Metabolik Profil Gerçek Zamanlı Analizi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Fare Bağırsak Crypt organoid Kültürleri

Özet

Ince bağırsak crypt organoids kök hücreler ve onların niş bağımlı kriptalarının büyümesini özetlediği bir doku kültürü sistemi sağlamaktır ex vivo kültüre. Primer fare kript organoids gerçek zamanlı olarak metabolik profil tahlil etmek için bir yöntem kurulmuştur. Biz organoids onların kaynağı tarafından tanımlanan fizyolojik özelliklerini muhafaza bulundu.

Özet

Ince bağırsak mukoza iki temel yapıdan organize tekrarlayan bir mimari sergiler: villus, bağırsak lümen içine uzanan ve olgun enterocytes goblet hücreleri ve enteroendokrin hücrelerden oluşan; ve submukozası ve muskularis, barındıran yetişkin kök ve progenitör hücreler ve olgun Paneth hücrelerinin proksimaline yanı sıra stromal ve crypt mikroçevresinin bağışıklık hücrelerini ikamet kriptler. Son birkaç yıl öncesine kadar, ince barsak in vitro çalışmalar, iyi huylu veya kötü huylu ya da tümörlerden türetilmiş hücre çizgileri ile sınırlı olan ve normal bağırsak epitel fizyolojisini ve içinde bulundukları mikro-etkisini temsil etmedi. Burada, Sato et al adapte edilmiş bir metot. (2009), C57BL / 6 farelerinden elde edilen primer fare bağırsak kript organoids kültürlenmesi için göstermektedir. Buna ek olarak, biz tedbir gerçek zamanlı crypt metabolik profili tahlil için crypt organoid kültürlerin kullanımını sunmakBazal oksijen tüketimi, glikolitik oranı, ATP üretimi ve solunum kapasitesinin etkin kılar. Organoids onların kaynağı tarafından tanımlanan özelliklerini korumak ve oksijen tüketimi ve hücre dışı asidifikasyondaki yansıyan onların metabolik adaptasyon yönlerini yitirmemek. Bu crypt organoid kültür sisteminde gerçek zamanlı metabolik çalışmalar crypt organoid enerji metabolizmasını incelemek için güçlü bir araçtır ve nasıl beslenme ve farmakolojik faktörler tarafından modüle edilebilir.

Giriş

Kolorektal kanser (CRC) Amerika Birleşik Devletleri'nde kanser ile ilişkili ölümlerin üçüncü önde gelen nedenidir. Sporadik kolon kanseri - yani o yaşamda daha sonra ortaya çıkan (> 50 yaş) ve net bir predispozan genetik faktörler ile - için hesaplar ~ güçlü uzun vadeli beslenme şekilleri ^1,2 etkilenir insidansı ile tüm vakaların% 80. Bu tümörler tümör hücre çoğalması ^3-5 oranları yüksek izin ve belki de sürücü kısmen (glutaminolysis aracılığıyla) mevcuttur hücresel yapı blokları ve enerji yüksek konsantrasyonlarda yapabilir Warburg etkisi olarak bilinen oksidatif glikoliz bağımlılığı doğru metabolik kayma, sergi . Ince bağırsak kanserleri dahil olmak üzere kolon kanseri Çalışmaları yanı sıra diğer gastrointestinal kanserler tümör oluşumuna neden içine önemli bir bakış açısı sağlamaktadır. Det yardımcı olabilir gastrointestinal organ sistemlerinin normal yanlısı tümörijenik ve tümörijenik devletler arasındaki metabolik farklılıkları incelemektümör gelişimi için rölatif risk yanı sıra neoplazi erken algılama ermination. Ayrıca, mitokondriyal solunum ve glikoliz içeren bioenerjitik metabolizmasını anlamak hücre fizyolojisi, yaşlanma ve hastalık durumu bağırsak homeostazisini bozarak içine nasıl temel fikir verecektir. Dışı akı analizi için biyoenerjetiğin tahlil teknoloji kullanımı gerçek zamanlı ^6,7 kültüründe büyüyen hücrelerde aynı anda mitokondriyal solunum ve glikoliz oranlarını değerlendirmek.

