Echtzeit-Analyse von Stoffwechselprofil in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus Intestinale Crypt Organoide Kulturen

Zusammenfassung

Dünndarm Krypta Organoiden kultiviert ex vivo eine Gewebekultursystem, das Wachstum der Krypten abhängig Stammzellen und ihrer Nische rekapituliert. Wir haben eine Methode, um das metabolische Profil in Echtzeit in der primären Maus Krypta Organoiden testen. Wir fanden Organoiden aufrechtzuerhalten physiologischen Eigenschaften von ihrer Quelle definiert.

Zusammenfassung

Die Dünndarmschleimhaut weist eine sich wiederholende Architektur in zwei Grundstrukturen organisiert: Zotten, in das Darmlumen vorspringende und reifer Enterozyten, Becherzellen und enteroendokrinen Zellen zusammengesetzt; und Krypten, wohnhaft proximal der Submukosa und Muskularis, Beherbergung adulten Stammzellen und Vorläuferzellen und reife Panethzellen sowie Stromazellen und Immunzellen der Krypta Mikroumgebung. Bis zu den letzten Jahren, in vitro Untersuchungen von Dünndarm wurde, um Zelllinien entweder benigne oder maligne Tumoren abgeleitet sind, und nicht die Physiologie der normalen Darm Epithelien und den Einfluss der Mikroumgebung, in dem sie sich aufhalten darstellen. Hier zeigen wir ein Verfahren von Sato et al angepasst. (2009) für die Kultivierung von primären Maus-Darm-Krypta Organoide von C57BL / 6-Mäusen abgeleitet sind. Darüber hinaus präsentieren wir die Verwendung von crypt Organoid Kulturen, um die Krypta metabolische Profil in Echtzeit von Maßnahme zu testenment der basalen Sauerstoffverbrauch, glykolytischen Rate, die ATP-Produktion und Atemkapazität. Organoiden aufrechtzuerhalten Eigenschaften durch ihre Quelle definiert und Aspekte ihrer metabolischen Anpassung durch den Sauerstoffverbrauch und die extrazelluläre Ansäuerung Raten wider behalten. Echtzeitstoffwechselstudien in dieser Krypta Organoid Kultursystem sind ein leistungsfähiges Werkzeug zur Krypta Organoid Energiestoffwechsel zu untersuchen, und wie sie durch Ernährungs- und pharmakologischen Faktoren moduliert werden.

Einleitung

Darmkrebs (CRC) ist die dritthäufigste Ursache der durch Krebs Todesfälle in den Vereinigten Staaten. Sporadische Darmkrebs - das heißt, dass die sich später im Leben (> 50 Jahre) und ohne klare prädisponierende genetische Faktoren - Konten für ~ 80% aller Fälle, mit Einfalls stark durch langfristige Ernährungsmuster ^1,2 beeinflusst. Diese Tumoren weisen eine metabolische Verschiebung hin Abhängigkeit oxidative Glykolyse als Warburg-Effekt bekannt, das zum Teil machen können höhere Konzentrationen der Zellbausteine ​​und Energie zur Verfügung (über Glutaminolyse) zu hohen Raten der Tumorzellproliferation ^3-5 gestatten und vielleicht fahren . Studien von Darmkrebs sowie anderen gastrointestinalen Tumoren einschließlich Dünndarm Krebsarten liefern wichtige Einblicke in die Ursache der Tumorbildung. Untersuchung der Stoffwechselunterschiede zwischen normalen, pro-tumor und tumorerzeugende Staaten von gastrointestinalen Organsysteme kann det unterstützenermination des relativen Risikos für die Tumorentwicklung sowie Früherkennung von Neoplasien. Darüber hinaus verstehen bioenergetischen Stoffwechsel mit mitochondriale Atmung und Glykolyse liefert grundlegende Einblicke in die Zellphysiologie, Altern und Krankheitszustand stört Darm Homöostase. Nutzung der Bioenergetik Assay-Technologie für extrazelluläre Flussanalyse können die Preise der mitochondrialen Atmung und Glykolyse gleichzeitig in wachsenden Zellen in Kultur in Echtzeit ^6,7 bewerten.

