Isolamento e quantitativa immunocitochimica caratterizzazione di cellule miogeniche primarie e fibroblasti da muscolo scheletrico umano

Riepilogo

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Abstract

La riparazione e rigenerazione del muscolo scheletrico richiede l'azione di cellule satelliti, che sono le cellule staminali muscolari residente. Questi possono essere isolati da campioni di biopsia muscolare umana utilizzando la digestione enzimatica e le loro proprietà miogenici studiate in cultura. Quantitativamente, i due principali tipi di cellule aderenti ottenuti dalla digestione enzimatica sono: (i) le cellule satellite (chiamate cellule miogeniche o cellule precursori del muscolo), identificato inizialmente come CD56 ⁺ e poi come ⁺ desmina ⁺ cellule CD56 / e (ii) muscolo- fibroblasti derivati, identificati come CD56 ^- e TE-7 ^+. I fibroblasti proliferano molto efficiente in cultura e in popolazioni di cellule miste queste cellule possono invadere le cellule miogeniche a dominare la cultura. L'isolamento e purificazione di diversi tipi di cellule di muscolo umano è quindi un importante considerazione metodologica quando si cerca di studiare il comportamento innata di entrambi i tipi di cellule in coltura. Qui DESCRIBE un sistema di ordinamento basata sulla digestione enzimatica delicata delle cellule usando collagenasi e dispasi seguita da magnetico cellule attivate classificare (MACS) che fornisce sia una purezza elevata (> cellule miogeniche 95%) e buona resa (~ 2,8 x 10 ⁶ ± 8.87 x 10 ⁵ cellule / g di tessuto dopo 7 giorni in vitro) per esperimenti in coltura. Questo approccio si basa sul incubando la popolazione mista di cellule derivate muscolare con microsfere magnetiche microsfere coniugate ad un anticorpo contro CD56 e poi passando cellule se un campo magnetico. CD56 ⁺ cellule legate a microsfere sono conservati dal campo, mentre CD56 ^- le cellule passano senza impedimenti attraverso la colonna. Le sospensioni cellulari da qualsiasi fase del processo di selezione possono essere placcati e colto. Dopo un determinato intervento, morfologia cellulare, e l'espressione e la localizzazione delle proteine ​​compresi fattori di trascrizione nucleare può essere quantificato utilizzando etichettatura immunofluorescenza con anticorpi specifici e un'immagine processing e pacchetto di analisi.

Introduzione

La riparazione e la rigenerazione del muscolo scheletrico richiede l'azione delle cellule satelliti ^1, le cellule staminali miogeniche ^2,3. In vivo esistono queste cellule in uno stato di quiescenza reversibilmente situato tra il sarcolemma e la lamina basale di ogni myofibre, ma si attivano a proliferare, fusibile e differenziare in tessuto muscolare è danneggiato, riparati e rigenerati ^3. Le cellule satelliti possono essere isolate da biopsie muscolari umane giovani e anziani con la digestione enzimatica ⁴ e le loro proprietà miogenici può essere successivamente studiato in colture primarie ^5. L'efficienza di questo processo di isolamento per quanto riguarda sia la resa e la purezza della popolazione cellulare dipende dai metodi utilizzati e può variare da campione a campione. I due principali tipi di cellule aderenti ottenuti dalla digestione enzimatica sono le cellule satelliti (cellule miogeniche ora chiamati o cellule precursori del muscolo), identificato inizialmente come cellule CD56 ⁺ / desmina e mufibroblasti SCLE-derivati, identificati come CD56 ^- e TE7 ^{+ 5} celle. I fibroblasti hanno un tasso di proliferazione rapida e non subiscono irreversibile arresto della crescita e differenziazione terminale al contatto cellula-cellula come le cellule miogeniche; quindi in popolazioni miste, fibroblasti possono overrun cellule miogeniche a dominare la cultura.

I fibroblasti sono stati spesso visti come un fastidio per i biologi muscolari, tuttavia, vi è ora un crescente interesse in fibroblasti da cellule degni di studio e propri, in particolare per quanto essi hanno dimostrato di avere un ruolo di collaborazione con cellule miogeniche durante la riparazione del muscolo ⁶ . L'isolamento e purificazione di diversi tipi di cellule di muscolo umano è quindi un importante considerazione metodologica quando si cerca di studiare il comportamento innata di entrambi i tipi di cellule in coltura. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) è un metodo con cui le cellule possono essere ordinati per ulteriori studi e / o contati eanalizzati. FACS è stato dimostrato per arricchire affidabile cellule miogeniche umane, ma la resa di cellule per la coltura successiva non è stata finora alta ^7. Dato il potenziale di replica limitato di cellule somatiche come le cellule satellite cellule derivate miogenici e più poveri proliferazione e differenziamento associati senescenza ^4, sono necessari approcci più dolci. Culture fibre muscolari singole offrono un altro, meno aggressivo, mezzi per ottenere cellule satelliti murine ancora residente nella loro nicchia sublaminal e dopo la loro attivazione in cultura ^8,9. Tuttavia, questo non è spesso possibile dal materiale bioptico muscolo umano (perché fibre possono raramente essere ottenuti da tendine tendine) significa che questa tecnica non può essere accessibile a molti laboratori di ricerca interessati a studiare cellule derivate muscolari umane. Inoltre, la tecnica singola fibra fornisce solo il numero di cellule molto limitato.

