العزلة والكمية Immunocytochemical توصيف الخلايا عضلي الابتدائية والخلايا الليفية من العضلات الهيكلية البشرية

Summary

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Abstract

إصلاح وتجديد العضلات والهيكل العظمي يتطلب العمل من الخلايا الأقمار الصناعية، والتي هي الخلايا الجذعية العضلية المقيمين. هذه يمكن أن تكون معزولة من عينات خزعة العضلات الإنسان باستخدام الهضم الأنزيمي وممتلكاتهم المنشأ العضلي درس في الثقافة. كميا، وهما أنواع الخلايا الملتصقة الرئيسية التي تم الحصول عليها من عملية الهضم الأنزيمي هي: (أ) الخلايا الأقمار الصناعية (وهو ما يسمى خلايا المنشأ العضلي أو خلايا السلائف العضلات)، التي تم تحديدها في البداية كما CD56 ⁺ CD56 وفيما بعد ⁺ / ⁺ desmin خلايا و (ثانيا) muscle- الليفية المشتقة ويدعى CD56 ^- وTE-7 ^+. الليفية تتكاثر بشكل فعال جدا في الثقافة والسكان الخلية المختلطة هذه الخلايا قد تجاوز خلايا المنشأ العضلي للهيمنة على الثقافة. عزل وتنقية من أنواع مختلفة من الخلايا من العضلات الإنسان تشكل بالتالي اعتبار المنهجي المهم عند محاولة للتحقيق في السلوك الفطري إما نوع من الخلايا في الثقافة. نحن هنا أن descrالمكتب الدولي للتربية نظام الفرز على أساس الهضم الأنزيمي لطيف من الخلايا باستخدام كولاجيناز وdispase تليها المغناطيسية خلية تنشيط الفرز (MACS) الذي يعطي كل من نقاء عالية (> خلايا المنشأ العضلي 95٪) والعائد الجيد (~ 2.8 × 10 ⁶ ± 8.87 ⁵ × 10 خلية / ز الأنسجة بعد 7 أيام في المختبر) للتجارب في الثقافة. ويستند هذا النهج على احتضان مختلطة السكان خلية مأخوذة من العضلات مع ميكروبيدات المغناطيسية الخرز مترافق إلى الأجسام المضادة ضد CD56 ومن ثم تمرير الخلايا على الرغم من مجال مغناطيسي. يتم الاحتفاظ CD56 ⁺ الخلايا بد أن ميكروبيدات حسب الحقل في حين CD56 ^- خلايا تمر دون عوائق من خلال العمود. تعليق خلية من أي مرحلة من مراحل عملية الفرز يمكن مطلي ومثقف. وبعد تدخل معين، مورفولوجيا الخلايا، والتعبير وتوطين البروتينات بما في ذلك عوامل النسخ النووية يمكن قياسها كميا باستخدام الوسم مناعي مع الاجسام المضادة المحددة وصورة عو rocessing وحزمة التحليل.

Introduction

إصلاح وتجديد العضلات والهيكل العظمي يتطلب العمل من الخلايا الأقمار الصناعية ^1، والخلايا الجذعية المنشأ العضلي ^2،3. في الجسم الحي وتوجد هذه الخلايا في حالة هادئة عكسية تقع بين غمد الليف العضلي والصفيحة القاعدية من كل myofibre، ولكن تصبح تنشيط لتتكاثر، تلف الصمامات وتفرق كما الأنسجة العضلية، وإصلاح وإعادة إنشاء ^3. الخلايا الأقمار الصناعية يمكن أن تكون معزولة من الشباب والمسنين عضلات الإنسان عينات الخزعة باستخدام الهضم الأنزيمي ⁴ وممتلكاتهم المنشأ العضلي يمكن بعد ذلك أن تدرس في الثقافة الابتدائية ^5. كفاءة هذه العملية بمعزل فيما يتعلق بكل من المحصول ونقاء السكان الخلية تعتمد على الأساليب المستخدمة، ويمكن أن تختلف من عينة لعينة. أنواع الخلايا اثنين الرئيسية ملتصقة تم الحصول عليها من عملية الهضم الأنزيمي هي الخلايا الأقمار الصناعية (خلايا المنشأ العضلي يطلق عليه الآن أو خلايا السلائف العضلات)، التي تم تحديدها في البداية باعتبارها خلايا CD56 ⁺ / desmin، وموالليفية المستمدة scle ويدعى CD56 ^- وTE7 ^{+ 5} خلايا. الليفية لديها معدل التكاثري السريع ولا تخضع اعتقال النمو لا رجعة فيه والتمايز النهائي على اتصال خلية خلية مثل خلايا المنشأ العضلي. وبالتالي في المختلطة السكان، قد تجاوز الخلايا الليفية خلايا المنشأ العضلي للهيمنة على الثقافة.

