בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

Summary

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Abstract

התיקון וההתחדשות של שריר שלד דורש הפעולה של תאי לווין, שהם תאי גזע שריר התושב. אלה יכולים להיות מבודדים מדגימות שריר אנושי ביופסיה באמצעות עיכול אנזימטי ומאפייני myogenic למדו בתרבות. כמותית, שני סוגי התאים חסיד העיקריים המתקבלים מעיכול אנזימטי הם: (i) תאי הלווין (המכונים תאי myogenic או תאי מבשר שריר), שזוהו בתחילה כCD56 ⁺ ובהמשך כCD56 ⁺ / desmin ותאים ⁺ (ii) שריר fibroblasts נגזר, שזוהה כCD56 ^- וTE-7 ^+. Fibroblasts להתרבות ביעילות רבה בתרבות ובאוכלוסיות תאים מעורבות תאים אלה עשויים מוצפים תאי myogenic להשתלט על התרבות. הבידוד וטיהור סוגי תאים שונים משריר האנושי שלו ובכך שיקול מתודולוגית חשוב כאשר מנסים לחקור את ההתנהגות המולדת של כל אחד מסוגי התאים בתרבית. כאן אנו descrIBE מערכת של מיון המבוסס על עיכול אנזימטי העדין של תאים באמצעות collagenase וdispase אחריו תא מופעל מגנטי מיון (MACS) אשר נותן שני טוהר גבוה (> תאי myogenic 95%) ותשואה טובה (~ 2.8 x 10 ⁶ ± 8.87 x 10 ⁵ תאים / g רקמות לאחר 7 ימים במבחנה) לניסויים בתרבות. גישה זו מבוססת על דוגרים אוכלוסיית תאים המעורבת נגזר שריר עם חרוזים microbeads מגנטיים המוצמדים לנוגדנים נגד CD56 ולאחר מכן עוברים תאים למרות ששדה מגנטי. CD56 ⁺ תאים חייבים microbeads נשמרים על ידי השדה ואילו CD56 ^- תאים עוברים ללא הפרעה דרך העמודה. השעיות תא מכל שלב של תהליך המיון יכולות להיות מצופים ותרבותית. בעקבות התערבות נתון, מורפולוגיה של תאים, והביטוי והלוקליזציה של חלבונים כוללים גורמי שעתוק גרעיניים ניתן לכמת באמצעות תיוג immunofluorescent עם נוגדנים ספציפיים וp תמונהrocessing וחבילת ניתוח.

Introduction

התיקון וההתחדשות של שריר שלד דורש הפעולה של תאי לווין ^1, תאי גזע myogenic ^2,3. בvivo תאים אלה קיימים במדינה הפיכה שקטה הממוקמת בין sarcolemma וlamina בסיס של כל myofibre, אלא הופכים להיות מופעל כדי להתרבות, פתיל ולהבדיל כרקמת שריר פגום, תיקון ומחדש ^3. יכולים להיות מבודדים תאי לווין מדגימות צעירות וקשישים שריר אנושי ביופסיה באמצעות עיכול אנזימטי ⁴ ומאפייני myogenic לאחר מכן ניתן יהיה למד בתרבות העיקרית ^5. היעילות של תהליך בידוד זה בהקשר לשתי התשואה והטוהר של אוכלוסיית תאים תלויה בשיטות ויכולה להשתנות ממדגם לדגום. שני סוגי התאים חסיד העיקריים המתקבלים מעיכול אנזימטי הם תאי הלווין (תאי myogenic עכשיו כינו או תאי מבשר שריר), שזוהו בתחילה כתאי CD56 ⁺ / desmin, וmufibroblasts הנגזר scle, זוהה כCD56 ^- וTE7 ⁺ תאי ^5. לפיברובלסטים שיעור שגשוג מהיר ולא יעברו מעצר בלתי הפיך צמיחה ובידול מסוף במגע תאי תאים כמו תאי myogenic; כך באוכלוסיות מעורבות, fibroblasts עשוי מוצף תאי myogenic להשתלט על התרבות.