Yakın zamana kadar, ince barsak, in vitro çalışmalar, iyi huylu veya habis tümörler ^8,9 türetilmiş hücre çizgileri ile sınırlı ve normal bağırsak epitel fizyolojisini ve içinde bulundukları mikro-etkisini temsil etmedi. 2009 yılında, Sato ve ark. ^10, bir ex vivo kültür üç boyutlu (3D) bir fare bağırsak epitelial organoids büyümeye sistemi ya da epith kişiyedeneysel tanı ve tedavi soruşturma ^10,11 uygun Elial "mini-cesaret". Ayrıca, kalorili sınırlı farelerden izole kript tür kültürlerde ¹² organoids olarak değiştirilmiş büyüme özelliklerini korur. Dönüştürülmüş hücre kuşakları ile karşılaştırıldığında, kript Organoid kültürlerin in vivo durumunu anlamak için çok daha iyi bir model öne fizyolojik olarak ilgili verileri oluşturmak için kullanılabilir.

Biz bağırsak crypt organoids enerji metabolizmasını tahlil biyoenerjetiğin analiz teknolojisi uyarlanmış. Fare bağırsak crypt organoids sunulan crypt organoid enerji metabolizması çalışmaları geliştirmektir ex vivo kültüre edildi. Oksijen kullanım oranı (OCR) ve kript organoids hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) yokluğunda ve iki farklı metabolik inhibitörler (oligomycin, rotenon) ve iyon taşıyıcısı (karbonil siyanür-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) varlığında ölçüldü. Crypt orgaBu kimyasal bileşiklere noid metabolik yanıt başarıyla değişen ECAR ve OCR değerleri üzerinden yansıtılmıştır.

Hücresel bioenerjitik çalışmalar kanser, obezite, diyabet, metabolik bozukluklar ve mitokondriyal hastalıklar metabolik durumu ve hastalık riski ve fenotip arasındaki karşılıklı etkileşimleri aydınlatmak ve translasyonel tıp doğrudan etkisi olan avans tarama yöntemleri yardımcı olacaktır. Burada, biz detaylı bir protokol ince bağırsak kriptaları izole ve kültür kript organoids için açıklamak. Ayrıca, metabolik deneyleri için crypt organoid kültürleri kullanmak için yeni bir yöntem tanıtmak.

Protokol

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu tavsiyeleri doğrultusunda gerçekleştirildi. Protokol Tıp Albert Einstein College Hayvan Deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylandı.