وغالبا ما كان ينظر الليفية باعتبارها تهيج لعلماء الأحياء العضلات، ومع ذلك، هناك الآن اهتماما متزايدا في الخلايا الليفية إلى خلايا تستحق الدراسة في حد ذاتها، لا سيما وقد ثبت أنها ليكون لها دور تعاوني مع خلايا المنشأ العضلي خلال إصلاح العضلات ⁶ . عزل وتنقية من أنواع مختلفة من الخلايا من العضلات الإنسان تشكل بالتالي اعتبار المنهجي المهم عند محاولة للتحقيق في السلوك الفطري لكل من أنواع الخلايا في الثقافة. مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) هو الطريقة التي يمكن فرز الخلايا لمزيد من الدراسة و / أو عدها وتحليل. وقد تبين FACS لإثراء موثوق خلايا المنشأ العضلي الإنسان، ولكن لم يكن العائد من الخلايا للثقافة اللاحقة حتى الآن ⁷ عالية. نظرا لإمكانية تكرار محدودة من الخلايا الجسدية مثل الخلايا المشتقة خلايا المنشأ العضلي الأقمار الصناعية وانتشار سيئة للغاية والتمايز المرتبطة الشيخوخة ^4، ثمة حاجة إلى نهج أكثر لطيف. ثقافات الألياف العضلية واحدة تقدم آخر، أقل عدوانية، يعني الحصول على الخلايا الأقمار الصناعية الفئران لا يزال مقيما في مكانها المناسب sublaminal وبعد تفعيلها في الثقافة ^8،9. ومع ذلك، وهذا هو في كثير من الأحيان غير ممكن من الإنسان المواد خزعة العضلات (لأن الألياف نادرا ما يمكن الحصول عليه من وتر إلى وتر) وهذا يعني أن هذه التقنية قد لا تكون في متناول العديد من مختبرات الأبحاث المهتمة في دراسة الخلايا المشتقة من عضلات الإنسان. وعلاوة على ذلك، فإن تقنية الألياف واحدة لا يوفر سوى أعداد الخلايا محدودة للغاية.

نحن هنا وصف نظام الفرز على أساس جنرالالهضم الأنزيمي TLE من الخلايا باستخدام كولاجيناز وdispase تليها اثنين جولات متتالية من خلية تنشيط المغناطيسية الفرز (MACS) الذي يعطي كل من نقاء عالية (> 95٪ خلايا المنشأ العضلي) والعائد (~ 2.8 × 10 ⁶ ± 8.87 × 10 ⁵ خلايا / ز الأنسجة) للتجارب في الثقافة. ويعتبر CD56 الذهب علامة سطح القياسية لتحديد الخلايا الأقمار الصناعية الإنسان في الموقع ¹⁰ و ¹¹ في المختبر، ويوفر المثالي سطح مرشح علامة لمرفق حبة. في هذا النهج الأجسام المضادة CD56 مترافق إلى أكسيد الحديد وملزمة الخرز مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic التي تحتوي على السكاريد إلى الخلايا ومرت عالية التدرج عمود فصل الخلية المغناطيسي وضعها في مجال مغناطيسي قوي ^12،13. تمتلئ الأعمدة الفصل مع مصفوفة من المغناطيسية الصوف الصلب أو الحديد المجالات التي تعمل على تركيز خطوط المجال المغناطيسي نحو سطحها توليد التدرجات حقل مغناطيسي قوي (~ 4tesla) ¹⁴. في هذه الأعمدة تنجذب حتى الخلايا المغناطيسية قليلا، وكثف إلى سطحها ^14. غير منضم (CD56 ^-) خلايا تمر عبر عمود في حين يتم الاحتفاظ CD56 ⁺ الخلايا المسمى مع ميكروبيدات المغناطيسية حتى إزالة من الحقل المغناطيسي ^12،15.

تعليق خلية من أي مرحلة من مراحل عملية الفرز يمكن مطلي في كثافة المطلوب لمزيد من التجارب. وبعد تدخل معين يمكن التعرف على المكونات الخلوية باستخدام مناعية، تصوير باستخدام واسعة المجال أو متحد البؤر المجهري مضان وتحليلها كميا باستخدام نهج تحليل الصور التي تسمح القياس الموضوعي السريع لجميع الخلايا المسمى في أي صورة معينة. في مختبرنا وقد استخدمنا هذا النهج الفرز immunomagnetic مزدوج تليها تحليل الصور ¹⁶ إلى إثبات أن CD56 ^- الخلايا الليفية الإنسان تحورها بسهولة في الخلايا الشحمية، في حين خلية المنشأ العضليالصورة الأصلية الأقمار الصناعية هي شديدة المقاومة لهذا التحويل مكون الشحم ^5.

Protocol

ملاحظة: للحصول على دراسات أجريت في مختبرنا أعطت جميع المواد المكتوبة، علم موافقتهم على المشاركة وأجريت جميع التجارب مع موافقة لجنة الأخلاقيات الخدمات الصحية الوطنية في المملكة المتحدة (لجنة أخلاقيات البحوث لندن، المرجع: 10 / H0718 / 10) ووفقا لل قانون الأنسجة البشرية وإعلان هلسنكي.

1. إعداد الأولي قبل خزعة العضلات (15 دقيقة)

1. جعل الإنسان الهيكل العظمي المتوسطة نمو العضلات. لالعقيمة 50 مل أنبوب مخروطي تخرج إضافة 2.5 مل من مزيج ملحق، 10 مل مصل الجنين العجل، والمضادات الحيوية (البنسلين / الستربتومايسين) والجلوتامين لتركيزات النهائية الصحيحة (الجدول 1) ثم ملء الأنبوب إلى 50 مل مع القاعدية الهيكل العظمي والعضلات المتوسطة.
2. وضع 15 مل من الهيكل العظمي والعضلات المتوسطة القاعدية في العقيمة 20 مل أنبوب مخروطي الشكل وتزن عليه. مرة واحدة وزنه مكان هذا الأنبوب على الجليد. استخدام هذا لاستقبال عينة العضلات الإنسان.
3. في أنبوب 20 مل أخرى إعداد 10 ملتر من محلول أنزيم كولاجيناز D وDispase الثاني لتركيز النهائي من 2 ملغ / مل لكل منهما عن طريق إذابة مأخوذة المخزون من هذه الإنزيمات في العضلات والهيكل العظمي المتوسطة القاعدية. فلتر تعقيم هذا الحل عن طريق تمرير من خلال مرشح 0.22 ميكرون. وضع هذا المزيج انزيم عقيمة في الحاضنة أو ماء الحمام عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في عملية الاحماء.
   ملاحظة: هذا مزيج من الأنزيمات هو ألطف قليلا من التربسين وأفضل يحافظ على الخلايا جدوى ^(17).
4. تخصيص طبق بتري وزوج من المشارط معقمة.