לעתים קרובות נצפה fibroblasts כגירוי לביולוגים שריר, לעומת זאת, יש כיום עניין גובר בfibroblasts כתאים ראויים למחקר בפני עצמם, במיוחד כשהם הוכחו יש להם תפקיד של שיתוף פעולה עם תאי myogenic במהלך תיקון שריר ⁶ . הבידוד וטיהור סוגי תאים שונים משריר האנושי שלו ובכך שיקול מתודולוגית חשוב כאשר מנסים לחקור את ההתנהגות המולדת של שני סוגי התאים בתרבית. מיון תא הקרינה המופעל (FACS) הוא שיטה שבאמצעותה ניתן למיין תאים למחקר נוסף ו / או וספרניתח. FACS הוכח להעשיר באופן מהימן תאי myogenic אנושיים, אבל התשואה של תאים לתרבות שלאחר מכן עד כה לא הייתה גבוהה ^7. לאור פוטנציאל השכפול המוגבל של תאים סומטיים כגון תאים נגזרים תאי לווין myogenic ועני מאוד התפשטות ובידול הקשורים להזדקנות ^4, גישות עדינות יותר נדרשות. תרבויות סיב שריר בודדות מציעות אחר, פחות אגרסיווי, אמצעי להשגת תאי לווין עכבריים עדיין תושב בנישה sublaminal ולאחר ההפעלה שלהם בתרבות ^8,9. עם זאת, זה בדרך כלל לא אפשרי מחומר ביופסיה של שריר אדם (כי רק לעתים נדירות ניתן להשיג מגיד לגיד סיבים) כלומר טכניקה זו עשויה שלא להיות נגישה למעבדות מחקר רבות מעוניינים ללמוד תאים שמקורם בשרירים אנושיים. יתר על כן, טכניקת הסיב בודדת מספקת רק מספרים סלולריים מוגבלים מאוד.

כאן אנו מתארים מערכת של מיון המבוסס על genעיכול אנזימטי tle של תאים באמצעות collagenase וdispase אחרי שני סיבובים רצופים של תא מופעל מגנטי מיון (MACS) אשר נותן שני טוהר גבוה (> תאי myogenic 95%) ותשואה (~ 2.8 x 10 ⁶ ± 8.87 x 10 ⁵ תאים / רקמת ז) לניסויים בתרבות. CD56 נחשב סמן משטח תקן זהב לזיהוי של תאי לווין אנושיים באתר ¹⁰ ובמבחנה ¹¹ ומספק מועמד סמן משטח האידיאלי עבור קובץ מצורף חרוז. בגישה זו נוגדני CD56 מוצמדים לתחמוצת ברזל וחרוזים פאראמגנטי המכיל פוליסכריד חייב תאים ועבר דרך עמודת הפרדת תא מגנטית גבוהה שיפוע מונחת בשדה מגנטי חזק ^12,13. עמודי ההפרדה מלאים במטריצה ​​של תחומים צמר פלדה או ברזל פרומגנטיים המשמשים להתמקד קווי שדה מגנטיים לכיוון פני השטח שלהם יצירת שיפועים חזקים שדה מגנטי (~ 4tesla) ¹⁴. בטורים אלה אפילו תאים מעט מגנטיים נמשכים ושנספחו לפני השטח שלהם ^14. Unbound (CD56 ^-) תאים עוברים דרך הטור ואילו ⁺ תאי CD56 שכותרתו עם microbeads המגנטי נשמרים עד לסילוקו מהשדה המגנטי ^12,15.

השעיות תא מכל שלב של תהליך המיון יכולות להיות מצופים בצפיפות הרצויה לניסויים נוספים. בעקבות התערבות נתון ניתן לזהות את המרכיבים התאיים באמצעות immunocytochemistry, צילם באמצעות שדה רחב או מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal ונותח כמותית באמצעות גישת ניתוח תמונה המאפשרת מדידה אובייקטיבית מהירה של כל התאים שכותרתו בכל תמונת נתונה. במעבדה שלנו יש לנו השתמשתי בגישת מיון immunomagnetic זה כפול ואחרי ניתוח תמונה ¹⁶ להפגין CD56 ^ש-- fibroblasts אדם transdifferentiate בקלות לתוך תאי שומן, תוך תא myogenicים ממוצא הלווין עמיד מאוד בפני המרת adipogenic זה ^5.

