В режиме реального времени Анализ метаболического профиля в<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Мышь Кишечная Crypt Органоид Культуры

Резюме

Малые кишечные склеп органоиды культивировали экс естественных обеспечить систему культуры тканей, что повторяет рост склепов, зависящих от стволовых клеток и их нишу. Мы создали метод для анализа метаболического профиля в режиме реального времени в первичной мыши крипт органоидов. Мы нашли органоиды сохранить физиологические свойства, определяемые их источника.

Аннотация

Слизистой оболочки тонкой кишки показывает повторное архитектуру организованы в две основных структур: ворсинок, выступающими в просвет кишечника и состоящих из зрелых энтероцитов, бокаловидных клеток и клеток энтероэндокринные; и склепы, проживающих проксимальнее подслизистой и мышечной, укрывательства стволовых взрослых и клеток-предшественников и зрелые клетки Панета, а также стромальных и иммунные клетки крипт микросреды. До последних нескольких лет, в пробирке исследования тонкой кишки не был ограничен клеточных линий, полученных из или доброкачественных или злокачественных опухолей, и не представляют физиологию эпителии нормальной кишечной и влияние микросреды, в которой они находятся. Здесь мы демонстрируем метод адаптированный Сато и др. (2009) для культивирования первичных мыши кишечных крипт органоиды, полученные из C57BL / 6. Кроме того, мы представляем использование крипт Органоид культур для анализа склепа метаболический профиль в режиме реального времени по мерение базального потребления кислорода, гликолитического скоростью, продукции АТФ и дыхательной емкости. Органоидов сохранить свойства, определяемые их источника и сохранить аспекты их метаболической адаптации отраженного потребления кислорода и внеклеточного ставок подкисления. В режиме реального времени метаболические исследования в этой крипте Органоид системы культуры являются мощным инструментом для изучения склепа Органоид энергетический обмен, и как это можно модулировать питания и фармакологических факторов.

Введение

Колоректальный рак (CRC) является третьей ведущей причиной рака, связанных с смертей в Соединенных Штатах. Широкоэкранный рак толстой кишки - то есть, что возникающие в дальнейшей жизни (> 50 лет) и без каких-либо четких предрасполагающих генетических факторов - приходится ~ 80% всех случаев, с частотой сильным влиянием долгосрочных рациона питания ^1,2. Эти опухоли обнаруживают метаболический сдвиг в сторону зависимости от окислительного гликолиза, известный как эффект Варбурга, который может частично принимать более высокие концентрации клеточных строительных блоков и энергии, доступных (через glutaminolysis), чтобы разрешить и, возможно, ездить высокие темпы пролиферации опухолевых клеток ^3-5 , Исследования рака толстой кишки, а также другие желудочно-кишечные раковые включая маленьких раков кишечника обеспечивают важное понимание причины образования опухоли. Исследуя метаболические различия между нормальными, про-онкогенных и онкогенных состояний желудочно-кишечного тракта системы органов могут помочь DETermination относительного риска развития опухолей, а также раннего выявления новообразований. Более того, понимая, биоэнергетический метаболизм с участием дыхание митохондрий и гликолиза обеспечит фундаментальную понимание того, как клетки физиологии, старение и болезнь государство возмущает кишечный гомеостаз. Использование технологии биоэнергетика анализа для внеклеточной анализа потока может оценить темпы митохондриального дыхания и гликолиза одновременно в клетках, растущих в культуре в реальном времени ^6,7.

До недавнего времени исследования в пробирке из тонкой кишки не были ограничены клеточных линиях, полученных из или доброкачественных или злокачественных опухолей ^8,9 и не представляют физиологию нормальной кишечной эпителия и влияние микросреды, в которой они проживают. В 2009 году Сато и др. ¹⁰ введен экс естественных культуры систему, чтобы расти трехмерная (3D) мыши кишечные эпителиальные органоиды, или epithelial "мини-кишки", пригодных для экспериментальных, диагностических и терапевтических исследований ^10,11. Кроме того, склепы, выделенные из калорийно ограниченных мышей сохранить свои измененные свойства роста как органоидов в таких культурах ^12. По сравнению с трансформированных клеточных линий, крипт Органоид культуры могут быть использованы для создания физиологически соответствующие данные, представляющие гораздо лучше понять модель в естественных условиях состояние.