2. العضلات خزعة الداخلي (45 دقيقة، 1 ساعة)

1. قبل تجنيد المشاركين، الحصول على تصريح الأخلاقي الكامل والموافقة الإجرائية (بما في ذلك اللقاحات ذات الصلة لالمجربون) من جميع الهيئات الإدارية المعنية واللجان ومقدمي الرعاية الصحية (على سبيل المثال، الأخلاقية والمؤسسية والحكومية الخ).
2. إنشاء حقل معقمة وحول الساق (على سبيل المثال، مع ورقة الجراحية المعقمة) لد جيدا تنظيف المنطقة حول موقع خزعة مع وكيل المضادة للبكتيريا مطهر (الكلورهيكسيدين).
3. تخدير الموقع خزعة المقترحة على ساق والمتطوع عن طريق الحقن المحلي من 2٪ ليدوكائين في المنطقة تحت الجلد المغطي لفافة من العضلة المتسعة الوحشية العضلات.
4. إجراء شق واسعة ~ 5 مم باستخدام شفرة جراحية معقمة من خلال الجلد واللفافة وتنفيذ الإجراء خزعة بيرجستروم إبرة ¹⁸ مع شفط إضافية.
5. باستخدام ملقط معقم إزالة العضلات من التجويف إبرة وتزج في المتوسط ​​القاعدية على الجليد. نقل الأنسجة إلى المختبر لمزيد من المعالجة في أقرب وقت ممكن على الرغم من أن خلايا المنشأ العضلي قابلة للحياة ويمكن الحصول على بعد فترات 24 ساعة أو أكثر.
6. استخلاص المعلومات من الموضوع، وتطهير وختم موقع شق مع متعددة معقمة لاصقة شرائط الجلد الإغلاق واللباس جو معقم و مطهر مع غطاء مقاوم للماء الخارجي.

3. عزل المستمدة من العضلات السلائف سيLLS (1 ساعة و 30 دقيقة)

1. إزالة الأنبوب الذي يحتوي على عينة العضلات وتزن عليه (جعل متأكد من أنبوب جاف بواسطة المسح مع الأنسجة). حساب وزن العينة العضلات عن طريق طرح وزن الأنبوب الذي يحتوي المتوسطة وعينة من أنبوب يحتوي المتوسطة وحدها.
2. دوامة الحل عدة مرات لغسل عينة من الدم في العضلات. السماح للالرواسب العضلات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-60 ثانية.
   1. إزالة ما يقرب من كامل حجم متوسط ​​من الأنبوب، أولا باستخدام المساعدات pipetting لالإلكترونية أو الشافطة ولكن ترك ما يقرب من 2-3 مل في الأنبوب.
   2. عكس الأنبوب إلى طبق بتري معقمة السماح السائل المتبقي لحمل عينة العضلات إلى الطبق. استخدام مشرط معقم لاستخراج fragments.Rotate أي العضلات المتبقية طبق لتعبئة السائل المتبقي وإزالته مع pipette.Remove أي قطع مرئية من الدهون أو النسيج الضام.
3. لالخزعات وزنها 100-400 ملغ، إضافة 3 مل من الحارةقطع حل انزيم واستخدام المشارط معقمة العينة العضلات الى قطع صغيرة جدا (<1-2 ملم ^3).
4. باستخدام واسعة تتحمل 25 مل ماصة وضع شظايا العضلات وإنزيم حل ونقل إلى العقيمة 10 مل أنبوب مخروطي الشكل. غسل طبق بتري مع 3-5 مل مزيد من كولاجيناز وحل انزيم dispase وباستخدام أصغر 10 مل ماصة جمع أي المتبقية شظايا العضلات ومكان في أنبوب. حجم المحدد ليست حرجة.
5. ضع القارورة في الحاضنة 37 درجة مئوية (أو حمام ماء) لمدة 60 دقيقة مع سحن (10 مل ماصة) كل 15 دقيقة.
6. بعد 1 ساعة إنهاء تفارق الأنزيمية بإضافة وحدة تخزين ما يعادل الطازجة المتوسطة النمو قبل تحسنت وتمرير تعليق الخلية من خلال مرشح 100 ميكرون لإزالة أي حطام myofibre كبير. أجهزة الطرد المركزي في حل الخلية التي تمت تصفيتها في 657 x ج لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة (20-25 C).
7. resuspend الكرية خلية في 5-7 مل من وسط النمو وصفيحة في غير المصقول T-25زراعة الأنسجة قارورة. نقل هذا الطبق إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع CO ₂ 5٪ لمدة 7 أيام. تغيير المتوسط ​​كل 48 ساعة. في هذه المرحلة خلايا المنشأ العضلي صغيرة جدا وتقريب ويصعب تمييز من الخلايا غير المنشأ العضلي.
   1. في أول تغيير المتوسطة، الطرد المركزي طاف لتكوير أي خلايا غير ملتصقة. اعادة تعليق هذه في متوسطة جديدة وإعادة لوحة.
8. بعد 7 أيام في الثقافة، وضمان أن يكون تعلق معظم خلايا المنشأ العضلي (والخلايا الليفية) ولكن الخلايا لم تصل بعد التقاء. تنقية السلائف المنشأ العضلي وأداء MACS وفقا لبروتوكول ضعت أصلا من قبل في مختبرات Gherardi وChazaud ^19،20 وزيادة تعديلها من قبل لنا ^5.