Protocol

הערה: למחקרים שבוצעו במעבדה שלנו כל הנושאים נתנו את הסכמתם בכתב, הודיעה להשתתף וכל הניסויים בוצעו באישור ועדת האתיקה שירות הבריאות הלאומית בבריטניה (ועדת האתיקה מחקר לונדון; התייחסות: 10 / H0718 / 10), ובהתאם ל חוק אדם רקמות והצהרת הלסינקי.

1. הכנה ראשונית לפני ביופסיה של שריר (15 דקות)

1. הפוך מדיום גידול שרירי שלד אנושי. לצינור חרוטי 50 מיליליטר סיים סטרילי להוסיף 2.5 מיליליטר של תערובת המוסף, 10 מיליליטר סרום עוברי עגל, אנטיביוטיקה (פניצילין / סטרפטומיצין) וגלוטמין לריכוזים הסופיים הנכונים (טבלת 1) ולאחר מכן למלא את הצינור 50 מיליליטר עם בסיס שרירי שלד בינוני.
2. שים 15 מיליליטר של המדיום הבסיסי שרירי שלד בצינור חרוטי 20 מיליליטר סטרילי ולשקול אותו. ברגע ששקל מקום צינור זה על קרח. להשתמש בזה כדי לקבל מדגם שרירים האנושי.
3. בעוד צינור 20 מיליליטר להכין 10 מ 'l של פתרון אנזים Collagenase D וDispase השני לריכוז סופי של 2 מ"ג / מיליליטר כל אחד על ידי המסת aliquots מניות של אנזימים אלה במדיום בסיסי שרירי שלד. מסנן לעקר את הפתרון הזה על ידי העברתו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. מניחים תערובת אנזים סטרילי זה באמבטיה החממה או מים על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי להתחמם.
   הערה: תערובת זו של אנזימים היא מעט עדינה יותר טריפסין וטוב יותר שומרת על תא כדאיות ^17.
4. מניח בצד צלחת פטרי וזוג אזמלים סטריליים.

2. שריר הביופסיה נוהל (45 דקות -1 שעה)

1. לפני גיוס משתתפים, להשיג אישור מלא אתי ואישור נהלים (כוללים חיסונים רלוונטיים לנסיינים) מכל הגופים הרלוונטיים השלטון, הוועדות וספקי שירותי בריאות (לדוגמא, אתי, מוסדי, וכו 'ממשלתית).
2. יצירת שדה סטרילי סביב הרגל (למשל, עם גיליונות ניתוח סטרילי)ד לנקות ביסודיות סביב אתר ביופסית האזור עם סוכן חיטוי אנטיבקטריאלי (chlorhexidine).
3. לטשטש אתר הביופסיה המוצעת על הרגל של המתנדב על ידי הזרקה המקומית של לידוקאין 2% באזור תת עורי מעל fascia של vastus lateralis שריר.
4. לעשות חתך רחב ~ 5 מ"מ באמצעות סכין כירורגית סטרילית דרך העור וfascia ולבצע את הליך ביופסית מחט Bergstrom ¹⁸ עם שאיבה נוספת.
5. בעזרת מלקחיים סטריליות להסיר את השריר מלומן המחט ולטבול במדיום בסיסי על קרח. להעביר את הרקמה למעבדה לעיבוד נוסף בהקדם האפשרי אם כי ניתן להשיג תאי myogenic קיימא לאחר תקופות 24 שעות או יותר.
6. לתחקר את הנושא, לטהר ולאטום את אתר החתך עם רצועות מרובות סטרילי דבק עור-סגר ושמלת הסביבה נקיה מחיידקים עמיד למים עם כיסוי חיצוני.

3. בידוד Ce המבשר-נגזר שרירLLS (1 שעה, 30 דקות)