Qui si descrive un sistema di ordinamento basato sulla genTLE digestione enzimatica delle cellule usando collagenasi e dispasi seguita da due successivi cicli di cellule attivate magnetica smistamento (MACS) che fornisce sia una purezza elevata (> 95% di cellule miogeniche) e la resa (~ 2,8 x 10 ⁶ ± 8,87 x 10 ⁵ cellule / g di tessuto) per esperimenti in coltura. CD56 è considerato il marcatore di superficie gold standard per l'identificazione delle cellule satelliti umane in situ ¹⁰ e in vitro ¹¹ e fornisce la superficie ideale marcatore candidato per il fissaggio tallone. In questo approccio anticorpi CD56 coniugati ad ossido di ferro e-polisaccaride contenente microsfere superparamagnetiche sono vincolati alle cellule e passato attraverso un alto gradiente colonna di separazione cellulare magnetica posto in un forte campo magnetico ^12,13. Le colonne di separazione sono riempiti con una matrice di lana di acciaio o ferro sfere ferromagnetiche che servono a concentrare le linee del campo magnetico verso la superficie generano forti gradienti di campo magnetico (~ 4tesla) ¹⁴. In queste colonne cellule leggermente magnetici anche sono attratti e assorbiti alla loro superficie ^14. Unbound (CD56 ^-), le cellule passano attraverso la colonna, mentre CD56 ⁺ cellule marcate con microsfere magnetiche vengono mantenuti fino rimozione dal campo magnetico ^12,15.

Le sospensioni cellulari da qualsiasi fase del processo di sequenziazione possono essere placcati alla densità desiderata per ulteriori sperimentazioni. A seguito di un determinato intervento dei costituenti cellulari possono essere identificati mediante immunocitochimica, ripreso con grande campo o la microscopia confocale e analizzati quantitativamente usando un approccio di analisi delle immagini che permette una rapida misurazione oggettiva di tutte le cellule marcate in ogni immagine data. Nel nostro laboratorio abbiamo usato questo doppio approccio ordinamento immunomagnetica seguita da analisi di immagine ¹⁶ per dimostrare che CD56 ^- fibroblasti umani prontamente transdifferenziarsi in adipociti, mentre cellulare miogenicos di origine satellite sono altamente resistenti a questa conversione adipogenico ^5.

Protocollo

NOTA: Per gli studi condotti nel nostro laboratorio tutti i soggetti hanno dato il loro scritto, il consenso informato a partecipare e tutti gli esperimenti sono stati eseguiti con l'approvazione UK National Health Service Comitato Etico (London Research Comitato Etico; riferimento: 10 / H0718 / 10), e in conformità con la legge Human Tissue e Dichiarazione di Helsinki.

1. Preparazione iniziale prima della Biopsia muscolare (15 min)

1. Fai terreno di crescita del muscolo scheletrico umano. Per una sterile tubo da 50 ml graduato aggiungere 2,5 ml della miscela integratore, 10 ml di siero fetale di vitello, antibiotici (penicillina / streptomicina) e glutammina alle concentrazioni finali corretti (Tabella 1) quindi riempire il tubo a 50 ml con scheletrica basale muscolare medie.
2. Mettere 15 ml del mezzo basale muscolo scheletrico in una provetta sterile da 20 ml e si pesa. Una volta pesato posto questo tubo sul ghiaccio. Usare questo per ricevere il campione muscolo umano.
3. In un altro tubo 20 ml preparare 10 ml di una soluzione enzimatica Collagenase D e dispasi II ad una concentrazione finale di 2 mg / ml ciascuno sciogliendo aliquote archivi di questi enzimi nel muscolo scheletrico medie basale. Filtro-sterilizzare questa soluzione facendola passare attraverso un filtro di 0,22 micron. Posizionare questo mix enzima sterile in incubatore o bagnomaria a 37 ° C per 15 min per riscaldarsi.
   NOTA: Questa miscela di enzimi è leggermente più delicato di tripsina e meglio mantiene vitalità cellulare ^17.
4. Mettere da parte una piastra di Petri e un paio di bisturi sterili.