4. Immunomagnetic الخرزة فرز الخلايا استنادا CD56 التعبير (1.5 ساعة)

1. بعد 7 أيام شطف أحادي الطبقة الخلية (التي عادة ما سوف تحتوي على 50-60٪ خلايا المنشأ العضلي ⁵⁾ مع ثلاثة التبادلغرفة حل العازلة الحرارة الفوسفات (PBS) لإزالة أي المتبقية الخلايا غير ملتصقة والحطام من العزلة.
   1. Trypinize الخلايا (0.04٪ التربسين في كا ²⁺ خالية PBS مع 0.73 ملي EDTA) لمدة 3 دقائق. بمجرد فصل الخلايا، إضافة 5-10 مل من الهيكل العظمي المتوسطة نمو العضلات لمنع الإفراط في الهضم. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 657 x ج لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة (20-25 C) و resuspend في حجم مناسب من المتوسط ​​كاملة لفرز الأصوات.
   2. عدد عينة صغيرة من تعليق خلية باستخدام طريقة المطلوب (على سبيل المثال، وذلك باستخدام عدادة الكريات أو جهاز العد الآلي) وحساب بدءا عدد الخلايا وقدرتها على البقاء.
2. لوحة بضع آبار في (السفينة أو أكبر إذا لزم الأمر) 96 لوحة جيدا لimmunocytochemical أو تدفق توصيف تستند الخلوي من السكان قبل الفرز (الخلايا الليفية والخلايا المنشأ العضلي سيكون الخلايا أنواع الأكثر وفرة الحالية).
3. إلى إعلان تعليق خليةد 15 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة لتخفيف الخلايا والمتوسطة. الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى و resuspend لهم في 170 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة فرز عازلة (1٪ BSA في محلول الشطف MACS، تعقيمها عن طريق تمرير من خلال مرشح 0.22 ميكرون).
   1. إضافة 35 ميكرولتر من ميكروبيدات المغناطيسية المختلطة جيدا مترافق إلى الأجسام المضادة CD56 الابتدائي (استنساخ AF12-7H3، 130-050-401) إلى حل الخلية، ماصة لخلط وتترك لاحتضان لمدة 15 دقيقة على 4 مئوية مع الإثارة لطيف في نقطة في منتصف الطريق.
4. بعد مرور فترة الحضانة، وتمييع الحل الخلية وحبة مع 10 مل من MACS الفرز العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 657 x ج لمدة 6 دقائق. Resuspend الخلايا في 1 مل من فرز العازلة.
5. إضافة فاصل بالاعمال (المغناطيس) إلى MACS عقد الموقف. رعاية عند إضافة المغناطيس إلى موقف نظرا لمجال مغناطيسي قوي. فتحة في العمود وتناسب مرشح ما قبل الانفصال. ماصة 1 مل من فرز عازلة من خلال تصفية ما قبل الانفصال وعمود لتزييت.
6. فوريااعل بعد ذلك المزيج بلطف تعليق الخلية وتقطر كامل 1 مل من خلال تصفية ما قبل الانفصال وإلى العمود.
7. غسل العمود ثلاث مرات مع 1 مل (أو 500 ميكرولتر) الفرز العازلة. جمع الخلايا غير المدورة التي تمر عبر العمود على نوع الأول في العقيمة 50 مل أنبوب مخروطي يحتوي على كمية صغيرة من النمو المتوسطة. هذه الخلايا هي أول CD56 نوع ^- جزء وسيتم التخصيب لالليفية النسيج الضام. لا تدع العمود تجف بين يغسل.
8. بعد يغسل إزالة عامل التصفية ما قبل الانفصال وإضافة 2.5 مل من العازلة MACS إلى العمود. ثم على الفور بإزالة عمود من المغناطيس وجمع أول نوع CD56 ⁺ جزء في أنبوب 50 مل مخروطي منفصل بالضغط على المكبس إلى أعلى العمود.
   ملاحظة: الغطاس يناسب بإحكام جدا في الجزء العلوي من العمود ويمكن أن تكون خادعة تماما للعمل. ومع ذلك، يجب أن يتم ذلك في حين أن العمود لا يزال FULL من العازلة، لذلك مطلوب السرعة. تجنب الاكتئاب المكبس من الصعب جدا وسريعة.
9. قبل الطلاء تقييم جدوى الخلايا باستخدام، على سبيل المثال، وفحص التريبان الأزرق. تحديد النسبة المئوية للخلايا قابلة للحياة من حقول 8 × 1 مم ² العد (مجلسي عدادة الكريات).
   ملاحظة: يمكن للخلايا أن تكون إما مفردة أو مزدوجة مرتبة حسب النقاء المطلوبة. إذا فعلت بعناية هذه الخلايا تتسامح مع إجراء الفرز مزدوج بشكل جيد للغاية وقابلية عالية جدا> 95٪. للفرز مزدوج، وإنشاء عمود آخر، على تليين مع 1 مل فرز العازلة والمضي قدما من الخطوة 4.6.
   1. إذا التصوير التي يتعين القيام بها، وخلايا لوحة مباشرة على coverslips الزجاج تقع في 24 أطباق جيدا ²¹ والمغلفة مع اختيارك من جزيء ECM لمرفق الخلية (مثل الكولاجين أو laminin). هنا، استخدم 0.1-0.5 ملغ / مل الكولاجين-I (الجدول 3).

