における代謝プロファイルのリアルタイム分析<em&gt;エクスビボ</em&gt;マウス腸陰窩オルガノイド培養

要約

小腸の陰窩オルガノイド培養ex vivoで幹細胞およびそれらのニッチに依存する陰窩の成長を再現する組織培養系を提供する。私たちは、初代マウス陰窩オルガノイドリアルタイムで代謝プロフィールをアッセイする方法を確立した。私たちは、オルガノイドは、それらのソースで定義された生理学的特性を維持した。

要約

腸管腔に突出し、絨毛および成熟した腸細胞、杯細胞および腸内分泌細胞から成る;小腸粘膜は、2つの基本的な構造に編成され、繰り返しのアーキテクチャを示し、及び陰窩、粘膜下層および筋の近位に常駐成体幹細胞および前駆細胞を保有し、パネート細胞成熟、ならびに間質および陰微小環境の免疫細胞。ここ数年までは、小腸のin vitro試験で 、良性または悪性のいずれかで腫瘍に由来する細胞株に限定されていた、と正常な腸上皮の生理学および、それらが存在する微小環境の影響を表すものではありませんでした。ここでは、佐藤らから適応する方法を実証している。（2009）C57BL / 6マウス由来の初代マウス腸陰窩オルガノイドを培養する。さらに、メジャーによってリアルタイムに陰窩代謝プロファイルをアッセイする陰窩オルガノイド培養物の使用を提供する基礎酸素消費、解糖率、ATP産生および呼吸容量のメント。オルガノイドは、それらのソースで定義された特性を維持し、酸素消費量と細胞外酸性化率で反射されたそれらの代謝適応の側面を保持している。この陰窩オルガノイド培養系におけるリアルタイム代謝研究は、陰窩オルガノイドエネルギー代謝を研究するための強力なツールであり、それは、栄養および薬理学的因子によって調節することができる方法。

概要

結腸直腸癌（CRC）は、米国における癌関連死亡原因の第3位である。それが人生の後半で生じたすなわち （> 50歳）と、明確な素因遺伝因子を持つ- -散発大腸癌強く、長期的食事パターン^1,2の影響を受けて発生率が全症例の〜80％ ​​を占め、。これらの腫瘍は、腫瘍細胞増殖^3-5の高率を可能にし、おそらく駆動するために部分的に（グルタミノリシスを介して）利用可能な細胞のビルディングブロックとエネルギーのより高い濃度を行うことがワールブルク効果として知られている酸化的解糖への依存性に向けた代謝シフトを呈する。小腸癌を含む大腸癌の研究、ならびに他の胃腸癌は、腫瘍形成の原因に重要な洞察を提供する。 DETのを支援することができる胃腸器官系の、通常のプロ腫瘍形成及び腫瘍形成状態間の代謝の違いを調査腫瘍発生の相対リスクだけでなく、新生物の早期発見のermination。また、ミトコンドリア呼吸と解糖が関与する生体エネルギー代謝を理解することは、細胞生理学、老化や病気の状態が腸の恒常性を乱す方法に根本的な洞察を提供します。細胞外フラックス解析のための生体エネルギーアッセイ技術の利用は、リアルタイムで^6,7、培養中で増殖する細胞で同時にミトコンドリアの呼吸と解糖の速度を評価することができます。

最近まで、小腸のin vitro試験で ^8,9良性または悪性のいずれかの腫瘍由来の細胞株に限定されていましたし、正常な腸上皮の生理学および、それらが存在する微小環境の影響を表すものではありませんでした。 2009年には、佐藤らは ^、10は、3次元（3D）マウス腸管上皮オルガノイド、またはepithを成長させるex vivoで培養システムを導入、実験的な診断および治療 ​​の研究^10,11に適しelial「ミニ根性」、。また、カロリー制限されたマウスから単離された陰窩は、このような培養物¹²におけるオルガノイドとしての改変された成長特性を維持する。形質転換細胞株と比較して、陰窩オルガノイド培養物は、 インビボでの状態を理解することがはるかに優れたモデルを提示し、生理学的に関連するデータを生成するために使用することができる。

我々は、腸陰窩オルガノイドのエネルギー代謝をアッセイするために生体エネルギー分析技術に適合。マウス腸の陰窩オルガノイドは、提示さ陰窩オルガノイドエネルギー代謝研究を開発するためにex vivoで培養した。陰窩オルガノイドの酸素消費速度（OCR）および細胞外酸性化率（ECAR）の非存在下および存在下つの異なる代謝阻害剤（オリゴマイシン、ロテノン）のイオンキャリア（カルボニルシアニド-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン）で測定した。陰窩orgaがこれらの化学化合物へのNOID代謝反応が正常に変化ECARとOCRの値を通して反映された。