2. muscolare Biopsia procedura (45 min-1 ora)

1. Prima di reclutare i partecipanti, per essere pienamente spazio etico e approvazione procedurale (comprese le vaccinazioni rilevanti per sperimentatori) da tutti gli organi amministrativi competenti, comitati e operatori sanitari (ad esempio, etica, istituzionale, governativo, ecc).
2. Creare un campo sterile la intorno alla gamba (ad esempio, con fogli chirurgiche sterili) unD Pulire accuratamente la zona attorno al sito biopsia con un agente antibatterico antisettico (clorexidina).
3. Anestetizzare sito biopsia proposto sulla gamba del volontario mediante iniezione locale del 2% lidocaina sottocutanea nella regione sovrastante la fascia del muscolo vasto laterale.
4. Eseguire un'incisione vasta ~ 5 mm, utilizzando una lama chirurgica sterile attraverso la pelle e fascia ed eseguire la procedura biopsia Bergström ago ¹⁸ con aspirazione supplementare.
5. Utilizzando pinze sterili rimuovere il muscolo dal lume aghi e immergere in terreno di base su ghiaccio. Trasporto il tessuto al laboratorio per ulteriore elaborazione appena possibile anche se le cellule miogeniche vitali possono essere ottenute dopo periodi 24 hr o più.
6. Debrief il soggetto, pulire e sigillare il sito di incisione con più strisce adesive sterili pelle chiusura e vestito in modo asettico con una copertura impermeabile esterno.

3. Isolamento Muscolo-derivati ​​Precursore CeLLS (1 ora, 30 min)

1. Rimuovere la provetta contenente il campione di muscolo e pesare (assicuratevi tubo è asciutto strofinando con il tessuto). Calcolare il peso del campione muscolare sottraendo il peso del tubo contenente medio campione dalla provetta contenente solo terreno.
2. Agitare la soluzione più volte per lavare il campione di sangue muscolare. Lasciate che il sedimento muscolo a temperatura ambiente per 30-60 sec.
   1. Rimuovere quasi l'intero volume di terreno dal tubo, utilizzando prima un aiuto pipettaggio elettronico o aspiratore ma lasciare circa 2-3 ml nel tubo.
   2. Invertire il tubo su di una piastra di Petri sterile permettendo il fluido rimanente per trasportare il campione muscolare al piatto; utilizzare il bisturi sterile per estrarre qualsiasi muscolo restante fragments.Rotate il piatto di mobilitare il liquido rimanente e rimuoverlo con un pipette.Remove eventuali pezzi visibili di grasso o di tessuto connettivo.
3. Per biopsie di peso 100-400 mg, aggiungere 3 ml di caldosoluzione enzimatica e utilizzando bisturi sterili tagliare il campione di muscolo in pezzi molto piccoli (<1-2 mm ^3).
4. Utilizzando una vasta alesaggio di 25 ml pipetta redigere il frammenti muscolari e enzima soluzione e trasferire in una 10 ml tubo conico sterile. Lavare la capsula di Petri con un ulteriore 3-5 ml di collagenasi e soluzione enzimatica dispasi e con una piccola pipetta 10 ml raccogliere eventuali frammenti muscolari restanti e posto nel tubo. Il volume esatto non è critica.
5. Posizionare il flacone a 37 ° C incubatore (o bagnomaria) per 60 min con triturazione (10 ml pipetta) ogni 15 min.
6. Dopo 1 ora terminare dissociazione enzimatica mediante aggiunta di un volume equivalente di mezzo di crescita fresco pre-riscaldato e passare la sospensione cellulare attraverso un filtro 100 micron per rimuovere eventuali detriti di grandi dimensioni myofibre. Centrifugare la soluzione di cellule filtrata a 657 xg per 6 minuti a temperatura ambiente (20-25 ° C).
7. Risospendere il pellet cellulare in 5-7 ml di mezzo di crescita e piatto in un non rivestito T-25pallone di coltura tissutale. Trasferire questa piastra al incubatore a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 7 giorni. Cambiare la media ogni 48 ore. In questa fase le cellule miogeniche sono molto piccole e arrotondate e difficile discernere da cellule non-miogeniche.
   1. Sul primo cambiamento medium, centrifugare il surnatante per sedimentare le cellule non aderenti. Risospendere questi in terreno fresco e ri-piatto.
8. Dopo 7 giorni di cultura, assicurarsi che la maggior parte delle cellule miogeniche (e fibroblasti) hanno attaccato ma le cellule non hanno ancora raggiunto la confluenza. Purificare i precursori miogenici ed eseguire MACS secondo un protocollo sviluppato originariamente da nei laboratori di Gherardi e Chazaud ^19,20 e ulteriormente modificato da noi ^5.