5. الفرز من هوموالخلايا الليفية المشتقة من العضلات مباشرة بعد عزل.

1. لتنقية الأسلاف الليفية مباشرة بعد العزلة، وتوظيف البروتوكول على النحو الوارد أعلاه مع إجراء التعديلات التالية:
   1. مباشرة بعد زنازين العزل resuspend في المتوسط ​​كاملة ومرشح مرة واحدة على الرغم من مصفاة 100 ميكرون خلية ثم مرة أخرى على الرغم من مصفاة 40 ميكرومتر. إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني وتدور في 657 x ج لمدة 6 دقائق.
   2. resuspend الخلايا في MACS فرز العازلة واحتضان في ميكروبيدات الخلايا الليفية مكافحة الإنسان ل15-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   3. استخدام عمود LS والفاصل ميدي-MACS (الجدول 3) وتثبيت 40 ميكرون تصفية ما قبل الانفصال.
   4. إجراء واحد أو نوعين اعتمادا على النقاء المطلوبة، ونقل الخلايا في أقرب وقت ممكن إلى المحتوية على مصل المتوسطة، إجراء العد، وصفيحة بها على الكثافة المطلوبة

6. Immunocytochemical تلطيخ (1 اليوم، وبين عشية وضحاها).

1. حلالخلايا في آبارهم بإضافة حجم مساو من 8٪ امتصاص العرق في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة لمدة 10 دقيقة مع الإثارة لطيف. بعد 10 دقيقة نضح تثبيتي، ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني.
2. لimmunostain مستضدات سطح الخلية، وخلايا كتلة لا يقل عن 1 ساعة في 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني ومن ثم تحقيق مع الأجسام المضادة الأولية ذات الصلة (الجدول 4).
   1. لمستضدات الخلايا، permeabilize الخلايا بعد تثبيت بإضافة 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني مع 1٪ BSA ونان ₃ (0.01٪) لمدة 10 دقيقة، ثم منع واحتضان مع الأجسام المضادة الأولية. أداء جميع حضانات الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة (أو على 4 درجات مئوية) مع الإثارة لطيف على منصة هزاز.
3. إزالة الأجسام المضادة الأولية غير منضم ويغسل خلايا ثلاث مرات مع PBS الباردة. احتضان لمدة 1 ساعة الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى الأنواع الخاصة (الجدول 4) في درجة حرارة الغرفة.
4. بعد إزالةالأجسام المضادة الثانوية غير منضم، شطف الخلايا مع ثلاثة تبادل PBS ثم مباين مع صبغة الفلورسنت DNA هويشت 33342 (1 ميكروغرام / مل) الحل لمدة 10 دقيقة على منصة هزاز.
5. لتصور في وقت واحد في كل من مستضدات سطح الخلية ومستضدات الخلايا، والخلايا التحقيق لأول مرة مع الأجسام المضادة الأولية إلى الخلية المستضدات السطحية تليها الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لهم. وبعد ذلك، إعادة إصلاح-الخلايا في البارد PFA، permeabilize، كتلة واحتضان مع الأجسام المضادة الأولية ضد المستضدات حشوية أو نووية تليها الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لهم.
6. بعد تلطيخ، وإزالة coverslips من الآبار الخاصة بهم باستخدام ملقط المنحنية وشطف الجزء الخلفي من ساترة باستخدام الماء المقطر. وضع الخلية ساترة تنزلق على قطرة من مكافحة تتلاشى تصاعد المتوسط ​​مجموعة ²² على شريحة المجهر والزجاج.

7. النفط الأحمر O تلطيخ في الجمع مع مناعي تلطيخ الخلايا (2 ساعة)

1. كشفالمحتوى الدهني للخلايا مطلي في 24 أطباق جيدا من قبل تلطيخ مع النفط الأحمر O (1 - ([4- (Xylylazo) زايليل] [أزو) -2-نافثول) ^5،23. أولا إعداد محلول المخزون من 0.5٪ (ث / ت) زيت الأحمر O عن طريق إذابة 500 ملغ من النفط الأحمر O في 60 مل من 99٪ الأمين ثلاثى فوسفات و 40 مل من الماء المقطر. الحفاظ على هذا الحل في درجة حرارة الغرفة في الظلام حتى الاستخدام.
2. في يوم من الاستخدام، وجعل 36٪ (ث / ت) حل الأمين ثلاثى الفوسفات العمل، والتي تحتوي على 12 مل من محلول المخزون النفط الأحمر O و 8 مل من الماء المقطر. تصفية هذا الحل من خلال ورق الترشيح عدد 42 لإزالة كافة تبلور النفط الأحمر O (الذي يضعف جودة الصورة).
3. تدفئة بلطف هذا الحل يعمل في حمام مائي لمدة 1 ساعة وبعد ذلك يتم نسج الحل في 1،200 x ج لمدة 6 دقائق. إزالة طاف وتصفية مرة أخرى من خلال ورق الترشيح (رقم 42) ونقل إلى أنبوب 20 مل الطازجة.
4. بعد أن تم إصلاح الخلايا، permeabilised وimmunostained، إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميكرولتر من النفط الأحمر O / ثلاثي إيثيل-فوسphate حل للآبار لمدة 60 دقيقة. تريتون-X في التركيز المستخدم هنا للpermeabilisation غشاء الخلية لا يؤثر المحتوى الدهني الخلوي ^23.
   ملاحظة: زيت الأحمر O هو متحمس من قبل موجات بين 540 و 580 نانومتر، وبالتالي تصفية تكساس الأحمر يمكن استخدامها للكشف عن النفط الأحمر O الانبعاثات في مضان المجهري ^23. لاحظ أن الانبعاثات مضان من النفط الأحمر O يمكن أن تسرب بعض الأحيان في القناة الحمراء حتى إذا تم صبغ الخلايا (أي محتوى الدهون، وارتفاع جدا) بقوة جدا.
5. بعد مرور فترة الحضانة، وإزالة الزائد النفط الأحمر يا وشطف الخلايا خمس مرات مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. جبل لل coverslips كما لالمناعية كما هو موضح في القسم 6. الكشف عن النفط الأحمر O صبغ من قبل كل من brightfield / النقيض من المرحلة المجهري أو بواسطة المجهر epifluorescence باستخدام فلتر تكساس الأحمر (التحول مجانا، EX BP 560/40، BS FT 585، EM BP 630 / 75، كارل زايس).