Мы адаптировали технологию анализа биоэнергетический для анализа энергетического метаболизма кишечной крипт органоидов. Mouse кишечного склеп органоиды культивировали экс естественных развивать склепе Органоид исследования энергетического метаболизма представленные. Расход кислорода (OCR) и внеклеточный скорость подкисление (РВЦА) из крипт органоидами были измерены в отсутствие и в присутствии двух различных метаболических ингибиторов (олигомицин, Ротенон) и ионным носителем (карбонил цианид-п-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Склеп оргасоленоида метаболическая реакция на эти химические соединения были успешно отражены за счет изменения РВЦА и ценностей OCR.

Сотовые биоэнергетические исследования будет выяснить взаимные взаимодействия между метаболического состояния и риска болезни и фенотипа в рак, ожирение, сахарный диабет, нарушения обмена веществ и митохондриальных заболеваний и способствовать продвижению методов скрининга с прямыми последствиями для поступательного медицины. Здесь мы опишем Подробный протокол изолировать небольшие кишечных крипт и культуры крипт органоидов. Кроме того, мы вводим новый способ использовать крипт Органоид культур для метаболических анализов.

протокол

Это исследование было проведено в соответствии с рекомендациями, приведенными в руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных Институтов Здоровья. Протокол был одобрен Комитетом по этике эксперименты на животных в колледже Альберта Эйнштейна медицины.