1. Crypt İzolasyon ve Kültürü

1. İnce Barsak gelen Crypts İzolasyonu:
   1. Ilgi herhangi bir fare modeli bağırsak kriptaları izole eder. Servikal dislokasyon CO ₂ ile fareler öldürülür.
   2. Uzunlamasına karın aç ve buz soğuğu fosfat tamponlu tuzlu su ile, ince bağırsağa (SI) dolgu PBS (-Ca ^2+; -MG ²⁺⁾ 2x antibiyotik-antimikotik (Anti-anti) ile. Hızla ince bağırsağı izole.
   3. İyice bir neşter kullanılarak mezenterik yağ içermeyen teşrih. Doku delmek için dikkatli olun - her zaman buz gibi soğuk PBS ile nemli doku tutmak at. Inte açınstine boyuna buz soğuk PBS ile iyice yıkayın ve.
   4. Önceden soğutulmuş slayt kullanarak villusları kazıyın yavaşça, iki bölüme ince bağırsağı kesilmiş ve ıslak pamuk ucunu kullanarak doğrulmak. Buzla soğutulmuş PBS içinde birkaç kez sert biçimde yıkayın.
   5. Doku enzimatik olmayan ayrılması için 3 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) /0.5 mM ditiotreitol (DTT), PBS başına 1 x 20 ml 3 dakika kuluçkalayın.
   6. Önceden soğutulmuş bir sürgü üzerinde bir ustura kullanılmak suretiyle, küçük parçacıklar (2-4 mm) içine doku kesilir. 20 ml buz gibi soğuk PBS içeren 50 ml'lik bir tüp içine parçaları aktarın.
   7. Pipet yukarı ve aşağı yavaşça 10x 10 ml steril pipet kullanarak. Doku parçaları yerçekimi tarafından sediment edelim. Bir pipet ile süpernatantı. Üç ek kez tekrarlayın; emin süpernatant açık olduğundan emin olun.
   8. 2 mM kadar EDTA başına 20 ml PBS ilave edin. Girdap ve hafif sallama ile 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   9. Doku tortu edelim ve süpernatant atın. 15 ml buz gibi soğuk PBS ve pipet eklemeyukarı ve 10 ml pipet ile 5x aşağı. Doku parçaları sediment edelim ve Kesir 1 (F1) olarak süpernatant toplamak. F2-F5, ayrı ayrı tutulan her fraksiyonunun tekrarlayın.
   10. 15 saniye boyunca elle kuvvetli bir şekilde 15 ml buz gibi soğuk PBS ve bu kez sallamak ekleyin. , F8 F6 toplayın ve F7 için tekrarlayın. Doku parçaları yüzer başlarsanız, onlara yerleşmek için dokunun.
   11. Mikroskop altında her bir fraksiyonun bir kısım kontrol edin. Kriptaları ihtiva eden fraksiyonlar havuzda toplayın.
   12. 50 ml'lik bir tüp içinde kriptaları toplayarak, bir 70 um naylon hücre süzgecinden Bir araya toplanan fraksiyonlar geçirin.
   13. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj, bir 15 ml tüp 2x Anti-anti ve transfer kriptlerin 10 ml buz gibi soğuk PBS süpernatan ve tekrar süspansiyon pelet atın. Yıkandıkları bir kez daha tekrarlayın.
   14. 2x Anti-anti - 10 ml buz gibi soğuk ADF Gelişmiş DMEM / F-12 (Dulbecco'nun 'nin Modifiye Eagle Ortamı / Ham ", F-12) ile bir kez kriptaları yıkayın.
   15. Bir kez kript 10 mi A ile yıkayınDF - anti-anti 1x.
   16. Hemasitometre kullanarak kriptaları saymak. Crypt çözüm ses seviyesini ayarlama ve yeniden süspanse nihai crypt konsantrasyon jelatinli protein karışımı (Matrıgel) 50 ul başına 100-500 kriptler olacak şekilde 1.5 ml tüp transfer. Jelatinimsi protein karışımı 4 ° C ve tekrar süspansiyon kriptlerin C'de 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüjleyin.
   17. Levha kriptalarının 50 ul - 24 oyuklu bir plaka içerisinde, oyuk başına, jelatinimsi bir protein karışımı, süspansiyon (büyüme alanı: 2 ^cm2), dikkatli bir şekilde her bir merkezinde süspansiyonu damla yerleştirilmektedir. Bir CO ₂ süspansiyon katılaşan ~ 30 dakika kadar 37 ° C inkübatör plaka koruyun.
   18. 500 ul buz gibi soğuk tam kültür ortamı (İleri DMEM / 1x anti F12 ekleme anti -, 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES), 1 x GlutaMAX, 1 x B27 eki, 1 kez N2 Ek, 1mM N-Asetil-L-Sistein (NAC), 50 ng / ml Epidermal büyüme faktörü (EGF), 100 ng / mlNoggin, 500 ng / ml R Spondin).
       1. PBS içinde% 0.1 Sığır Serum Albumin (BSA), büyüme faktörleri sulandırın.
2. Crypt organoid Kültür ve Passage:
   1. Passage crypt organoids 14-21 gün sonrası tohumlama (ya da gerektiği gibi) aşağıdaki gibi:
      1. Değişim medya her Cuma ve Pazartesi. Çarşamba günleri, taze medya ile yarım ortamı değiştirin.
   2. Kültür ortamı çıkarın. 5 dakikalık aralıklarla, 500 ul PBS ile iki kez örnek yıkayın.
   3. PBS çıkarın ve yavaşça bir steril P1000 mikro pipet kullanarak jelatinli protein karışımı break up.
   4. Bir tek yuva, 1 ml tam kültür ortamı ilave edin ve 1 ml'lik ortam maddesi organoids tekrar süspansiyon.
   5. Yavaşça yukarı pipetleme ve 20-30x aşağı P1000 kullanılarak organoids bozabilir (tutarlı bir teknikle kadar iyi bir crypt verim ile doğru organoid ayrışması için mikroskop altında kontrol geliştirilmiştir).
   6. 1.5 ml mikrosantrifüj tüp kriptaları aktarın;4 ° C'de 5 dakika 100 x g'de santrifüj.
   7. 1 mi tam kültür ortamı ile iki kez pelet yıkayın.
   8. Oyuk başına 50 ul Matrigel gerekli yeniden süspansiyon haline getirilmesi kript olarak 6: 3 veya 1: 1 oranında ayrıldı. (Bölüm 1.1.16-18) yukarıda açıklandığı gibi devam edin.
3. Crypt organoid Donma:
   1. Kültür ortamı çıkarın. 500 ul PBS içinde örnek yıkayın.
   2. P1000 pipet kullanarak jelatinli protein karışımı dağıtmak.
   3. Bir tek yuva, 1 ml ortam ilave edilir ve 1 ml'lik ortam maddesi organoids tekrar süspansiyon.
   4. Yavaşça aşağı 20-30x yukarı pipetleme ve bir P1000 kullanılarak organoids break up.
   5. 1.5 ml'lik bir tüpe organoids aktarın. 4 ° C'de 5 dakika 100 x g'de santrifüjleyin.
   6. 1 mi tam kültür ortamı ile iki kez pelet yıkayın.
   7. Medya dondurma 500 ul süspanse kriptler.
   8. Bir cryotube Transfer kriptler, -80 ° C dondurucu overni bir dondurma kabı ve mağaza tüp yeriGHT.
   9. Sıvı N ₂ tankına kriptaları aktarın.
      1. Hızla 37 ° C su banyosunda çözülme dondurulmuş crypt organoids kurtarın. Yukarıda açıklandığı gibi 100 xg, jelatinimsi protein karışımı 5 dakika ve tekrar süspansiyon ve kültüre 500 ul ile tam bir kültür kez medya, santrifüj yıkayın. Daha iyi elde edilmesi için, dondurma ortamına ROCK inhibitörü (Y-27632) ekleyin.

