.
   4. מאורות תרבות (כמפורט בסעיף 1.1) ולבחון תחת מיקרוסקופ עד מאורות לגדול לתוך organoids פותח באופן מלא.
2. תאי השטף Assay:
   1. מחסנית מימה הלילה _ב2 אינם CO (0% CO _2), 37 ° C חממה.
   2. הסר את מדיום התרבות ולשטוף organoids פעמיים עם 500 DMEM μl (בלי: גלוקוז, L- גלוטמין, פירובט נתרן וסודיום ביקרבונט, ועם: פנול אדום). חכה 5 דקות.
   3. להוסיף 675 μl לבינוני גם assay (DMEM עם 2 המ"מ L- גלוטמין ו5 מ"מ D-גלוקוז) זה טוב.
   4. בדוק המורפולוגיה המיקרוסקופית organoids קריפטה כדי להבטיח שorganoids ותערובת החלבונים הדביקה לא ניזוקו לאחר שטיפה. דגירה 1 שעה שבאינו CO _2, 37 ° C חממה.
   5. הכן 10 מיקרומטר תרכובות להזרקה (oligomycin, קרבוניל ציאניד-p-trifluoro-פניל-hydrazone methoxy (FCCP), rotenone) במדיום assay.
   6. הגדרת המחסנית על ידי טעינת 75 μl של 10 מיקרומטר תרכובות להזרקה ליציאות ברצף המחסנית: נמל - oligomycin; הנמל B - FCCP; והנמל C - rotenone (הריכוזים הסופיים במהלך assay יהיה 1 מיקרומטר).
   7. דגירה דקות 30 מחסנית - שעת 1 ב 37 ° C בחממת _2-CO שאינה.
   8. במקביל, מפעיל את מנתח XF וליצור תבנית פרוטוקול assay.
   9. הנח מחסנית וצלחת שירות לXF Analyzer ולהפעיל "לכייל" מחסנית.
   10. בדוק organoids קריפטה מיקרוסקופית כדי לוודא שהם מחוברים לתערובת החלבונים הדביקה.
   11. צלחת תרבית תאי עומס לפרוטוקול assay המכשיר ולהפעיל.

תוצאות

organoids קריפטה הוקמו מ8 חודש C57BL / 6 עכברים ישנים האכיל מטוהר דיאטה מכרסם מכון לתזונת 76A (AIN76A) אמריקאי. ניתן לגדל organoids קריפטה מעיים בתרבות לפרקי זמן ארוך מכוך בודד (איור 1 א, חץ אדום יחיד). Organoids לצמוח מתוך מבנים דמויים מערים ב18-20 ימים בתרבות (איור 1, חיצים אד?...

Discussion

בדקנו את שיעור צריכת חמצן (OCR) והמחיר תאי החמצה (ECAR) של מאורות מבודדים מעכברים בן 8 חודשים וגדלו והפכו לorganoids ex vivo. לאחר המדידה של קצב הבסיסי, חילוף החומרים קריפטה הוערך על ידי הוספת oligomycin, ציאניד קרבוניל -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) וrotenone, ברצף.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free	BD Biosciences	356231
PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2	Life Technologies	20012-027
Advanced DMEM/F-12 (1x)	Life Technologies	12634-028
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium w/o glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	D5030
Phenol red sodium salt	Sigma-Aldrich	P4758	Final Concentration 15 mg/l in DMEM (D5030) - step 2.2.2
Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml	Life Technologies	15240-062	Final concentration 1x or 2x
Penicilin-Streptomycin, liquid	Life Technologies	15140-122	Final concentration 1x
Gibco® GlutaMAX™ supplement	Life Technologies	35050061	Final concentration 1x
Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M	Life Technologies	15630-080	Final concentration 10 mM
N-acetyl-L-cysteine, 25 g	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Final concentration 1 mM
100x N-2 supplement, liquid	Invitrogen	17502-048	Final concentration 1x
50x B-27® supplement minus Vitamin A, liquid	Invitrogen	12587-010	Final concentration 1x
Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50 μg	R&D Systems	3474-RS-050	Final concentration 500 ng/ml
Recombinant Murine EGF, 100 μg	Peprotech	315-09	Final concentration 50 ng/ml
Recombinant Murine Noggin, 20 μg	Peprotech	250-38	Final concentration 100 ng/ml
Gibco® L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Final concentration 2 mM
Gibco® glucose powder	Life Technologies	15023-021	Final concentration 5 mM
Ambion® 0.5 M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0	Life Technologies	AM9260G	Final concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8
[header]
DTT (dithiothreitol), 1M	Life Technologies	P2325	Final concentration 3 mM
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	0.1% in PBS
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044	1% in PBS
Recovery™ Cell Culture Freezing Medium	Life Technologies	12648-010
ROCK inhibitor (Y-27632)	Sigma-Aldrich	Y0503	Final concentration 10 μM
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	Final concentration 1 μM
Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	Final concentration 1 μM
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Final concentration 1 μM
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465	Final concentration 0.1 N in PBS
XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)	Seahorse Bioscience