1. Склеп Выделение и культуры

1. Выделение гробниц из тонкой кишки:
   1. Изолировать кишечных крипт с любого мышей интересующей модели. Усыпить мышей с СО ₂ с последующим смещением шейных позвонков.
   2. Открывают живота в продольном направлении и заполнить в тонкую кишку (SI) с ледяным фосфатно-солевой буфер, PBS (-Ca ^2+; -Mg ²⁺⁾ с антибиотиком 2x-противогрибковое (анти-анти). Быстро изолировать тонкий кишечник.
   3. Тщательно анализировать бесплатно брыжеечной жира с помощью скальпеля. Будьте осторожны, чтобы не проколоть ткань - все время держать ткань влажная с ледяной PBS. Откройте InteСтайн продольно и тщательно промойте лед холодной PBS.
   4. Вырезать тонкую кишку на две части и расплющить используя наконечник влажной хлопчатобумажной, мягко соскрести ворсинки с использованием предварительно охлажденный слайд. Вымойте энергично в ледяной PBS несколько раз.
   5. Инкубируйте 3 мин в 20 мл 1X PBS в 3 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в 0,5 мМ дитиотреитола (DTT) в течение не-ферментативной диссоциации ткани.
   6. Вырезать ткань на мелкие кусочки (2-4 мм), используя лезвие бритвы на предварительно охлажденный горкой. Передача части в 50 мл пробирку, содержащую 20 мл ледяной PBS.
   7. Пипетка вверх и вниз 10 раз осторожно с помощью 10 мл стерильной одноразовой пипетки. Пусть фрагменты ткани осадок под действием силы тяжести. Удалить супернатант с помощью пипетки. Повторите три раза,; убедитесь, что супернатант ясно.
   8. Добавить 20 мл PBS в 2 мМ ЭДТА. Вихревой и инкубируют при 4 ° С в течение 30 мин при осторожном качания.
   9. Давайте ткани осадок и отбросить супернатант. Добавить 15 мл ледяной PBS и пипеткивверх и вниз, 5x с 10 мл пипетки. Пусть фрагменты ткани осадок и собрать супернатант как фракции 1 (F1). Повторите сбора F2-F5, каждую фракцию поддерживается отдельно.
   10. Добавить 15 мл ледяной PBS и на этот раз интенсивно встряхнуть рукой в ​​течение 15 сек. Сбор F6 и повторите для F7, F8. Если кусочки ткани начинают плавать, нажмите, чтобы помочь им обосноваться.
   11. Осмотр аликвоты каждой фракции под микроскопом. Бассейн те фракции, содержащие склепы.
   12. Pass Объединенные фракции через сито нейлон клеточной 70 мкм, собирая крипт в 50 мл пробирку.
   13. Центрифуга при 100 мкг в течение 5 мин при 4 ° С, Жидкость над осадком сливают и ресуспендируют осадок в 10 мл охлажденного льдом PBS с 2x анти-анти и передачи крипт к 15 мл пробирку. Повторите стирке еще раз.
   14. Промыть крипты один раз 10 мл охлажденного льдом АПД, Advanced DMEM / F-12 ("Игла, модифицированной Дульбекко среде / Ham" с F-12) - 2x анти-анти.
   15. Вымойте склепы раз с 10 мл АDF - 1x анти-анти.
   16. Граф склепы, используя гемоцитометра. Настройка громкости крипт раствора и переносят в 1,5 мл пробирку так, чтобы конечная концентрация крипты, когда ресуспендировали будет 100-500 крипты в 50 мкл желатиновой смеси белка (Matrigel). Центрифуга при 100 х г в течение 5 мин при 4 ° С и ресуспендируют крипт в желатиновой смеси белков.
   17. Пластина 50 мкл крипты - студенистое белок смесь суспензии на лунку в 24-луночный планшет (область роста: 2 см ^2), тщательно помещая капли суспензии в центре каждой лунке. Поддержание пластину в CO _2, 37 ° C инкубатор для ~ 30 мин, пока суспензия не затвердевает.
   18. Добавить 500 мкл ледяного полное питательных сред (Advanced DMEM / F12 с 1x анти - анти, 10 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES), 1x GlutaMAX, 1x B27 Дополнение, 1x N2 Дополнение, 1 мМ N-ацетил-L-цистеин (NAC), 50 нг / мл эпидермального фактора роста (EGF), 100 нг / млNoggin, 500 нг / мл Р-Spondin).
       1. Развести факторы роста в 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS.
2. Crypt Органоид Культура и проезд:
   1. Прохождение крипт органоиды 14-21 дней после посева (или по мере необходимости) следующим образом:
      1. Изменить СМИ каждую пятницу и понедельник. По средам, заменить половину СМИ со свежими СМИ.
   2. Удаление питательной среды. Промыть образец в два раза с 500 мкл PBS на 5-минутными интервалами.
   3. Удалить PBS и осторожно разбить смесь гелеобразную белка, используя стерильные P1000 микро пипетки.
   4. Добавить 1 мл полной культуральной среды для одной скважины и ресуспендируйте органоиды в 1 мл среды.
   5. Аккуратно сорвать органоиды, используя P1000 с помощью пипетки вверх и вниз 20-30x (проверить под микроскопом для правильного Органоид диссоциации с хорошим выходом склепа до постоянной методики разрабатывается).
   6. Трансфер склепы на 1,5 мл микроцентрифужных трубки;центрифуге при 100 х г при 4 ° С, 5 мин.
   7. Вымойте гранул в два раза с 1 мл полной культуральной среды.
   8. Разделение в соотношении 1: 3 или 1: 6 в случае необходимости, ресуспендирования крипт в 50 мкл на лунку Матригель. Действуйте, как описано выше (раздел 1.1.16-18).
3. Crypt Органоид Замораживание:
   1. Удаление питательной среды. Вымойте образца в 500 мкл PBS.
   2. Диспергировать смесь гелеобразную белка, используя наконечник P1000 пипетки.
   3. Добавить 1 мл средства массовой информации в одной скважины и ресуспендируйте органоиды в 1 мл среды.
   4. Аккуратно разбить органоиды, используя P1000 с помощью пипетки вверх и вниз 20-30x.
   5. Передача органоиды к 1,5 мл пробирку. Центрифуга при 100 х г при 4 ° С, 5 мин.
   6. Вымойте гранул в два раза с 1 мл полной культуральной среды.
   7. Ресуспендируйте склепы в 500 мкл замораживания средств массовой информации.
   8. Передача склепы в криоскопической пробирки, поместите трубку в морозильной резервуаре и магазин в -80 ° C морозильник overniнравом.
   9. Трансфер склепы для жидкого N ₂ танка.
      1. Восстановление замороженных крипт органоиды, быстро тает в C водяной бане 37 °. Промыть 500 мкл полной культуральной среды один раз, центрифуги при 100 мкг, 5 мин и ресуспендируют в желатиновой смеси белка, и культуры, как описано выше. Для лучшего восстановления, добавить ингибитор ROCK (Y-27632) в морозильную СМИ.