2. Crypt organoid metabolizma analizlerinde

1. 24 oyuklu plaka hazırlanması:
   1. Yalıtmak ve protokol (crypt izolasyon ve kript geçiş için bölüm 1.2 için bölüm 1.1) göre kriptaları saymak.
   2. Jelatinimsi protein karışımı içinde süspanse kriptler (20 ul başına 100-200 kriptler).
   3. 24 oyuklu bir deney plakasında Levha kript jelatinimsi-protein karışımının süspansiyonu (her bir örnek için en az üç kez orada emin olun) eklenmiş ve süspansiyon, bir _CO2 içinde 37 ° C'de katılaşmaya izininkübatör; sonra 500 ul tam bir kültür ortamı ekleyin.
   4. (1.1 bölümünde anlatıldığı gibi) ve kriptler tam gelişmiş organoids içine büyümeye kadar mikroskop altında gözlemlemek Kültür kriptler.
2. Hücre dışı Akı Deneyi:
   1. Gece boyunca olmayan bir _CO2 hidrat kartuşu (% 0 _CO2), 37 ° C'de kuluçka makinesine kondu.
   2. Kültür Ortamı çıkarın ve 500 ul DMEM ile iki kez organoids yıkayın (olmamak üzere: glikoz, L-glutamin, sodyum piruvat ve sodyum bikarbonat, ile: fenol kırmızı). 5 dakika bekleyin.
   3. Her bir oyuğa de tahlil ortamı başına (DMEM, 2 mM L-glutamin, 5 mM D-glükoz) ile 675 ul ekleyin.
   4. Organoids ve jelatinimsi protein karışımının, yıkamadan sonra sağlam olmasını sağlamak için Crypt organoids mikroskobik morfoloji edin. Olmayan bir CO ₂ 'de 1 saat, 37 ° C inkübatör inkübe edin.
   5. 10 uM enjekte edilebilir bileşikleri (oligomycin, karbonil siyanit-p-trifloro-metoksi-fenil-hidrazon (FCCP) hazırlayın, rotenone) analiz ortamında.
   6. Set-up kartuşu kartuş sıralı limanlarına içine 10 mcM enjektabl bileşiklerin 75 ul yüklenerek: Port A - oligomycin; Liman B - FCCP; ve C çıkışı - rotenon (deney sırasında son konsantrasyon 1 uM) olacaktır.
   7. Kartuş 30 dakika kuluçkalayın - 37 ° C 'de 1 saat olmayan bir _CO2 inkübatör içinde tutulur.
   8. Aynı zamanda, XF Analyzer açmak ve tahlil protokol şablonu oluşturun.
   9. Kartuşu "kalibre" XF Analyzer içine kartuşu ve yardımcı plakası yerleştirin ve çalıştırın.
   10. Onlar jelatinimsi protein karışımına bağlı emin olmak için mikroskobik crypt organoids edin.
   11. Enstrüman ve çalışma tahlil protokolü içine yük hücre kültürü plakası.