Bis vor kurzem wurden in vitro Untersuchungen von Dünndarmzelllinien entweder benigne oder maligne Tumoren ^8,9 abgeleitet sind und nicht die Physiologie der normalen Darm Epithelien und den Einfluss der Mikroumgebung, in dem sie sich aufhalten darstellen. Im Jahr 2009, Sato et al. ¹⁰ führte eine ex vivo Kultursystem zur dreidimensionalen (3D) Maus Darmepithelzellen Organoiden wachsen oder epithElial "Mini-Mumm", geeignet für experimentelle, diagnostische und therapeutische Untersuchungen ^10,11. Außerdem Krypten von kalorisch eingeschränkt Mäusen isoliert behalten ihre veränderte Wachstumseigenschaften wie Organoiden in solchen Kulturen ^12. Im Vergleich zu transformierten Zelllinien können Krypta organoide Kulturen verwendet, um physiologisch relevante Daten präsentiert ein weit besseres Modell für die in vivo-Zustand zu verstehen erzeugen.

Wir angepasst Bioenergetik-Analyse-Technologie, um den Energiestoffwechsel der Darm Krypta Organoiden testen. Maus Darm Krypta Organoiden kultiviert wurden ex vivo zur Krypta Organoid Energiestoffwechsel Studien vorgestellt zu entwickeln. Die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und der extrazellulären Ansäuerungsrate (ECAR) der Krypta Organoide wurden in Abwesenheit und Anwesenheit von zwei unterschiedlichen Stoffwechselinhibitoren (Oligomycin, Rotenon) und ein Ionenträger (Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) gemessen. Die Krypta organoid metabolische Reaktion auf diese chemischen Verbindungen wurden erfolgreich durch wechselnde ECAR und OCR-Werte wider.

Cellular bioenergetischen Untersuchungen werden die gegenseitigen Wechselwirkungen zwischen Stoffwechsellage und Krankheitsrisiko und Phänotyp bei Krebs, Fettleibigkeit, Diabetes, Stoffwechselstörungen und mitochondrialen Erkrankungen aufzuklären und helfen Voraus Screening-Methoden mit unmittelbaren Auswirkungen für translationale Medizin. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für kleine Darmkrypten isolieren und Kultur Krypta Organoiden. Darüber hinaus führen wir eine neuartige Methode zur Krypta Organoid Kulturen für metabolische Assays verwenden.

Protokoll

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde von dem Ausschuss für die Ethik der Tierversuche des Albert Einstein College of Medicine genehmigt.