セルラー生体エネルギー研究は、癌、肥満、糖尿病、代謝性疾患およびミトコンドリア病で代謝状態および疾患リスクと表現型の間の相互の相互作用を解明および翻訳医学のための直接的な意味合いを持つ事前スクリーニング方法を助ける。ここでは、小腸陰窩を分離し、培養陰窩オルガノイドにするための詳細なプロトコルを記述します。また、我々は、代謝アッセイのためのcryptオルガノイドの文化を使用するための新規な方法をご紹介します。

プロトコル

この研究は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針の推奨に従って行った。プロトコルは、アルベルト·アインシュタイン医学校の動物実験の倫理委員会によって承認された。

1.陰窩単離および培養

1. 小腸から陰窩の単離：
   1. 関心のある任意のマウスモデルから腸陰窩を分離します。頸椎脱臼に続いてCO ₂を持つマウスを安楽死させる。
   2. 縦方向に腹部を開き、氷冷リン酸緩衝生理食塩水、PBS（-Ca ²⁺ -Mg ^2+）と小腸（SI）を埋める2倍の抗生物質-抗真菌（抗抗）で。急速に小腸を分離します。
   3. 徹底的にメスを用いて腸間膜脂肪の自由な解剖。組織を穿孔しないように注意してください - すべての回での氷冷PBSで湿った組織を保つ。 INTEを開く縦方向スタイン、氷冷PBSで徹底的に洗浄してください。
   4. 予冷されたスライドを使用して絨毛を掻き優しく、2セクションに小腸をカットし、湿った綿棒を使って平ら。氷冷PBS数回激しく洗う。
   5. 3mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）当たり20ミリリットル1×PBS中で3分間インキュベート/0.5 mMのは、組織の非酵素的解離のためにジチオスレイトール（DTT）。
   6. 予冷されたスライド上のカミソリの刃を使用して小片（2-4 mm）の中に組織を切断。 20ミリリットルの氷冷PBSを含む50ミリリットルチューブに作品を転送します。
   7. ピペットは、上下優しく10xの10ミリリットルの無菌の使い捨てピペットを用いて。組織片が重力によって沈降してみましょう。ピペットで上清を取り除きます。さらに3回繰り返します。上清が透明であることを確認してください。
   8. 2mMのEDTAあたり20mlのPBSを追加します。スワールとは穏やかに揺らしながら30分間、4℃でインキュベートする。
   9. 組織土砂を聞かせて、上清を捨てる。 15ミリリットルの氷冷PBSおよびピペットを追加上下5倍10ミリリットルピペットで。組織片が堆積しましょう​​と画分1（F1）として上清を収集します。 F2-F5キーを収集を繰り返し、各分画を別々に維持した。
   10. 15ミリリットルの氷冷PBSと、この時間は15秒間手で激しく振る追加。 F6キーを収集し、F7、F8のために繰り返します。組織片が浮いて起動した場合、彼らが定住を支援するをタップします。
   11. 顕微鏡下で各画分のアリコートを点検。陰窩を含む画分をプールする。
   12. 50ミリリットルチューブに陰窩を集め、70μmのナイロン細胞ストレーナーを通してプールした画分を渡します。
   13. 4℃で5分間100×gで遠心し、15mlチューブに2X抗抗転送陰窩と10ミリリットルの氷冷PBSに上清を再懸濁ペレットを捨てる。洗浄をもう一度繰り返します。
   14. 2X抗 - 抗 - 10ミリリットルの氷冷ADF、アドバンストDMEM / F-12（ダルベッコ "sは改変イーグル培地/ハム" S F-12）で一度陰窩を洗ってください。
   15. 10ミリリットルAで一回陰窩を洗うDFは - 抗 - 抗1倍。