8. الحصول على الميكروسكوب من الإسفار المجهري لاحقة إنalysis

ملاحظة: تأكد من أن ينزلق إلى أن مقارنة الكمية هي ملطخة مع نفس الحلول، صورت في ظروف مماثلة (على سبيل المثال، والتعرض، وكاميرا وإعدادات اكتساب الخ) والمأسورة في الدورة المجهري نفسها. كما ينبغي أن تكون كل التنسيقات بعد الحيازة متطابقة ويكون بما يتفق بدقة مع المبادئ التوجيهية المقترحة للصور الرقمية ^24.

1. لاقتناء صورة (المجهر widefield)، بدوره على مصدر ضوء المجهر ومضان ويترك لمدة الكمية الموصى بها من الوقت للسماح للمصدر الضوء مضان في عملية الاحماء والاستقرار.
2. ضبط الحالي المظلم للكاميرا عن طريق عرقلة مسار الضوء إلى الكاميرا. الحصول على صورة في أقصى القرار، واستخدام هذا لتصحيح الصور المكتسبة في وقت لاحق.
3. إلقاء الضوء تحقيقات مناعي من قبل epifluorescence ألقاها أدلة ضوء السائلة (أنبوب مرن من دنة فلورية مليئة النفط phenylmethyl السيليكون) لالثانية إشارات تصور من خلال الحمراء (تعيين مرشح تعيين 45 HQ تكساس التحول الأحمر الحرة والأخضر (فلتر 44 FITC تحول الحرة الخاصة) والأزرق (تعيين مرشح 49 تحول دابي تمريرة الحرة) الفرقة مرشحات على مجهر مقلوب برنامج التحصين الموسع ومضان (10X، 20X، 40X، تخطيط الأهداف اللازيغية مع 0.25، 0.75، 0.95 فتحات العددية على التوالي).
4. لتجنب بكسل تشبع العثور على التعرض الأمثل ضمن مجموعة خطية من كاشف لكل علامة فلوري باستخدام ميزة "التعرض المفرط" للبرنامج الحصول على الصور. تقديم مذكرة من التعرض موحد لكل تسمية الفلورسنت.
5. التقاط القنوات الفردية وحفظ الرمادي أو شجار pseudocolored (تنسيق ملف صورة الموسومة) ملفات الصور في عمق أعلى قليلا (يفضل 16 بت - 65،536 القيم الرمادية) التي يقدمها جهاز التسجيل (على سبيل المثال تبريد CCD (إلى جانب جهاز مشحونة) تركيبها على المجهر) . تعيين دقة الصورة لس 1،388 1،040 أو أعلى. تأكد من تضمين شريط نطاق أو كائن من دي معروفأبعادها في الصورة.
6. حيثما أمكن حفظ الملفات في 16 بت الموسومة شكل ملف صورة (.tiff) وليس بتنسيق jpeg لمنع فقدان المعلومات ^25.
7. إذا كان هناك أي مخاوف بشأن التوزيع المتساوي للإضاءة (البرمجيات واحدة مع المجهر قد يكون التصحيح التلقائي لهذا) اتخاذ "الميدان مسطح" صورة ساترة دون خلايا ولكن الملون والتي تقام في نفس الطريق الشرائح التجريبية الاقتضاء؛ وهذا يمكن أن تستخدم لتصحيح عيوب الإضاءة بعد الحيازة في برنامج تحليل الصور.
8. لاقتناء صورة (المجهري متحد البؤر)، وتحسين مكاسب كاشف وقوة الليزر لكل تجربة التصوير (تجنب التشبع). بشكل عام، ومضان قياس يتناسب مع مستوى قوة الليزر. تعيين حجم الثقب إلى '1 متجدد الهواء "لتحقيق نسبة أفضل إشارة إلى الضوضاء (ويمكن تحقيق تحسين دقة عند 0.5 متجدد الهواء لإشارات قوية بشكل خاص). اتخاذ المقاطع البصرية على مستويات مختلفة على طول محور Z من خلال النملةخلايا ibody المسمى وحفظ الحد الأقصى لإسقاط 16 بت لكل قناة لتحليل الصور.

9. قياسات أداء من fluorescently المسمى عوامل النسخ النووية عن طريق معالجة الصور وتحليل البرمجيات (5 دقائق لكل مجال الرؤية).