1. הסר את הצינור המכיל מדגם השרירים ולשקול אותו (להפוך את הצינור בטוח הוא יבש על ידי מנגב עם רקמה). לחשב את המשקל של מדגם השרירים על ידי הפחתת המשקל של הצינור המכיל בינוני ומדגם מהצינור המכיל בינוני בלבד.
2. לערבל את הפתרון כמה פעמים כדי לשטוף את מדגם השרירים של דם. בואו משקעי השריר בטמפרטורת חדר למשך 30-60 שניות.
   1. הסר כמעט כל נפח בינוני מהצינור, באמצעות סיוע pipetting אלקטרוני או aspirator הראשון אבל להשאיר כ 2-3 מיליליטר בצינור.
   2. להפוך את הצינור לצלחת פטרי סטרילית המאפשרת נוזל שנותר לביצוע מדגם השריר למנה; להשתמש באזמל סטרילי כדי לחלץ כל שריר שנותר fragments.Rotate הצלחת לגייס את הנוזל הנותר ולהסיר אותו עם pipette.Remove כל חלקים גלויים של שומן או רקמת חיבור.
3. לביופסיות במשקל 100-400 מ"ג, להוסיף 3 מיליליטר של חםפתרון אנזים ואזמלים סטריליים באמצעות לחתוך את מדגם השריר לחתיכות קטנות מאוד (<1-2 מ"מ ^3).
4. בעזרת פיפטה מיליליטר רחבה נשא 25 לצייר את פתרון שברי שרירים ואנזימים והעברת צינור חרוטי 10 מיליליטר סטרילי. לשטוף את צלחת פטרי עם 3-5 מיליליטר נוסף של collagenase ופתרון אנזים dispase ובעזרת פיפטה 10 מיליליטר קטנה לאסוף את כל שברים שנותרו שריר ומקום בצינור. הנפח המדויק אינו קריטי.
5. מניחים את הצנצנת ב37 ° C חממה (או אמבט מים) במשך דקות 60 עם טחינה דקה (10 פיפטה מיליליטר) כל 15 דקות.
6. אחרי שעה 1 לסיים דיסוציאציה האנזימטית על ידי תוספת של נפח שווה של מדיום גידול מראש חימם טרי ולהעביר את ההשעיה התא דרך מסנן 100 מיקרומטר כדי להסיר כל פסולת myofibre גדולה. צנטריפוגה פתרון התא המסונן ב657 XG במשך 6 דקות בטמפרטורת חדר (20-25 ג).
7. Resuspend התא גלולה 5-7 מיליליטר של מדיום גידול וצלחת בציפוי T-25בקבוק בתרבית רקמה. העבר את הצלחת זה לחממה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ למשך 7 ימים. לשנות את המדיום כל שעה 48. בשלב זה תאי myogenic מאוד קטנים ומעוגלים וקשים להבחין מהתאים שאינם myogenic.
   1. על שינוי המדיום הראשון, צנטריפוגה supernatant לגלולה כל תאים שאינם חסיד. להשעות מחדש אלה במדיום חדש ומחודש צלחת.
8. לאחר 7 ימים בתרבות, להבטיח שרוב תאי myogenic (ופיברובלסטים) צירפו אבל התאים עדיין לא הגיעו למפגש. לטהר את מבשרי myogenic ולבצע MACS פי פרוטוקול שפותח במקור על ידי במעבדות של Gherardi וChazaud ^19,20 ועוד שונה על ידי אותנו ^5.

4. immunomagnetic חרוז מיון של תאים בהתבסס על ביטוי CD56 (1.5 שעות)

