Tempo real Análise do Perfil metabólico em<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas mouse Intestinal Crypt organóide

Resumo

Pequenas Organóides cripta intestinal cultivadas ex vivo, proporcionam um sistema de cultura de tecidos que recapitula o crescimento das criptas dependentes de células-tronco e seu nicho. Foi estabelecido um método para ensaiar o perfil metabólico em tempo real em Organóides das criptas do rato primária. Encontramos Organóides manter as propriedades fisiológicas definidas por sua origem.

Resumo

A mucosa do intestino delgado apresenta uma arquitetura repetitivo organizado em duas estruturas fundamentais: vilosidades, projetando para o lúmen intestinal e composto por enterócitos maduros, células caliciformes e células enteroendócrinas; e criptas, residentes proximal para a submucosa e muscularis, abrigando estaminais adultas e nas células progenitoras e células de Paneth madura, bem como do estroma e as células imunes do microambiente cripta. Até aos últimos anos, estudos in vitro do intestino delgado foi limitado a linhas celulares derivadas de tumores benignos ou malignos, e não representam a fisiologia do epitélio intestinal normal e a influência do microambiente em que residem. Aqui, demonstramos um método adaptado de Sato et al. (2009) para a cultura de Organóides das criptas intestinais do rato primárias derivadas de ratinhos C57BL / 6. Além disso, apresentamos a utilização de culturas organóide cripta para analisar o perfil metabólico cripta em tempo real por medidamento do consumo basal de oxigênio, a taxa glicolítica, a produção de ATP e da capacidade respiratória. Organóides manter as propriedades definidas por sua origem e reter os aspectos de sua adaptação metabólica refletido pelo consumo de oxigênio e taxas de acidificação extracelular. Estudos metabólicos em tempo real no presente cripta organ�de sistema de cultura são uma ferramenta poderosa para estudar o metabolismo da energia organ�de cripta, e como ela pode ser modulado por factores nutricionais e farmacológicas.

Introdução

O câncer colorretal (CCR) é a terceira principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos. Câncer de cólon esporádico - ou seja, que resulta mais tarde na vida (> 50 anos de idade) e sem fatores predisponentes genéticos claras - contas para ~ 80% de todos os casos, com incidência fortemente influenciada por padrões alimentares a longo prazo ^1,2. Estes tumores exibem um desvio metabólico no sentido para a glicólise oxidativo, conhecido como o efeito de Warburg, que pode, em parte, tornar as concentrações mais elevadas de blocos de construção celulares e energia disponíveis (através glutaminolysis) para permitir a conduzir e, talvez, as altas taxas de proliferação de células tumorais ^3-5 . Estudos de câncer de cólon, bem como outros cânceres gastrointestinais, incluindo cânceres do intestino delgado fornecer informação importante sobre a causa da formação de tumores. Investigando as diferenças metabólicas entre os estados normais, pró-tumorigênicos e tumorigênicos de sistemas de órgãos gastrointestinais podem ajudar determination de risco relativo para o desenvolvimento do tumor, bem como a detecção precoce de neoplasia. Além disso, a compreensão do metabolismo bioenergético envolvendo respiração mitocondrial e da glicólise irá fornecer informações fundamentais sobre a forma como a fisiologia celular, o envelhecimento e as doenças estado perturba a homeostase intestinal. A utilização da tecnologia de ensaio para análise bioenergética fluxo extracelular pode avaliar as taxas de respiração mitocondrial e, simultaneamente, a glicólise em células que crescem em cultura em tempo real, ^6,7.

Até recentemente, os estudos in vitro de intestino delgado foram limitadas a linhas celulares derivadas de tumores benignos ou malignos ou ^8,9 e não representam a fisiologia do epitélio intestinal normal e a influência do microambiente em que residem. Em 2009, Sato et al. ¹⁰ introduziu um sistema de cultura ex vivo para crescer tridimensional do mouse (3D) Organóides intestinais epiteliais, ou epithElial "mini-coragem", adequado para investigações experimentais, diagnósticos e terapêuticos ^10,11. Além disso, criptas isolados de ratos sob restrição calórica manter suas propriedades de crescimento alterados como Organóides em tais culturas ^12. Em comparação com linhas celulares transformadas, culturas organ�de criptas pode ser usado para gerar os dados fisiologicamente relevantes que apresentem um modelo muito melhor para compreender o estado in vivo.