1. وصول ملفات الصور شجار الفردي وتراكب المقابلة القنوات عن طريق النقر والسحب صورة إلى أخرى. وسيكون لكل قناة ثم تظهر كطبقة منفصلة في لوحة الطبقات.
2. حدد التخفيف من القائمة مرشح للسماح للطبقات تحت لأن تصور في وقت واحد. بدلا من ذلك، وضبط عتامة الطبقات العليا إلى 50٪.
   يمكن حفظ الصور المشاجرة مع 'ضياع' إل زد دابليو (LZW) ضغط البيانات إلى انخفاض أحجام الملفات دون فقدان المعلومات: ملاحظة.
3. في إطار التحليل (تحليل> تحديد نقاط البيانات> مخصص)، حدد تحليل واختيار القياسات المطلوبة (على سبيل المثال، والكثافة المتكاملة، يعني كثافهذ، دائرية، الرسم البياني الخ). تجاهل أي قياسات غير الضرورية عن طريق إلغاء تحديد المربع المجاور لهم. إذا كانت هناك حاجة القياسات منطقة في ميكرون انقر على تحليل> مجموعة قياس مقياس. ستقوم الأداة حاكم تظهر تلقائيا - تتبع طول الشريط على نطاق وتدخل طوله معروف في ميكرومتر. ثم يقوم البرنامج تحويل القياسات المنطقة إلى ميكرون مربع.
   ملاحظة: إذا تم تحديد تحليل الرسم البياني، عندما يتم تسجيل القياسات ستظهر مجلد إضافي (موقع والتي يمكن المختار) مع 8 رسوم بيانية قليلا في كل مجال الاختيار الفردية في صورة مجهرية وكذلك الجمع من كل الاختيارات الفردية (هذا يبدو دائما كما الرسم البياني-1 إذا تم إجراء اختيارات متعددة). لا يمكن إجراء هذا التحليل من قبل البرنامج في شكل 16 بت، ولكن مفيد جدا لدراسة توزيع كثافة بكسل في جميع أنحاء كائن من الفائدة.
4. لتحليل كثافة مضان النووية بناء أول representative "اللون نطاق الاختيار قناع" (CRSM) لهويشت أو DNA الملون دابي لتحديد المجال النووي. وحالما يتم مضافين الصور القناة المطلوبة، ينبغي أن تترك فقط طبقة قناة هويشت في الرأي ضمان "رمز العين" المجاور له في علامة التبويب طبقات يتم تحديد ومن ثم يتم تمييز طبقة (يتحول الأزرق)، في حين كل الطبقات الأخرى ينبغي أن تكون إلغاء تحديد. تأكد من تعيين القائمة المنسدلة المزج إلى "طبيعي" في علامة التبويب الطبقات.
5. فتح مربع الحوار متوسط ​​اللون (تحديد> لون المدى) وتعيين الخيار المنسدلة التحديد إلى "أخذ عينات الألوان. مع المعاينة اختيار مجموعة 'قناع سريع "(خلفية حمراء) تحديد كافة درجات اللون الأزرق داخل نواة من خلال عقد التحول الرئيسية (يظهر علامة' + ') والنقر داخل نواة باستخدام أداة قطارة العين التي تظهر.
   1. إذا تم تحديد نغمات غير المرغوب فيها، إزالتها عن طريق الضغط على مفتاح Alt (في 'يبدو ─'sign) والنقرعليها. الحفاظ على نطاق وضبابي عند مستوى الصفر بحيث يتم تضمين نغمات اللون فقط المحددة يدويا في القياس وينبغي أن يترك "مجموعات اللون المترجمة 'دون رادع.
6. حفظ هذا CRSM على القرص الثابت للكمبيوتر بمثابة-برنامج محدد استخراج ملف (ملف .AXT). مع مجال عشوائي آخر من النوى، وتحميل وتحديث وحفظ CRSM (حدد، لون المدى، تحميل). هل هذا من أجل لا يقل عن خمسة حقول عشوائية للتأكد من أن التحديدات النووية التمثيلية.
   1. استخدام نسخة ملونة من صورة رمادية لإنشاء قناع لعزل الميزات لأن العين البشرية هي أكثر قدرة على التمييز بين ظلال مختلفة من اللون من بين ظلال من الرمادي ²⁶ متفاوتة.
7. استخدام CRSM النووي إلى المناطق النووية شريحة لتلطيخ. مرة واحدة وقد تم اختيار نوى انقر على الصورة> تعديل> عتبة وتحريك شريط التمرير على طول الطريق إلى اليمين، من النوع الذي نوى يتحول إلى اللون الأسود. بدلا من ذلك،الحق فوق وحدد "ملء" ثم اختر 'املأ ل: أسود. ثم انقر على اختر> العكسية والآن اضغط حذف لإزالة كافة الخلفية (إذا ظهر الخيار اختيار "ملء إلى: الأبيض '). هذا binarizes أساسا الصورة بناء على اختيارك. ثم تحميل البرنامج المساعد مستجمعات المياه من علامة التبويب مرشحات لفصل تداخل نوى (مرشح> صورة الثنائية> فصل ميزة مستجمعات المياه).
   1. إذا العديد من نوى هي متداخلة بشكل كبير، وإزالة النوى من التحليل من خلال إلغاء منهم (امسك مفتاح Alt ورسم فضفاضة من حولهم مع أداة لاسو).
8. على طبقة النووية الآن الثنائية، انتقل إلى تحديد> لون المدى و> الظلال، لتحديد نوى الفردية. بديل التحول عقد وانقر في أي نواة سوداء واحدة. وعلى الفور يتم اختيار كل نوى. ثم نقل هذا التحديد إلى الطبقة التي تحتوي النسخ النووي عامل تلطيخ (على سبيل المثال myogenin) عن طريق اختيار تلك الطبقة وإلغاء تحديد جميعالطبقات الأخرى. سوف تظهر خطوط يسيرون الآن موقف نوى في القناة myogenin.
9. إذا كان يعمل مع الصور pseudocolored انقر فقط على لوحة القنوات (إلى اليمين من علامة التبويب طبقات) وحدد فقط قناة خضراء (سوف تظهر الصورة الآن الرمادي). ثم انقر على صورة>> وضع درجات الرمادي. تحذير سوف تظهر "تسطيح الطبقات المرئية وتجاهل الطبقات المخفية" انقر فوق موافق، ثم تحذير آخر يقول "تجاهل قنوات أخرى" انقر فوق موافق مرة أخرى. سوف فقط طبقة واحدة من الرمادي اختيار نوى أن يكون الآن موجودة في لوحة الطبقات.
   1. انقر القياسات سجل في سجل القياس للحصول على بيانات عن نوى المحدد. إذا كانت طبقة ليتم تحليلها (على سبيل المثال myogenin تلطيخ) هو بالفعل 16 بت الخام صورة رمادية ثم ببساطة اضغط تسجيل القياسات.
   2. تصدير القياسات اختياره TXT الملف إلى الموقع الذي تختاره. هذه يمكن بعد ذلك مواصلة تجهيزها وتحليلها في غيرها من البرامج معالجة البيانات صackages
      ملاحظة: تحرير> الأمر الوراء خطوة (اضغط كل من البديل، والسيطرة وZ مفاتيح في نفس الوقت) يعيد جميع الطبقات السابقة إذا لزم الأمر.
   3. صحيح لعدم مضان الخلفية محدد ²⁷ للنتائج أن تكون الكمي وقابلة للمقارنة كما قياسات كثافة مضان دائما خليط من الإشارات والخلفية.
      1. حدد أداة التحديد مربع وتحقق "حجم ثابت" اختيار 20 من 20 بكسل (أو أكبر إذا رغبت واعتمادا على confluency من الخلايا في الصورة). في حين عقد التحول اختيار عشرة أو أكثر من مجالات خلفية المنتشرة في مجال الرؤية. اضغط على "القياسات سجل 'في سجل القياس.
      2. حساب متوسط ​​كثافة المتكاملة (مجموع كل القيم الرمادية بكسل) لكل بكسل من جميع المناطق الخلفية المحدد 10 (نظرا باسم 'يعني قيمة الرمادية "في سجل القياس). مضاعفة متوسط ​​كثافة الخلفية لكل بكسل من قبل عدد البكسل في كائن الهدف ( أي أن كل نواة) لإعطاء متوسط ​​الخلفية لكل كائن.
      3. مضان خلفية طرح من الكائنات كثافة متكاملة الأصلية لانتاج قيمة تصحيح خلفية النهائية. ويمثل هذا النهج لحقل محتمل لاختلاف الميدانية في مضان الخلفية غير محددة.
         ملاحظة: إنه من الأهمية بمكان لتحديد المناطق الخلفية الحسنة النية الوحيدة لأن هذا التصحيح له تأثير كبير على القيم النهائية. التكبير في استخدام عدسة مكبرة ويوصى عند اتخاذ الاختيارات.
      4. قد يكون من المفيد أيضا أن تقسيم الخلفية القيمة العامة تصحيحها عن طريق مجال نواة بالبكسل (نفس أخذ متوسط ​​مستوى الرمادي / كثافة في النواة) لتقليل أي تأثير محتمل للالنووية إشارة الخلفية المترجمة التي من شأنها أن تسهم أكثر لكثافة متكاملة القيمة مع زيادة حجم النووي (الشكل 3C).