Sonuçlar

Kript organoids 8 aylık bir C57BL / 6 farelerinden alınan oluşturulmuştur Beslenme 76A (AIN76A) kemirgen diyeti American Institute of arıtıldı yapıyordu. Bağırsak crypt organoids tek bir crypt (Şekil 1A, tek bir kırmızı ok) Uzun süre kültüründe yetiştirilebilir. Organoids kültürde 18-20 gün içinde (Şekil 1B, kırmızı oklar) kript benzeri yapılar büyür. Kriptler her 3 hafta geçirildi ve organoids verimli bir şekilde her geçmesinin ardından kurtarıldı. <...

Tartışmalar

Biz bazal hızının ölçülmesi sonra, kript metabolizması oligomycin, karbonil siyanit eklenmesi ile değerlendirildi. Oksijen tüketim oranı (OCR) ve 8 aylık bir fareden izole edilmiş ve organoids eks vivo haline kript hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) test ardışık -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) ve rotenon.

29 dakika boyunca (Şekil 2A ve 2B) - Bazal OCR ve bazal ECAR 0 kaydedildi. ^29. dakikada, (bağl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free	BD Biosciences	356231
PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2	Life Technologies	20012-027
Advanced DMEM/F-12 (1x)	Life Technologies	12634-028
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium w/o glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	D5030
Phenol red sodium salt	Sigma-Aldrich	P4758	Final Concentration 15 mg/l in DMEM (D5030) - step 2.2.2
Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml	Life Technologies	15240-062	Final concentration 1x or 2x
Penicilin-Streptomycin, liquid	Life Technologies	15140-122	Final concentration 1x
Gibco® GlutaMAX™ supplement	Life Technologies	35050061	Final concentration 1x
Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M	Life Technologies	15630-080	Final concentration 10 mM
N-acetyl-L-cysteine, 25 g	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Final concentration 1 mM
100x N-2 supplement, liquid	Invitrogen	17502-048	Final concentration 1x
50x B-27® supplement minus Vitamin A, liquid	Invitrogen	12587-010	Final concentration 1x
Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50 μg	R&D Systems	3474-RS-050	Final concentration 500 ng/ml
Recombinant Murine EGF, 100 μg	Peprotech	315-09	Final concentration 50 ng/ml
Recombinant Murine Noggin, 20 μg	Peprotech	250-38	Final concentration 100 ng/ml
Gibco® L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Final concentration 2 mM
Gibco® glucose powder	Life Technologies	15023-021	Final concentration 5 mM
Ambion® 0.5 M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0	Life Technologies	AM9260G	Final concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8
[header]
DTT (dithiothreitol), 1M	Life Technologies	P2325	Final concentration 3 mM
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	0.1% in PBS
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044	1% in PBS
Recovery™ Cell Culture Freezing Medium	Life Technologies	12648-010
ROCK inhibitor (Y-27632)	Sigma-Aldrich	Y0503	Final concentration 10 μM
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	Final concentration 1 μM
Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	Final concentration 1 μM
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Final concentration 1 μM
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465	Final concentration 0.1 N in PBS
XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)	Seahorse Bioscience