Nós adaptamos a tecnologia de análise bioenergética para ensaio de metabolismo energético de Organóides cripta intestinal. Rato cripta intestinal Organóides foram cultivadas ex vivo para desenvolver os estudos do metabolismo energético organóide cripta apresentados. A taxa de consumo de oxigénio (OCR) e a taxa de acidificação extracelular (ECAR) de Organóides criptas foram medidos na ausência e na presença de dois diferentes inibidores metabólicos (oligomicina, rotenona) e um transportador de iões (carbonil-cianeto de p-Trifluormetoxifenilidrazona). A cripta orgaresposta metabólica noid a estes compostos químicos foram refletidos com sucesso através da mudança ECAR e valores de OCR.

Estudos bioenergéticos celulares irá elucidar as interações recíprocas entre o estado metabólico e risco de doença e fenótipo em câncer, obesidade, diabetes, distúrbios metabólicos e doenças mitocondriais e ajudar métodos de rastreio antecipadamente com implicações diretas para a medicina translacional. Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para isolar pequenas criptas intestinais e Organóides cripta cultura. Além disso, introduzimos um novo método de usar culturas organóide cripta para ensaios metabólicos.

Protocolo

Este estudo foi realizado de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética de Experimentação Animal do Albert Einstein College of Medicine.