4. immunomagnetica Bead Ordinamento delle celle in base a CD56 Expression (1,5 ore)

1. Dopo 7 giorni di risciacquo il monostrato cellulare (che in genere conterrà 50-60% di cellule miogeniche ⁵⁾ con tre borsespazio tampone fosfato temperatura (PBS) per rimuovere eventuali residui cellule non aderenti e detriti dall'isolamento.
   1. Trypinize le cellule (0,04% tripsina Ca ²⁺ -free PBS con 0,73 mM EDTA) per 3 minuti. Una volta che le cellule hanno staccato, aggiungere 5-10 ml di scheletrico mezzo di crescita muscolare per evitare over-digestione. Agglomerare le cellule per centrifugazione a 657 xg per 6 minuti a temperatura ambiente (20-25 ° C) e risospendere in un volume adeguato di terreno completo per il conteggio.
   2. Contare un piccolo campione di sospensione cellulare utilizzando il metodo desiderato (ad esempio, utilizzando un emocitometro o un dispositivo di conteggio automatico) e calcolare a partire numero di cellulare e la vitalità.
2. Piatto alcuni pozzi in un (nave o superiore se necessario) 96 pozzetti per immunocitochimica o flusso caratterizzazione basata citometria della popolazione prima di smistamento (fibroblasti e cellule miogeniche saranno più abbondanti tipi presenti celle).
3. Per l'annuncio sospensione cellulared 15 ml di PBS sterile per diluire le cellule e di media. Centrifugare le cellule di nuovo e risospendere in 170 ml di temperatura ambiente classificare tampone (1% BSA in una soluzione di risciacquo MACS, sterilizzato mediante passaggio attraverso un filtro di 0,22 micron).
   1. Aggiungere 35 ml di microsfere magnetiche ben miscelati coniugate ad un anticorpo primario CD56 (clone AF12-7H3, 130-050-401) nella soluzione di cellule, pipetta per mescolare e lasciare incubare per 15 minuti a 4 ° C con agitazione in punto a metà strada.
4. Dopo l'incubazione, diluire la soluzione cellulare e tallone con 10 ml di tampone MACS classificare e centrifugare a 657 xg per 6 min. Risospendere le cellule in 1 ml di tampone di smistamento.
5. Aggiungere il separatore MAC (magnete) per le MACS titolari stand. Fare attenzione quando si aggiunge il magnete allo stand a causa del forte campo magnetico. Slot nella colonna e montare il filtro pre-separazione. Pipettare 1 ml di tampone di smistamento attraverso il filtro di pre-separazione e colonna per la lubrificazione.
6. Immediately dopo questo, mescolare delicatamente la sospensione cellulare e gocciolare l'intero 1 ml attraverso il filtro di pre-separazione e nella colonna.
7. Lavare la colonna tre volte con 1 ml (o 500 ml) di tampone di smistamento. Raccogliere le cellule non-conservato che passano attraverso la colonna del primo tipo in una provetta conica da 50 ml sterile contenente una piccola quantità di mezzo di crescita. Queste cellule sono il primo tipo CD56 ^- frazione e saranno altamente arricchito da fibroblasti del tessuto connettivo. Non lasciate che la colonna di asciugare tra un lavaggio.
8. Dopo lavaggi il rimuovere il filtro pre-separazione e aggiungere 2,5 ml di tampone MACS alla colonna. Quindi rimuovere immediatamente colonna dal magnete e raccogliere il primo tipo CD56 ⁺ frazione in un tubo da 50 ml conica separata premendo lo stantuffo nella parte superiore della colonna.
   NOTA: Il pistone si adatta molto strettamente nella parte superiore della colonna e può essere molto difficile da operare; Tuttavia, questo deve essere fatto mentre la colonna è ancora full di tampone, quindi è necessaria la velocità. Evitare lo stantuffo troppo duro e veloce.
9. Prima di placcatura valutare la vitalità delle cellule utilizzando, per esempio, il test trypan blu. Determinare la percentuale di cellule vitali dai campi 8 x 1 mm ² di conteggio (entrambe le camere del emocitometro).
   NOTA: Le cellule può essere singolo o doppio filtrate seconda della purezza richiesto. Se fatto con attenzione queste cellule tollerano la procedura di doppia cernita molto bene e la redditività è molto elevata> 95%. Per la doppia cernita, configurare un'altra colonna, lubrificare con 1 ml di smistamento di tampone e procedere dal punto 4.6.
   1. Se l'imaging deve essere eseguita, le cellule piastra direttamente sul vetrini situati in 24 piatti ben ²¹ e rivestiti con la vostra scelta di ECM molecola per l'adesione delle cellule (ad esempio collagene o laminina). Qui, utilizzare 0,1-0,5 mg / ml di collagene-I (Tabella 3).