1. Crypt Isolierung und Kultur

1. Isolierung von Krypten aus dem Dünndarm:
   1. Isolieren Darmkrypten aus jedem Mausmodell von Interesse. Euthanize die Mäuse mit CO _2, gefolgt durch zervikale Dislokation.
   2. Öffnen Sie den Bauch längs und füllen den Dünndarm (SI) mit eiskaltem Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, PBS (-Ca ^2+; -Mg ²⁺⁾ mit 2x Antibiotika-Antimykotika (anti-anti). Rasch zu isolieren Dünndarm.
   3. Gründlich sezieren frei von mesenterialen Fett mit einem Skalpell. Achten Sie darauf, um das Gewebe zu perforieren - jederzeit feucht mit eiskaltem PBS halten das Gewebe. Öffnen Sie inteStine längs und gründlich mit eiskaltem PBS.
   4. Schneiden Sie Dünndarm in zwei Abschnitte und flach aus mit einem feuchten Wattestäbchen vorsichtig abkratzen Zotten mit einem vorgekühlten Rutsche. Kräftig in eiskaltem PBS mehrmals waschen.
   5. Inkubieren 3 min in 20 ml 1x PBS pro 3 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) /0.5 mM Dithiothreitol (DTT) für nicht-enzymatische Dissoziation des Gewebes.
   6. Geschnitten Gewebe in kleine Stücke (2-4 mm) mit einer Rasierklinge auf einem vorgekühlten Folie. Übertragen Sie die Stücke in einen 50-ml-Tube mit 20 ml eiskaltem PBS.
   7. Pipette nach oben und unten vorsichtig 10x mit einem 10 ml sterile Einwegpipette. Lassen Gewebefragmente zu sedimentieren durch die Schwerkraft. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Wiederholen Sie drei weitere Male; stellen Sie sicher, Überstand klar ist.
   8. 20 ml PBS pro 2 mM EDTA. Swirl und Inkubation bei 4 ° C für 30 min unter leichtem Schütteln.
   9. Lassen Gewebe Sediment und Überstand verwerfen. 15 ml eiskaltem PBS und Pipettennach oben und unten 5x mit einer 10 ml Pipette. Lassen Sie die Gewebefragmente Sediment zu sammeln und das Überstand als Fraktion 1 (F1). Wiederholen Sammeln F2-F5, jede Fraktion getrennt gehalten.
   10. 15 ml eiskaltem PBS und diesmal unter kräftigem Schütteln für 15 Sekunden. Sammeln Sie F6 und wiederholen Sie für F7, F8. Wenn Gewebestücke beginnen zu schweben, tippen, um ihnen helfen zu begleichen.
   11. Untersuchen Sie ein Aliquot jeder Fraktion unter dem Mikroskop. Pool jene Fraktionen, die Krypten.
   12. Übergeben Sie die gesammelten Fraktionen durch einen 70 & mgr; m Nylon Zellsieb, Sammeln Krypten in einem 50-ml-Tube.
   13. Zentrifuge bei 100 xg für 5 min bei 4 ° C, den Überstand verwerfen und Pellet in 10 ml eiskaltem PBS mit 2x Anti-Anti und Transfer Krypten in ein 15-ml-Tube. Wiederholen Sie den Wasch noch einmal.
   14. 2x Anti-Anti - einmal mit 10 ml eiskaltem ADF, Advanced DMEM / F-12 (Dulbecco "s Modified Eagle Medium / Ham" s F-12) Waschen Sie die Krypten.
   15. Waschen Sie die Krypten einmal mit 10 ml ADF - 1x Anti-Anti.
   16. Zählen Sie die Krypten mit einer Zählkammer. Passen Sie die Krypta Lösungsvolumen und Transfer zu einem 1,5-ml-Röhrchen, so dass die endgültige Krypta Konzentration bei resuspendiert wird 100-500 Krypten pro 50 ul gallertartige Proteinmischung (Matrigel) sein. Zentrifuge bei 100 × g für 5 min bei 4 ° C und resuspendieren Krypten im gelartigen Proteingemisch.
   17. Platte 50 ul Krypta - gallertartig Proteingemisch Suspension pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte (Wachstumsbereich: 2 cm ^2), sorgfältig Platzierung der Aufhängungseinbruch in der Mitte jeder Vertiefung. Pflegen Sie die Platte in einem CO _2, 37 ° C Inkubator für ~ 30 min, bis die Suspension verfestigt.
   18. In 500 ul eiskaltem komplette Kulturmedien (Advanced DMEM / F12 mit 1x Anti - Anti, 10 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), 1x GlutaMAX, 1x B27 Supplement, 1x N2 Supplement, 1 mM N-Acetyl-L-Cystein (NAC), 50 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), 100 ng / mlNoggin, 500 ng / ml R-Spondin).
       1. Rekonstitution Wachstumsfaktoren in 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS.
2. Crypt Organoide Kultur und Passage:
   1. Passage Krypta Organoiden 14-21 Tage nach der Aussaat (oder nach Bedarf) wie folgt:
      1. Ändern Medien jeden Freitag und Montag. Mittwochs, ersetzen die Hälfte der Medien mit frischem Medium.
   2. Entfernen Sie das Kulturmedium. Die Probe zweimal Waschen mit 500 ul PBS bei 5-Minuten-Intervallen.
   3. Entfernen PBS und sanft brechen die gallertartige Proteinmischung mit einem sterilen P1000 Mikropipettenspitze.
   4. 1 ml komplettes Kulturmedien auf ein einziges gut und resuspendieren Organoiden in 1 ml Medium.
   5. Sanft stören die Organoiden mit einem P1000 durch Auf- und Abpipettieren 20-30x (Check unter dem Mikroskop für die ordnungsgemäße Organoid Dissoziation mit einer guten Ausbeute Krypta bis eine einheitliche Technik wird entwickelt).
   6. Übertragen Sie die Krypten in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen;Zentrifuge bei 100 × g bei 4 ° C, 5 min.
   7. Zweimal Waschen des Pellets mit 1 ml komplettem Kulturmedien.
   8. Split in einem Verhältnis von 1: 3 oder 1: 6 wie erforderlich, Resuspendieren Krypten in 50 & mgr; l Matrigel pro Vertiefung. Gehen Sie wie oben (Abschnitt 1.1.16-18) beschrieben.
3. Crypt Organoide Freezing:
   1. Entfernen Sie das Kulturmedium. Die Probe in 500 ul PBS waschen.
   2. Verteilen das gallertartige Proteinmischung mit einem P1000 Pipettenspitze.
   3. 1 ml Medium auf ein einziges gut und resuspendieren Organoiden in 1 ml Medium.
   4. Vorsichtig brechen die Organoiden mit einem P1000 durch Auf- und Abpipettieren 20-30x.
   5. Übertragen Sie die Organoiden in ein 1,5-ml-Röhrchen. Zentrifuge bei 100 × g bei 4 ° C, 5 min.
   6. Zweimal Waschen des Pellets mit 1 ml komplettem Kulturmedien.
   7. Resuspendieren Krypten in 500 ul gefrierenden Medien.
   8. Transfer Krypten zu einem Kryoröhrchen, den Schlauch in einem Gefrierbehälter und Speicher in einem -80 ° C Gefrierschrank overnight.
   9. Übertragen Krypten zu flüssigem N ₂ Tank.
      1. Recover gefrorenen Krypta Organoiden durch schnelles Auftauen in einem 37 ° C Wasserbad. Waschen mit 500 ul komplettem Kulturmedium einmal, Zentrifuge bei 100 × g, 5 min und resuspendieren in gelatinösen Proteingemisch, und die Kultur wie oben beschrieben. Für bessere Erholung, fügen ROCK-Inhibitor (Y-27632) mit dem gefrierenden Medien.