1. Crypt Isolamento e Cultura

1. O isolamento das criptas do intestino delgado:
   1. Isolar criptas intestinais de qualquer modelo de ratos de interesse. Euthanize os ratos com CO _2, seguida por deslocação cervical.
   2. Abra o abdômen longitudinalmente e encher o intestino delgado (SI) com soro fisiológico frio gelo fosfato tamponada, PBS (-Ca ^2+; Mg ²⁺⁾ com 2x antibiótico-antimicótico (anti-anti). Rapidamente isolar intestino delgado.
   3. Completamente dissecar livre de gordura mesentérica usando um bisturi. Tenha cuidado para não perfurar o tecido - em todos os momentos manter o tecido úmido com PBS gelado. Abra-se inteStine longitudinalmente e lavar cuidadosamente com PBS gelado.
   4. Corte intestino delgado em duas seções e achatar usando uma ponta de algodão molhado, raspe fora as vilosidades usando uma lâmina pré-resfriada. Lave vigorosamente em PBS gelado várias vezes.
   5. Incubar 3 min, em 20 ml de 1x PBS por 3 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) /0.5 mM de ditiotreitol (DTT) para a dissociação não-enzimática do tecido.
   6. Corte o tecido em pedaços pequenos (2-4 mm), usando uma lâmina de barbear em uma lâmina pré-resfriada. Transferem-se as peças em um tubo de 50 ml contendo 20 ml de PBS gelado.
   7. Pipeta cima e para baixo suavemente 10x utilizando uma pipeta de 10 ml descartável estéril. Vamos fragmentos de tecido sedimentar por gravidade. Retirar o sobrenadante com uma pipeta. Repita mais três vezes; certifique-se sobrenadante é clara.
   8. Adicionar 20 ml de PBS por EDTA 2 mM. Redemoinho e incubar a 4 ° C durante 30 min com agitação suave.
   9. Deixe sedimento de tecido e descartar o sobrenadante. Adicionar 15 ml de PBS gelado e pipetacima e para baixo de 5x com uma pipeta de 10 ml. Deixe os fragmentos de tecido de sedimentos e recolher o sobrenadante como Fração 1 (F1). Repetir recolha F2-F5, mantidas separadamente cada fracção.
   10. Adicionar 15 ml de PBS gelado e desta vez agitar vigorosamente à mão por 15 segundos. Colete F6 e repita para F7, F8. Se pedaços de tecido começar a flutuar, toque para ajudá-los a resolver.
   11. Inspeccionar uma aliquota de cada fracção sob o microscópio. Reunir as fracções contendo criptas.
   12. Passar as fracções reunidas através de um filtro de células de 70 mm de nylon, recolhendo criptas em um tubo de 50 ml.
   13. Centrifugar a 100 xg durante 5 min a 4 ° C, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 10 ml de PBS gelado com criptas anti-anti 2x e transferência para um tubo de 15 ml. Repetir a lavagem mais uma vez.
   14. Lave as criptas uma vez com 10 ml gelada ADF, Advanced DMEM / F-12 (Dulbecco "s Modified Eagle Medium / Ham" s F-12) - 2x anti-anti.
   15. Lavam-se as criptas uma vez com 10 ml UmaDF - 1x anti-anti.
   16. Conte as criptas utilizando um hemocitômetro. Ajustar o volume da solução cripta e transferir para um tubo de 1,5 ml, de modo que a concentração final quando cripta ressuspensas será 100-500 criptas por cada 50 uL de mistura de proteína gelatinosa (Matrigel). Centrifugar a 100 xg durante 5 min a 4 ° C e colocar a mistura em criptas proteína gelatinosa.
   17. Placa 50 ul de suspensão cripta - mistura gelatinosa proteína por poço numa placa de 24 poços (área de crescimento: 2 ^cm2), colocando cuidadosamente gota a suspensão no centro de cada poço. Manter a placa numa CO _2, 37 ° C incubadora durante ~ 30 min, até que a suspensão se solidifica.
   18. Adicionar 500 ul meios de gelo frio de cultura completo (Avançada DMEM / F12 com 1x anti - anti, 10 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES), GlutaMAX 1x, 1x suplemento B27, 1x suplemento N2, 1 mM N-acetil-L-cisteína (NAC), / ml de factor de crescimento epidérmico 50 ng (EGF), 100 ng / mlNoggin, 500 ng / ml de R-espondina).
       1. Reconstituir factores de crescimento em 0,1% de Albumina de Soro Bovino (BSA) em PBS.
2. Crypt organóide Cultura e Passage:
   1. Passagem Organóides criptas 14-21 dias após sementeira (ou conforme necessário) como se segue:
      1. Alterar mídia toda sexta-feira e segunda-feira. Às quartas-feiras, substitua metade da media com meio fresco.
   2. Remover o meio de cultura. Lava-se a amostra duas vezes com 500 ul de PBS a intervalos de 5 min.
   3. Remover PBS e quebrar delicadamente até a mistura gelatinosa de proteína usando um P1000 estéril micro ponteira.
   4. Adicionar 1 ml de meio de cultura completo para um único poço e ressuspender as Organóides em 1 ml de meio.
   5. Gentilmente interromper as Organóides usando um P1000 por pipetagem cima e para baixo 20-30x (verifique sob o microscópio para a dissociação organóide adequada com um bom rendimento cripta até uma técnica consistente é desenvolvido).
   6. Transferem-se as criptas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml;centrifugar a 100 xg a 4 ° C, 5 min.
   7. Lava-se a pelete duas vezes com 1 ml de meio de cultura completo.
   8. Dividir a uma razão de 1: 3 ou 1: 6, conforme necessário, ressuspensão criptas em 50 ul por poço de Matrigel. Proceda como descrito acima (seção 1.1.16-18).
3. Crypt congelamento organóide:
   1. Remover o meio de cultura. Lavar a amostra em 500 mL de PBS.
   2. Dispersa-se a mistura gelatinosa de proteína utilizando uma ponta de pipeta P1000.
   3. Adicionar 1 ml de mídia para um único poço e voltar a suspender as Organóides em 1 ml de mídia.
   4. Cuidadosamente, quebre os Organóides usando um P1000 por pipetagem cima e para baixo 20-30x.
   5. Transfira os Organóides a um tubo de 1,5 ml. Centrifuga-se a 100 xg a 4 ° C, 5 min.
   6. Lava-se a pelete duas vezes com 1 ml de meio de cultura completo.
   7. Criptas Ressuspender em 500 mL de mídia congelamento.
   8. Criptas transferência para um tubo criogénico, colocar o tubo em um recipiente e loja de congelação de -80 ° C congelador overnight.
   9. Transferir para criptas _N2 líquido do tanque.
      1. Recuperar Organóides cripta congeladas pelo rápido degelo em um banho de água a 37 ° C. Lava-se com 500 ul meios de cultura completo uma vez, centrifugar a 100 xg, 5 min e ressuspender em mistura gelatinosa de proteína, e da cultura como descrito acima. Para uma melhor recuperação, adicione inibidor ROCHA (Y-27632) para a mídia congelamento.