5. Ordinamento di Humun muscolo-derivate fibroblasti immediatamente dopo l'isolamento.

1. Per purificare progenitori fibroblasti subito dopo l'isolamento, utilizzare il protocollo come sopra, con le seguenti modifiche:
   1. Subito dopo cellule isolamento risospendere in mezzo completo e filtro una volta anche se un filtro micron cellulare 100 e poi di nuovo anche se un filtro 40 micron. Aggiungere 5 ml di PBS e far girare a 657 g per 6 min.
   2. Risospendere le cellule in MACS ordinamento tampone e incubare in microperle di fibroblasti Anti-umani per 15-30 minuti a temperatura ambiente.
   3. Utilizzare la colonna LS e il separatore Midi-MACS (Tabella 3) e installare il filtro pre-separazione 40 micron.
   4. Eseguire uno o due tipi a seconda della purezza richiesta, trasferire le cellule appena possibile in mezzo contenente siero, effettuare un conteggio, e piastra presso la densità desiderata

6. Immunocytochemical colorazione (1 giorno e durante la notte).

1. Fissarecellule nei pozzetti mediante l'aggiunta di un volume uguale di 8% paraformaldeide in PBS per 10 minuti con agitazione. Dopo 10 min aspirare fissativo e lavare due volte con PBS.
2. Per immunostain antigeni di superficie cellulare, le cellule di blocco per almeno 1 ora in 1% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS e poi sondare con gli anticorpi primari pertinenti (Tabella 4).
   1. Per antigeni intracellulari, permeabilize cellule dopo fissazione per aggiunta di 0,2% Triton X-100 in PBS con 1% BSA e NaN ₃ (0,01%) per 10 minuti, poi bloccare e incubare con anticorpi primari. Eseguire tutte le incubazioni anticorpi primari notte a temperatura ambiente (oa 4 ° C) con leggera agitazione su una piattaforma oscillante.
3. Rimuovere l'anticorpo primario non legato e lavare le cellule tre volte con PBS freddo. Incubare per 1 ora di incubazione con anticorpi secondari fluorescenza marcata specie-specifici (Tabella 4) a temperatura ambiente.
4. Dopo la rimozione dianticorpi secondari non legati, lavare le cellule con tre scambi di PBS e poi controcolorazione con il colorante fluorescente Hoechst 33342 DNA (1 mg / ml) soluzione per 10 min su una piattaforma oscillante.
5. Per la visualizzazione simultanea di due antigeni di superficie cellulare e antigeni intracellulari, cellule sonda prima con anticorpi primari a cellule antigeni di superficie seguite dai loro anticorpi secondari appropriati. Avanti, ri-fissare le cellule nel freddo PFA, permeabilize, blocco e incubare con anticorpi primari contro antigeni citoplasmatici o nucleari seguite dai loro anticorpi secondari appropriati.
6. Dopo la colorazione, rimuovere coprioggetti dai loro pozzi con pinze curve e sciacquare la parte posteriore del vetrino con acqua distillata. Posare la cella coprioggetto scivolare giù su una goccia di mezzo di montaggio ²² set su un vetrino da microscopio in vetro anti-dissolvenza.

7. Oil Red O colorazione in combinazione con immunofluorescenza delle cellule (2 ore)

1. Rivelareil contenuto lipidico delle cellule placcato in 24 piatti e dalla colorazione con Oil Red O (1 - ([4- (Xylylazo) xylyl] azo) -2-naftolo) ^5,23. Prima preparare una soluzione stock di 0,5% (w / v) Oil Red O sciogliendo 500 mg di Oil Red O in 60 ml di 99% trietil-fosfato e 40 ml di acqua distillata. Mantenere questa soluzione a temperatura ambiente al buio fino all'utilizzo.
2. Il giorno di utilizzo, fare un 36% (w / v) di trietile-fosfato di lavoro, contenente 12 ml di soluzione madre Oil Red O e 8 ml di acqua distillata. Filtrare la soluzione attraverso il numero di carta da filtro 42 per rimuovere tutti cristallizzato Oil Red O (che compromette la qualità dell'immagine).
3. Scaldare delicatamente questa soluzione lavorare in un bagno di acqua per 1 ora dopo di che la soluzione viene filata a 1.200 xg per 6 min. Rimuovere il surnatante e filtrare di nuovo su carta da filtro (numero 42) e trasferimento in un nuovo tubo di 20 ml.
4. Dopo le cellule sono state fissate, permeabilizzate e immunostained, togliere il PBS e aggiungere 500 ml di olio rosso O / Trietil-phossoluzione phate ai pozzetti per 60 min. Triton-X alla concentrazione usata qui per membrana cellulare permeabilizzazione non influenza il contenuto di lipidi cellulari ^23.
   NOTA: Oil Red O è eccitato da lunghezze d'onda tra 540 e 580 nm e, quindi, il filtro Texas-Red può essere utilizzato per rilevare Oil Red O emissione in microscopia a fluorescenza ^23. Si noti che l'emissione di fluorescenza da Oil Red O può occasionalmente perdite nel canale rosso lontano se le cellule sono fortemente colorati (ad esempio, molto alto contenuto di grassi).
5. Dopo l'incubazione, rimuovere l'eccesso di olio rosso O e lavare le cellule cinque volte con 500 ml di PBS. Montare i coprioggetti come per immunostaining come descritto nel capitolo 6. Rileva Oil Red O dye sia campo chiaro / microscopio a contrasto di fase o mediante microscopia in epifluorescenza utilizzando il filtro Texas Red (spostare gratuito, EX BP 560/40, BS FT 585, EM BP 630 / 75, Carl Zeiss).