2. Crypt Organoide Stoffwechsel Assay

1. 24-Well-Platte Zubereitung:
   1. Isolieren und zählen Krypten nach dem Protokoll (siehe Abschnitt 1.1 für crypt Isolation und Abschnitt 1.2 für crypt Durchgang).
   2. Resuspendieren Krypten in gallertartigen Proteinmischung (100-200 Krypten pro 20 ul).
   3. Platte Krypta-gallertartige Proteingemisch Suspension in einem 24-Well-Assayplatte (stellen Sie sicher, es gibt mindestens dreifacher Ausführung für jede Probe) und lassen Sie die Suspension bei 37 ° C in einem CO ₂ zu verfestigenInkubator; fügen Sie dann 500 ul komplette Kulturmedien.
   4. Kultur Krypten (wie in Abschnitt 1.1 beschrieben) und beobachten unter dem Mikroskop bis Krypten in voll entwickelten Organoiden wachsen.
2. Extracellular Flux Assay:
   1. Hydrat Patrone über Nacht in einem Nicht-CO ₂ (0% CO _2), 37 ° C Inkubator.
   2. Entfernen des Kulturmediums und waschen Organoiden zweimal mit 500 & mgr; l DMEM (ohne: Glucose, L-Glutamin, Natriumpyruvat und Natriumbicarbonat, und mit: Phenolrot). Warten Sie 5 min.
   3. Gib 675 & mgr; l pro Vertiefung Testmedium (DMEM mit 2 mM L-Glutamin und 5 mM D-Glucose) in jede Vertiefung.
   4. Überprüfen Krypta Organoiden mikroskopische Morphologie, um sicherzustellen, dass Organoiden und die gallertartige Proteinmischung intakt nach den Wäschen sind. Inkubieren für 1 Stunde in einer nicht-CO _2, 37 ° C Inkubator.
   5. Herstellung von 10 & mgr; M injizierbaren Verbindungen (Oligomycin, Carbonylcyanid-p-Trifluor-methoxy-phenyl-Hydrazon (FCCP), rotenone) in Testmedium.
   6. Set-up die Patrone durch das Laden 75 ul 10 uM injizierbaren Verbindungen in die Häfen der Kartusche nacheinander: Port A - Oligomycin; Port B - FCCP; und Port C - Rotenon (Die Endkonzentrationen während des Assays wird 1 & mgr; M).
   7. Inkubieren Kassette 30 min - 1 h bei 37 ° C in einer nicht-CO ₂ -Inkubator.
   8. Gleichzeitig schalten Sie den XF Analyzer und erstellen Sie die Assay-Protokoll-Vorlage.
   9. Zeigen Patrone und Gebrauchsplatte in XF Analyzer und führen Sie "Kalibrieren" Patrone.
   10. Überprüfen Krypta Organoiden mikroskopisch sicherstellen, dass sie auf die gallertartige Proteingemisch gebunden sind.
   11. Lastzellkulturplatte in Instrument und führen Testprotokoll.