   16. 血球計数器を用い陰窩を数える。陰窩溶液量を調整し、再懸濁させ、最終的な暗号濃度はゼラチン状タンパク質混合物（マトリゲル）を50μlあたり100〜500陰窩になるよう1.5mlチューブに移す。ゼラチン状のタンパク質混合物中で4℃、再懸濁陰窩で5分間100×gで遠心。
   17. 陰窩のプレートに50μl - 24ウェルプレート中でウェルあたりゼラチン状のタンパク質混合懸濁液（成長分野：2 cm ^2）を 、慎重に各ウェルの中央にサスペンションの低下を置く。 CO ₂に懸濁液が固化〜30分まで、37℃のインキュベーターをプレートを維持する。
   18. 抗、10 mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、1xのグルタMAX、1X B27サプリメント、1×N2サプリメント、1 mMの - 500μlの氷冷完全培養培地（1×抗による高度なDMEM / F12を追加N-アセチル-L-システイン（NAC）、50ng / mlの上皮増殖因子（EGF）、100ng / mlのノギン、500 / mlのRスポンジン）。
       1. PBS中の0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）中で増殖因子を再構成する。
2. 陰窩オルガノイド文化とパッセージ：
   1. 通過陰窩オルガノイド14-21日後に播種（または必要に応じて）次のように：
      1. 変化媒体毎週金曜日と月曜日。水曜、新鮮な培地で半分メディアを交換。
   2. 培養液を除去します。 5分間隔で500μlのPBSで2回サンプルを洗ってください。
   3. PBSを外し、静かに滅菌P1000マイクロピペットチップを使用したゲル状のタンパク質混合物を壊す。
   4. 単一のウェルに1ミリリットルの完全培養培地を追加し、1ミリリットルのメディアにおけるオルガノイドを懸濁します。
   5. 優しく（一貫性のある技術が開発されるまでの良い暗号収量との適切なオルガノイド解離のために顕微鏡下で確認してください）​​にピペッティングによって20-30xダウンP1000を使用してオルガノイドを混乱させる。
   6. 1.5ミリリットルマイクロチューブへ陰窩を移す。4℃、5分で100×gで遠心する。
   7. 1ミリリットルの完全培養培地で二回ペレットを洗浄。
   8. 3または1：1の割合で分割6必要に応じて、ウェルあたり50μlのマトリゲルにおける陰窩を再懸濁する。 （ セクション1.1.16-18）、上述のように実行します。
3. 墓所オルガノイド凍結：
   1. 培養液を除去します。 500μlのPBSにサンプルを洗ってください。
   2. P1000のピペットチップを用いてゲル状のタンパク質混合物を分散させる。
   3. 単一のウェルに1ミリリットルのメディアを追加し、1ミリリットルのメディアにおけるオルガノイドを懸濁します。
   4. 優しく上下20-30xピペッティングすることによりP1000を使用してオルガノイドを破る。
   5. 1.5ミリリットルチューブにオルガノイドを転送します。 4℃、5分で100×gで遠心。
   6. 1ミリリットルの完全培養培地で二回ペレットを洗浄。
   7. メディアを凍結500μlの中で再懸濁陰窩。
   8. クライオチューブへの転送陰窩は、-80℃の冷凍庫overniに冷凍コンテナとストア内チューブを配置GHT。
   9. 液体N ₂タンクに陰窩を転送します。
      1. 急速に37℃の水浴中で解凍し凍結した陰窩オルガノイドを回復します。前述のように100×gで、ゼラチン状のタンパク質混合物中で5分間再懸濁し、文化で500μlの完全培養ワンスメディア、遠心分離機を洗ってください。より良い回復のために、凍結メディアにROCK阻害剤（Y-27632）を追加します。