8. Ottenere Micrografie di microscopia a fluorescenza per successiva AnANALISI

NOTA: Assicurarsi che scorre da confrontare quantitativamente sono macchiati con le stesse soluzioni, fotografato in condizioni identiche (ad esempio, l'esposizione, le impostazioni di acquisizione della fotocamera e così via) e catturato nella stessa sessione di microscopia. All formattazione post-acquisizione dovrebbe inoltre essere identici e in stretta conformità con le linee guida suggerite per le immagini digitali ^24.

1. Per l'acquisizione delle immagini (microscopia widefield), accendere la sorgente di luce microscopio e fluorescenza e partire per la quantità raccomandata di tempo per consentire la sorgente di luce di fluorescenza di riscaldarsi e di stabilizzarsi.
2. Impostare la corrente di buio per la telecamera bloccando il percorso ottico verso la videocamera; acquisire immagini alla massima risoluzione e usarlo per correggere le immagini successivamente acquisite.
3. Illuminare sonde di immunofluorescenza per epifluorescenza consegnato da guide di luce liquidi (tubo flessibile Fluoroplastic riempito con olio di silicone fenilmetil) unand segnali visualizzati attraverso rosso (filtro impostato 45 HQ Texas spostamento verso il rosso libera, verde (filtro impostato 44 FITC turno speciale gratuito) e il blu (filtro impostato filtri passa gratuito) banda di 49 DAPI spostamento su un microscopio invertito epi-fluorescenza (10X, 20X, 40X, pianificare obiettivi apocromatici con 0,25, 0,75, 0,95 aperture numeriche rispettivamente).
4. Per evitare la saturazione dei pixel trovare l'esposizione ottimale all'interno della gamma lineare del rilevatore per ogni marcatore fluorescente usando la funzione 'sovraesposizione' di software di acquisizione immagini. Annotare l'esposizione standard per ogni etichetta fluorescente.
5. Cattura singoli canali e salvare in scala di grigi o tiff pseudocolored (Tagged Image File Format) file di immagini nella profondità bit più alto (preferibilmente a 16 bit - 65.536 valori di grigio) forniti dal dispositivo di registrazione (ad esempio, raffreddato CCD (Charged Coupled Device) montato al microscopio) . Impostare la risoluzione dell'immagine a 1.388 x 1.040 o superiore. Assicurati di includere una barra di scala o un oggetto di di notamensioni nell'immagine.
6. Dove possibile salvare i file nel formato di file immagine a 16 bit con tag (TIFF) e non in formato .jpeg per prevenire la perdita di informazioni ^25.
7. Se ci sono preoccupazioni circa l'uniformità dell'illuminazione (software in bundle con il microscopio può avere la correzione automatica per questo) prendere un'immagine 'flat-field' di coprioggetto senza cellule, ma macchiata e montato nello stesso modo in diapositive come sperimentali; questo può essere utilizzato per correggere difetti illuminazione post-acquisizione nel software di analisi di immagine.
8. Per l'acquisizione delle immagini (microscopia confocale), ottimizzare il guadagno del rivelatore e la potenza del laser per ogni esperimento di imaging (evitare la saturazione). In generale, la fluorescenza misurata è proporzionale al livello di potenza del laser. Impostare le dimensioni pinhole a '1 arioso' per ottenere il miglior rapporto segnale-rumore (migliore risoluzione può essere raggiunto a 0,5 arioso per segnali particolarmente forti). Prendere sezioni ottiche a diversi livelli lungo l'asse z attraverso la formicacellule iBody marcato e risparmiare un 16 bit proiezione massima per ciascun canale per l'analisi delle immagini.

9. l'esecuzione di misure di fluorescente fattori di trascrizione nucleare Uso Image Processing and Analysis Software (5 min per campo visivo).