2. Crypt organóide Metabolismo Ensaio

1. 24 poços Preparação Plate:
   1. Isolar e contar criptas de acordo com o protocolo (ver secção 1.1 para isolamento cripta e 1.2 para a passagem cripta).
   2. Criptas Ressuspender em mistura de proteína gelatinosa (100-200 criptas por 20 l).
   3. Placa de suspensão mistura de proteínas cripta-gelatinoso numa placa de 24 poços de ensaio (certificar-se de que há pelo menos três repetições para cada amostra) e permitir que a suspensão para solidificar a 37 ° C num CO ₂incubadora; em seguida, adicione 500 mL de meios de cultura completo.
   4. Criptas Cultura (conforme descrito na seção 1.1) e observar ao microscópio até criptas crescer em Organóides totalmente desenvolvidos.
2. Extracelular Flux Ensaio:
   1. Hidrato de cartucho durante a noite num não-CO ₂ (0% de _CO2), 37 ° C incubadora.
   2. Remover o meio de cultura e lavar Organóides duas vezes com 500 ul de DMEM (sem: glucose, L-glutamina, piruvato de sódio e bicarbonato de sódio; e com: vermelho de fenol). Espere 5 min.
   3. Adicionar 675 ul por poço meio de ensaio (DMEM com 2 mM de L-glutamina e 5 mM de D-glicose) a cada poço.
   4. Verificar cripta Organóides morfologia microscópica para garantir que Organóides e a mistura gelatinosa proteína estão intactos depois as lavagens. Incubar 1 hora em um não-CO _2, 37 ° C incubadora.
   5. Preparar 10 uM compostos injectáveis ​​(oligomicina, carbonil-cianeto de p-trifluoro-metoxi-fenil-hidrazona (FCCP), rotenone) no meio de ensaio.
   6. Set-up do cartucho através do carregamento de 75 mL de 10 mM compostos injetáveis ​​nas portas da sequencialmente cartucho: Port A - oligomicina; Porto B - FCCP; e Port C - rotenona (As concentrações finais no ensaio serão de 1? M).
   7. Incubar cartucho 30 min - 1 hr a 37 ° C numa incubadora com CO ₂ não.
   8. Ao mesmo tempo, ligue o XF Analyzer e criar o modelo de protocolo de ensaio.
   9. Coloque cartucho e placa utilidade em XF Analyzer e executar "calibrar" cartucho.
   10. Verifique Organóides cripta microscopicamente para se certificar de que eles estão ligados à mistura de proteína gelatinosa.
   11. Célula de carga em placa de cultura de protocolo do ensaio instrumento e correr.

Resultados

Organóides da cripta foram estabelecidos a partir de oito meses de idade camundongos C57BL / 6 alimentados com dieta purificada roedor Instituto Americano de Nutrição 76A (AIN76A). Organóides criptas intestinais podem ser cultivadas em cultura durante longos períodos de tempo a partir de um único cripta (Figura 1A, única seta vermelha). Organóides crescer para fora da cripta estruturas semelhantes em 18-20 dias em cultura (Figura 1B, setas vermelhas). Criptas foram passadas a ca...

Discussão

Testamos a taxa de consumo de oxigénio (OCR) e a taxa de acidificação extracelular (ECAR) de criptas isolados a partir de 8 meses de idade e ratinhos cultivadas em Organóides ex vivo. Após a medição da taxa basal, metabolismo cripta foi avaliada adicionando oligomicina, cianeto de carbonilo -p-Trifluormetoxifenilidrazona (FCCP) e rotenona, sequencialmente.

Basal OCR e ECAR basal foram gravadas 0-29 min (Figura 2A e 2B). No dia ²⁹ m...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free	BD Biosciences	356231
PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2	Life Technologies	20012-027
Advanced DMEM/F-12 (1x)	Life Technologies	12634-028
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium w/o glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	D5030
Phenol red sodium salt	Sigma-Aldrich	P4758	Final Concentration 15 mg/l in DMEM (D5030) - step 2.2.2
Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml	Life Technologies	15240-062	Final concentration 1x or 2x
Penicilin-Streptomycin, liquid	Life Technologies	15140-122	Final concentration 1x
Gibco® GlutaMAX™ supplement	Life Technologies	35050061	Final concentration 1x
Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M	Life Technologies	15630-080	Final concentration 10 mM
N-acetyl-L-cysteine, 25 g	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Final concentration 1 mM
100x N-2 supplement, liquid	Invitrogen	17502-048	Final concentration 1x
50x B-27® supplement minus Vitamin A, liquid	Invitrogen	12587-010	Final concentration 1x
Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50 μg	R&D Systems	3474-RS-050	Final concentration 500 ng/ml
Recombinant Murine EGF, 100 μg	Peprotech	315-09	Final concentration 50 ng/ml
Recombinant Murine Noggin, 20 μg	Peprotech	250-38	Final concentration 100 ng/ml
Gibco® L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Final concentration 2 mM
Gibco® glucose powder	Life Technologies	15023-021	Final concentration 5 mM
Ambion® 0.5 M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0	Life Technologies	AM9260G	Final concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8
[header]
DTT (dithiothreitol), 1M	Life Technologies	P2325	Final concentration 3 mM
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	0.1% in PBS
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044	1% in PBS
Recovery™ Cell Culture Freezing Medium	Life Technologies	12648-010
ROCK inhibitor (Y-27632)	Sigma-Aldrich	Y0503	Final concentration 10 μM
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	Final concentration 1 μM
Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	Final concentration 1 μM
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Final concentration 1 μM
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465	Final concentration 0.1 N in PBS
XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)	Seahorse Bioscience