2. Склеп Органоид Метаболизм Пробирной

1. 24-а подготовка плиты:
   1. Изолировать и рассчитывать склепы в соответствии с протоколом (см раздел 1.1 для изоляции склепа и разделе 1.2 для склепа прохождения).
   2. Ресуспендируйте склепы в желатиновой смеси белка (100-200 склепов на 20 мкл).
   3. Тарелка склеп-желатиновый белок смесь подвеска в 24-и аналитический планшет (убедитесь, что по крайней мере трижды для каждого образца) и дать суспензии затвердеть при 37 ° С в СО ₂инкубатор; Затем добавить 500 мкл полной культура медиа.
   4. Культура склепы (как описано в разделе 1.1) и наблюдать под микроскопом до склепы не растут в полной мере развитых органоидов.
2. Внеклеточной Flux анализа:
   1. Сода картридж ночь в режиме нон-CO ₂ (0% CO _2), 37 ° C инкубатор.
   2. Удаление питательной среды и промыть органоиды два раза с 500 мкл DMEM (без: глюкозы, L-глутамина, пирувата натрия и бикарбонат натрия; и с: фенол красный). Подождите 5 минут.
   3. Добавить 675 мкл на лунку аналитической среды (DMEM с 2 мМ L-глутамина и 5 мМ D-глюкозы) в каждую лунку.
   4. Проверьте склепе органоидов микроскопический морфологии для того, чтобы органоиды и желатиновые смесь белка целы после стирок. Выдержите 1 час в режиме нон-CO _2, 37 ° C инкубатор.
   5. Подготовка 10 мкМ инъекций соединений (олигомицин, карбонил-цианид р-трифтор-метокси-фенил-гидразон (FCCP), гotenone) в среде для анализа.
   6. Настройка картриджа, загрузив 75 мкл 10 мкМ инъекций соединений в портах картриджа последовательно: Порт A - Олигомицин; Порт B - FCCP; и порт C - Ротенон (Конечные концентрации во время теста будет 1 мкМ).
   7. Инкубируйте картриджа 30 мин - 1 ч при 37 ° C в не-CO ₂ инкубаторе.
   8. Одновременно, включите XF Analyzer и создать шаблон протокола анализа.
   9. Поместите картридж и утилиты пластину в XF Analyzer и запустить "откалибровать" картридж.
   10. Проверьте крипт органоиды микроскопически, чтобы убедиться, что они прикреплены к желатиновой смеси белка.
   11. ВЯ культура пластина в протоколе инструмент и запустить анализа.

Результаты

Crypt органоиды были созданы из 8-месячным C57BL / 6 мышей кормили очищают грызунов диета Американский институт питания 76А (AIN76A). Кишечные склеп органоиды можно выращивать в культуре в течение длительных периодов от одного склепа (рис 1А, один красная стрелка). Органоидов растут из кр?...

Обсуждение

Мы протестировали уровень потребления кислорода (OCR) и внеклеточный скорость подкисления (РВЦА) крипт, выделенных из 8-месячных мышей и выращенных в органоиды экс естественных. После измерения базальной скорости, склеп метаболизм оценивалась путем добавления Олигомицин, карбонил?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free	BD Biosciences	356231
PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2	Life Technologies	20012-027
Advanced DMEM/F-12 (1x)	Life Technologies	12634-028
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium w/o glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	D5030
Phenol red sodium salt	Sigma-Aldrich	P4758	Final Concentration 15 mg/l in DMEM (D5030) - step 2.2.2
Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml	Life Technologies	15240-062	Final concentration 1x or 2x
Penicilin-Streptomycin, liquid	Life Technologies	15140-122	Final concentration 1x
Gibco® GlutaMAX™ supplement	Life Technologies	35050061	Final concentration 1x
Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M	Life Technologies	15630-080	Final concentration 10 mM
N-acetyl-L-cysteine, 25 g	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Final concentration 1 mM
100x N-2 supplement, liquid	Invitrogen	17502-048	Final concentration 1x
50x B-27® supplement minus Vitamin A, liquid	Invitrogen	12587-010	Final concentration 1x
Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50 μg	R&D Systems	3474-RS-050	Final concentration 500 ng/ml
Recombinant Murine EGF, 100 μg	Peprotech	315-09	Final concentration 50 ng/ml
Recombinant Murine Noggin, 20 μg	Peprotech	250-38	Final concentration 100 ng/ml
Gibco® L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Final concentration 2 mM
Gibco® glucose powder	Life Technologies	15023-021	Final concentration 5 mM
Ambion® 0.5 M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0	Life Technologies	AM9260G	Final concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8
[header]
DTT (dithiothreitol), 1M	Life Technologies	P2325	Final concentration 3 mM
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	0.1% in PBS
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044	1% in PBS
Recovery™ Cell Culture Freezing Medium	Life Technologies	12648-010
ROCK inhibitor (Y-27632)	Sigma-Aldrich	Y0503	Final concentration 10 μM
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	Final concentration 1 μM
Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	Final concentration 1 μM
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Final concentration 1 μM
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465	Final concentration 0.1 N in PBS
XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)	Seahorse Bioscience