1. Accesso file di immagini TIFF individuali e di sovrapposizione corrispondenti canali facendo clic e trascinando un'immagine in un'altra. Ogni canale apparirà come un livello separato nel pannello Livelli.
2. Selezionare alleggerire dal menu dei filtri per consentire livelli sotto per essere visualizzati contemporaneamente. In alternativa, regolare l'opacità degli strati superiori al 50%.
   NOTA: le immagini TIFF possono essere salvati con la 'lossless' Lempel-Ziv-Welch (LZW) la compressione dei dati per ridurre le dimensioni dei file senza perdita di informazioni.
3. Nella finestra di analisi (Analysis> Selezionare Dati Punti> Personalizzato), selezionate Analisi e scegliere le misure necessarie (ad esempio, la densità integrata, densit mediay, circolarità, istogramma, ecc). Eliminare le misure necessarie deselezionando la casella accanto a loro. Se le misurazioni dell'area sono necessari micron cliccare su Analisi> Imposta scala di misurazione. Apparirà Lo strumento righello automaticamente - tracciare la lunghezza della barra di scala e immettere la lunghezza nota in micrometri. Il software poi convertire le misure della superficie in micron quadrati.
   NOTA: Se viene selezionata l'analisi istogramma, quando le misurazioni vengono registrate apparirà una cartella aggiuntiva (la cui posizione può essere scelta) con 8 istogrammi bit per ogni area di selezione individuale nella micrografia così come la somma di tutti i singoli selezioni (questo appare sempre come Istogramma-1 se sono fatte selezioni multiple). Questa analisi non può essere eseguita dal software in formato 16 bit, ma è molto utile per esaminare la distribuzione di intensità di pixel in tutta l'oggetto di interesse.
4. Per l'analisi della fluorescenza nucleare prima costruire un rap'Color Range Selection Mask' presentante (CRSM) per Hoechst o DAPI DNA macchiato per definire zona nucleare. Una volta che le immagini del canale desiderati sono sovrapposte, solo lo strato di canale Hoechst deve essere lasciato in vista, garantendo l''icona occhio' adiacente ad essa nella scheda strati viene selezionato e poi strato è evidenziata (diventa blu), mentre tutti gli altri livelli dovrebbero essere deselezionato. Assicurarsi che la discesa di fusione è riportato a 'normale' nella scheda strati.
5. Aprire la finestra di dialogo Intervallo colori (Selezione> Intervallo colori) e impostare l'opzione di selezione a discesa di "colori campionati. Con l'anteprima di selezione impostata su 'maschera veloce' (sfondo rosso) selezionare tutte le tonalità di colore blu nei nuclei tenendo premuto il tasto shift (appare il segno '+') e cliccando all'interno dei nuclei con lo strumento contagocce che appare.
   1. Se sono selezionati i toni indesiderati, rimuoverli premendo il tasto Alt ('appare ─'sign) e cliccandosu di essi. Mantenere la scala confusione a zero in modo che i toni di colore selezionati solo manualmente sono inclusi nella misurazione e 'clusters colore localizzate dovrebbero essere lasciati senza controllo.
6. Salva questo CRSM al disco rigido del computer come un specifico programma di file estratto (file .AXT). Con un altro campo casuale di nuclei, carico, aggiornare e salvare la CRSM (Select, Color Range, Load). Fate questo per almeno cinque campi aleatori per garantire che le selezioni nucleari sono rappresentativi.
   1. Utilizzare una versione colorata di scala di grigio per la creazione di una maschera per isolare caratteristiche perché l'occhio umano è più in grado di discriminare tra diverse sfumature di colore che tra varie sfumature di grigio ^26.
7. Utilizzare la CRSM nucleare alle regioni nucleari segmento per la colorazione. Una volta che i nuclei sono stati selezionati cliccare su Immagine> regolazione> Soglia e spostare il cursore completamente a destra, in modo che i nuclei diventano neri. Alternativamente,fare clic destro e selezionare 'Fill' scegliere 'Riempi a: nero'. Quindi fare clic su Selezione> Inversa e ora premere CANC per rimuovere tutti sfondo (se l'opzione appare scegliere 'riempire a: White'). Questo binarizes essenzialmente l'immagine in base alla selezione. Poi caricare il plugin spartiacque dalla scheda filtri per separare sovrapposte nuclei (Filtro> immagine Binary> separazione funzione Watershed).
   1. Se molti nuclei sono fortemente sovrapposizione, rimuovere i nuclei di analisi per deselezionandoli (Tenere premuto il tasto Alt e liberamente disegnare intorno a loro con lo strumento lazo).
8. Sullo strato nucleare ora binario, andare su Selezione> Intervallo colori e> Shadows, per selezionare i singoli nuclei. Spostamento hold Alternative e cliccare all'interno di qualsiasi nucleo nero. Saranno immediatamente selezionati tutti nuclei. Poi il trasferimento questa selezione per il livello contenente fattore di trascrizione nucleare colorazione (es miogenina) selezionando quello strato e deselezionando tuttoaltri livelli. Linee Marching ora mostrare la posizione dei nuclei nel canale miogenina.
9. Se si lavora con immagini pseudocolored solo cliccare sul palette Canali (alla destra della scheda strati) e selezionare solo il canale verde (l'immagine apparirà grigio). Poi clicca su Immagine> Metodo> Scala di grigio. Apparirà 'Appiattire livelli visibili e scartare quelli nascosti' fare clic su OK Un avvertimento, poi un altro avvertimento dirà 'scartare altri canali' di nuovo su OK. Solo un singolo strato di scala di grigi selezionato nuclei sarà ora presente nella palette Livelli.
   1. Clicca Registra misurazioni nel Registro misurazioni per ottenere dati per i nuclei selezionati. Se il livello da analizzare (ad esempio miogenina colorazione) è già un raw a 16 bit in scala di grigi quindi premere Registra misurazioni.
   2. Esporta misure selezionate come TXT file nella posizione di vostra scelta. Questi possono poi essere ulteriormente elaborati e analizzati in altri software trattamento dei dati packages
      NOTA: La Modifica> passo Comando all'indietro (premere tutti Alt, Ctrl e tasti Z contemporaneamente) ripristina tutti i livelli precedenti, se necessario.
   3. Corretta per lo sfondo non fluorescenza specifica ²⁷ per i risultati siano quantitativi e comparabili come misura di intensità di fluorescenza sono sempre un mix di segnali e lo sfondo.
      1. Selezionate lo strumento selezione quadrata e verificare 'dimensione fissa' scegliere 20 di 20 pixel (o più grande se lo si desidera e in base alla confluenza delle cellule nell'immagine). Tenendo premuto SHIFT selezionare dieci o più aree di sfondo sparsi in tutto il campo visivo. Press 'Record Misure "nel Registro misurazioni.
      2. Calcolare la densità media integrato (somma di tutti i valori di grigio dei pixel) per pixel di tutte le 10 regioni di fondo selezionate (dato come il 'valore medio grigio' nel registro di misura). Moltiplicare la densità di fondo media per pixel per il numero di pixel in oggetto di destinazione ( Per esempio, ogni nucleo) per dare fondo media per oggetto.
      3. Sfondo Sottrai fluorescenza dagli oggetti di densità integrato originale a cedere lo sfondo finale valore corretto. Questo approccio rappresenta per il potenziale campo di variazione del campo in fondo non specifico fluorescenza.
         NOTA: E 'della massima importanza per selezionare solo le regioni di sfondo in buona fede in quanto questa correzione ha un notevole impatto sui valori finali. Zoom avanti utilizzando la lente di ingrandimento è consigliato quando si effettuano le selezioni.
      4. Può anche essere utile per dividere il contesto generale valore corretto per l'area del nucleo in pixel (stesso che livello di grigio medio / intensità per nucleo) per minimizzare il potenziale di influenza di segnale sfondo nucleare localizzata che contribuire maggiormente alla densità integrato valore con l'aumento delle dimensioni nucleare (Figura 3C).