Ergebnisse

Crypt Organoiden wurden 8 Monate alten C57BL / 6-Mäusen etabliert gereinigt Nagerfutter American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Intestinale Krypta Organoiden können in Kultur über einen längeren Zeitraum von einem einzigen crypt (1A, einzelne rote Pfeil) angebaut werden. Organoiden wachsen aus Krypta-ähnliche Strukturen in 18-20 Tagen in Kultur (1B, rote Pfeile). Krypten wurden alle 3 Wochen agiert und Organoiden effizient nach jedem Durchgang gewonnen.

Diskussion

Wir testeten die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und die extrazelluläre Ansäuerung Rate (ECAR) der Krypten von 8 Monate alten Mäusen isoliert und in Organoiden ex vivo gewachsen. Nach Messung der Basalrate wurde Krypta Stoffwechsel durch Zugabe Oligomycin, Carbonylcyanid bewertet -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) und Rotenon, nacheinander.

29 min (2A und 2B) - basale OCR und basalen ECAR wurden aus 0 aufgezeichnet. Am ^29. min, O...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free	BD Biosciences	356231
PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2	Life Technologies	20012-027
Advanced DMEM/F-12 (1x)	Life Technologies	12634-028
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium w/o glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	D5030
Phenol red sodium salt	Sigma-Aldrich	P4758	Final Concentration 15 mg/l in DMEM (D5030) - step 2.2.2
Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml	Life Technologies	15240-062	Final concentration 1x or 2x
Penicilin-Streptomycin, liquid	Life Technologies	15140-122	Final concentration 1x
Gibco® GlutaMAX™ supplement	Life Technologies	35050061	Final concentration 1x
Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M	Life Technologies	15630-080	Final concentration 10 mM
N-acetyl-L-cysteine, 25 g	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Final concentration 1 mM
100x N-2 supplement, liquid	Invitrogen	17502-048	Final concentration 1x
50x B-27® supplement minus Vitamin A, liquid	Invitrogen	12587-010	Final concentration 1x
Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50 μg	R&D Systems	3474-RS-050	Final concentration 500 ng/ml
Recombinant Murine EGF, 100 μg	Peprotech	315-09	Final concentration 50 ng/ml
Recombinant Murine Noggin, 20 μg	Peprotech	250-38	Final concentration 100 ng/ml
Gibco® L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Final concentration 2 mM
Gibco® glucose powder	Life Technologies	15023-021	Final concentration 5 mM
Ambion® 0.5 M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0	Life Technologies	AM9260G	Final concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8
[header]
DTT (dithiothreitol), 1M	Life Technologies	P2325	Final concentration 3 mM
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	0.1% in PBS
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044	1% in PBS
Recovery™ Cell Culture Freezing Medium	Life Technologies	12648-010
ROCK inhibitor (Y-27632)	Sigma-Aldrich	Y0503	Final concentration 10 μM
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	Final concentration 1 μM
Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	Final concentration 1 μM
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Final concentration 1 μM
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465	Final concentration 0.1 N in PBS
XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)	Seahorse Bioscience