النتائج

الخلايا والخلايا الليفية المنشأ العضلي المنقى يمكن تربيتها في مكون الشحم متوسطة التمايز لمدة ثلاثة أيام تليها مكون الشحم المتوسطة التغذية من أي مكان ما بين 7-30 أيام لتقييم قدرتها على تكون الشحم. باستخدام السكان الخلية المنقى، وأظهر النفط الأحمر O تلطيخ في تركيبة مع ا...

Discussion

وصفناها إجراء فرز immunomagentic لتخصيب انتقائية السلائف مأخوذة من العضلات البشرية من عينات صغيرة من المواد خزعة العضلات. وكانت هذه التقنية لا تقدر بثمن في مختبرنا للتغلب على فقدان الثقافات مأخوذة من العضلات الإنسان إلى الخلايا الليفية، ولكن أيضا لفهم سلوك فريد من السكان ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase  D	Roche	11088866001
Dispase II	Sigma	D4693-1G	Must be filter sterilized before use
Trypsin/EDTA	(Gibco) Invitrogen	15400-054
100 μm cell strainer	BD Biosciences	352360
Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid)	Sigma, Dorset, UK	C8919
Minisart SRP15 syringe filter (0.2 μm)	Sartorius	17573ACK	Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane
CD56 human Microbeads	Miltenyi Biotech	130-050-401	Be aware of the limited shelf life of microbeads
Anti- fibroblast Microbeads, human	Miltenyi Biotech	130-050-601
40 μm Pre-separation filters	Miltenyi Biotech	130-041-407
Large Cell Collumns	Miltenyi Biotech	130-042-202	These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here.
LS columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
MiniMacs Seperator	Miltenyi Biotech	130-042-102	This separator fits the large cell column but not the LS column.
MidiMACS	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS multistand	Miltenyi Biotech	130-042-303
BSA	Sigma		Must be filter sterilized before use
Oil Red O	Sigma	O0625
Triethyl phosphate	Sigma	538728
Whatman Paper	Sigma	Z241121-1PAK	No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering.
ProLong Gold Antifade Reagent	Molecular Probes, Invitrogen	P36930	This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence.
AxioVision	Carl Zeiss	Contact Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended	Adobe (purchased from Pugh Computers)	ADPH16982*