Risultati

Cellule miogeniche depurato e fibroblasti possono essere coltivate in terreno di differenziamento adipogenico per tre giorni, seguiti da medie nutrizione adipogenico ovunque tra 7-30 giorni per valutare il loro potenziale di adipogenesi. Utilizzando le popolazioni cellulari purificate, Oil Red O colorazione in combinazione con immunocolorazione per i marcatori lignaggio adipogenico e miogeniche mostrato che solo la frazione fibroblasti era capace di differenziazione adipogenico (Figura 2). L'accumul...

Discussione

Abbiamo descritto un procedimento di ordinamento immunomagentic per l'arricchimento selettivo di precursori derivato muscolari umani da piccoli campioni di materiale biopsia muscolare. Questa tecnica è stato prezioso nel nostro laboratorio per superare la perdita di colture derivate muscolari fibroblasti umani, ma anche per comprendere il comportamento unica di distinte popolazioni di progenitori derivato muscolari. Cellule miogeniche Una volta purificate possono essere indagati per le modifiche delle proteine ​?...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase  D	Roche	11088866001
Dispase II	Sigma	D4693-1G	Must be filter sterilized before use
Trypsin/EDTA	(Gibco) Invitrogen	15400-054
100 μm cell strainer	BD Biosciences	352360
Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid)	Sigma, Dorset, UK	C8919
Minisart SRP15 syringe filter (0.2 μm)	Sartorius	17573ACK	Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane
CD56 human Microbeads	Miltenyi Biotech	130-050-401	Be aware of the limited shelf life of microbeads
Anti- fibroblast Microbeads, human	Miltenyi Biotech	130-050-601
40 μm Pre-separation filters	Miltenyi Biotech	130-041-407
Large Cell Collumns	Miltenyi Biotech	130-042-202	These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here.
LS columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
MiniMacs Seperator	Miltenyi Biotech	130-042-102	This separator fits the large cell column but not the LS column.
MidiMACS	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS multistand	Miltenyi Biotech	130-042-303
BSA	Sigma		Must be filter sterilized before use
Oil Red O	Sigma	O0625
Triethyl phosphate	Sigma	538728
Whatman Paper	Sigma	Z241121-1PAK	No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering.
ProLong Gold Antifade Reagent	Molecular Probes, Invitrogen	P36930	This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence.
AxioVision	Carl Zeiss	Contact Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended	Adobe (purchased from Pugh Computers)	ADPH16982*