2.クリプトオルガノイド代謝アッセイ

1. 24ウェルプレートの調製：
   1. （陰窩通過のためのcrypt分離およびセクション1.2のためのセクション1.1を参照）のプロトコルに従って陰窩を隔離してカウントされます。
   2. ゼラチン状のタンパク質混合物中の再懸濁陰窩（20μLあたり100-200陰窩）。
   3. 24ウェルアッセイプレートにおけるプレートのcrypt-ゼラチン状タンパク質混合懸濁液（各サンプルについて少なくとも三連であることを確認してください）とサスペンションは、CO _2、37℃で固化することができますインキュベーター。その後500μlの完全な培養培地を追加します。
   4. 文化陰窩（ セクション1.1で説明したように）と陰窩は完全に開発オルガノイドへと成長するまで、顕微鏡下で観察する。
2. 細胞外フラックスアッセイ：
   1. 一晩非CO ₂水和物カートリッジ（0％CO _2）、37℃のインキュベーター。
   2. 培地を除去し、500μlのDMEMで二回オルガノイドを洗浄（なし：グルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム及び重炭酸ナトリウム;及び付き：フェノールレッド）。 5分待ちます。
   3. 各ウェルにウェルのアッセイ培地（2 mM L-グルタミンおよび5mM D-グルコースを含むDMEM）あたり675μlを添加する。
   4. オルガノイドとゼラチン状のタンパク質混合物は、洗浄の後に無傷であることを確実にするために、陰窩オルガノイド微視的形態を確認してください。非CO _2、37℃のインキュベーター内で1時間インキュベートする。
   5. 10μMの注射可能な化合物（オリゴマイシン、カルボニルシアニド-Pトリフルオロメトキシフェニル - ヒドラゾン（FCCP）を準備し、Rotenone）アッセイ培地中。
   6. セットアップカートリッジをカートリッジ順次ポートに10μMの75μlの注入可能な化合物をロードすることによって：ポートA - オリゴマイシン。ポートB - FCCP。そしてポートC - ロテノン（アッセイ中の最終濃度は、1μMとなります）。
   7. カートリッジ30分間インキュベートする- 37℃で1時間、非CO ₂インキュベーター中。
   8. 同時に、XFア​​ナライザをオンにし、アッセイプロトコルテンプレートを作成します。
   9. XFアナライザーにカートリッジとユーティリティプレートを置き、カートリッジを「キャリブレーション」を実行します。
   10. 彼らはゼラチン状のタンパク質混合物に添付されていることを確認するために顕微鏡的に陰窩オルガノイドを確認してください。
   11. 計器および実行アッセイプロトコルにロード細胞培養プレート。

結果

墓所オルガノイドは、8ヶ月齢のC57BL / 6マウスから樹立し、栄養76A（AIN76A）の齧歯類ダイエットアメリカの協会で精製供給した。腸の陰窩オルガノイドは、単一のcrypt（ 図1A、シングル赤矢印）から長期間培養で増殖させることができる。オルガノイド培養物（ 図1B、赤い矢印）で18-20日で暗号のような構造を成長させる。陰窩は3週間毎に継代し、オルガノイドを効率...

ディスカッション

我々は、カルボニルシアニド、基礎速度の測定後、陰窩代謝オリゴマイシンを添加することにより評価した。ex vivoで 8ヶ月齢のマウスから単離した陰窩の酸素消費速度（OCR）および細胞外酸性化率（ECAR）を試験し、オルガノイドに成長順次-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）およびロテノン、。

29分（ 図2Aおよび2B） - OCR基底および基底ECAR ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free	BD Biosciences	356231
PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2	Life Technologies	20012-027
Advanced DMEM/F-12 (1x)	Life Technologies	12634-028
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium w/o glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	D5030
Phenol red sodium salt	Sigma-Aldrich	P4758	Final Concentration 15 mg/l in DMEM (D5030) - step 2.2.2
Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml	Life Technologies	15240-062	Final concentration 1x or 2x
Penicilin-Streptomycin, liquid	Life Technologies	15140-122	Final concentration 1x
Gibco® GlutaMAX™ supplement	Life Technologies	35050061	Final concentration 1x
Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M	Life Technologies	15630-080	Final concentration 10 mM
N-acetyl-L-cysteine, 25 g	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Final concentration 1 mM
100x N-2 supplement, liquid	Invitrogen	17502-048	Final concentration 1x
50x B-27® supplement minus Vitamin A, liquid	Invitrogen	12587-010	Final concentration 1x
Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50 μg	R&D Systems	3474-RS-050	Final concentration 500 ng/ml
Recombinant Murine EGF, 100 μg	Peprotech	315-09	Final concentration 50 ng/ml
Recombinant Murine Noggin, 20 μg	Peprotech	250-38	Final concentration 100 ng/ml
Gibco® L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Final concentration 2 mM
Gibco® glucose powder	Life Technologies	15023-021	Final concentration 5 mM
Ambion® 0.5 M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0	Life Technologies	AM9260G	Final concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8
[header]
DTT (dithiothreitol), 1M	Life Technologies	P2325	Final concentration 3 mM
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	0.1% in PBS
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044	1% in PBS
Recovery™ Cell Culture Freezing Medium	Life Technologies	12648-010
ROCK inhibitor (Y-27632)	Sigma-Aldrich	Y0503	Final concentration 10 μM
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	Final concentration 1 μM
Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	Final concentration 1 μM
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Final concentration 1 μM
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465	Final concentration 0.1 N in PBS
XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)	Seahorse Bioscience