1. לאחר 7 ימי שטיפת monolayer התא (אשר בדרך כלל יכילו תאי myogenic 50-60% ⁵⁾ עם שלושה חילופיםשל פתרון חיץ פוספט טמפרטורת חדר (PBS) כדי להסיר את כל תאים שאינם חסיד שנותרו ופסולת מבידוד.
   1. Trypinize התאים (0.04% טריפסין בCa ^{2 +} -חינם PBS עם 0.73 mM EDTA) במשך 3 דקות. ברגע שתאים יש מנותקים, להוסיף 5-10 מיליליטר של מדיום גידול שרירי שלד כדי למנוע יתר מערכת העיכול. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב657 XG במשך 6 דקות בטמפרטורת חדר (20-25 ג) וגלול בנפח מתאים של מדיום מלא לספירה.
   2. רוזן מדגם קטן של ההשעיה התא בשיטה הרצויה (למשל, באמצעות hemocytometer או מכשיר ספירה אוטומטית) ולחשב החל מספר תאים ואת הכדאיות.
2. פלייט כמה בארות ב( כלי שיט או גדול יותר במידת צורך) 96 צלחת גם לimmunocytochemical או לזרום אפיון של האוכלוסייה מבוססת cytometry לפני המיון (fibroblasts ותאי myogenic יהיו סוגים הנפוצים ביותר תאים הנוכחיים).
3. למודעה ההשעיה התא15 מיליליטר ד של PBS סטרילית לדלל תאים ובינוניים. צנטריפוגה התאים שוב וresuspend אותם 170 μl של טמפרטורת חדר מיון החיץ (BSA 1% בפתרון שטיפת MACS, מעוקר באמצעות עובר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר).
   1. להוסיף 35 μl של microbeads המגנטי גם המעורב מוצמד לנוגדן ראשוני CD56 (שיבוט AF12-7H3, 130-050-401) לפתרון התא, פיפטה לערבב ולהשאיר לדגירה במשך 15 דקות ב 4 C עם תסיסה עדינה ב נקודת אמצע הדרך.
4. לאחר דגירה, לדלל את פתרון התא וחרוז עם 10 מיליליטר של MACS מיון חיץ צנטריפוגות ב 657 XG במשך 6 דקות. Resuspend תאי 1 מיליליטר של חיץ מיון.
5. הוסף את מפריד MACs (מגנט) לMACS מחזיק מעמד. היזהר בעת הוספת מגנט לדוכן עקב השדה המגנטי החזק. חריץ בעמודה ולהתאים את המסנן לפני ההפרדה. פיפטה 1 מיליליטר של חיץ מיון דרך המסנן מראש הפרדה ועמודה לשימון.
6. Immediatאיליי אחרי זה, לערבב בעדינות את ההשעיה התא ולטפטף כל 1 מיליליטר דרך מסנן Pre-הפרדה ולטור.
7. לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם 1 מיליליטר (או 500 μl) של מיון חיץ. לאסוף את התאים-שמר שאינו שעוברים בעמודה על הסוג הראשון בצינור חרוטי סטרילי 50 מיליליטר המכיל כמות קטנה של מדיום גידול. תאים אלה הם CD56 הסוג הראשון ^- חלק ויהיה מועשרים לfibroblasts רקמת חיבור. אל תתנו לעמודה להתייבש בין שוטף.
8. לאחר שטיפות להסיר את מסנן קדם-ההפרדה ולהוסיף 2.5 מיליליטר של חיץ MACS לעמודה. לאחר מכן להסיר באופן מיידי את העמודה מהמגנט ולאסוף את CD56 הסוג הראשון ⁺ חלק בצינור 50 מיליליטר חרוטי נפרד על ידי לחיצה על הבוכנה לתוך החלק העליון של העמודה.
   הערה: הבוכנה מתאימה מאוד הדוקה לחלק העליון של העמודה ויכולה להיות די מסובך לתפעול; עם זאת, זה חייב להיעשות תוך הטור הוא עדיין full של חיץ, כך נדרשת מהירות. הימנע מדכא על הבוכנה חזקה ומהר מדי.
9. לפני ציפוי להעריך את הכדאיות של התאים באמצעות, למשל, assay trypan הכחול. לקבוע את אחוז תאי קיימא מתחומים 8 מ"מ x 1 ² ספירה (שני בתי hemocytometer).
   הערה: התאים יכולים להיות יחיד או כפול מסודרים בהתאם לטוהר הנדרש. אם נעשה בזהירות תאים אלה לסבול את הליך המיון הכפול היטב וכדאיות היא מאוד גבוהה> 95%. למיון כפול, להגדיר עמודה נוספת, לשמן עם 1 מיליליטר של חיץ מיון ולהמשיך משלב 4.6.
   1. אם הדמיה היא שיש לבצע, תאי צלחת ישירות על coverslips זכוכית ממוקם ב 24 מנות גם ²¹ ומצופה עם הבחירה שלך של מולקולת ECM עבור קובץ מצורף תא (למשל קולגן או laminin). כאן, להשתמש .1-0.5 מ"ג / מיליליטר קולגן אני (לוח 3).

5. מיון של HumFibroblasts-נגזר שריר מייד לאחר הבידוד.

1. כדי לטהר אבות פיברובלסטים מייד לאחר בידוד, להעסיק את הפרוטוקול כאמור בשינויים הבאים:
   1. מייד לאחר תאי resuspend הבידוד בינוניים מלא ומסנן פעם אחת אף מסננת מיקרומטר תא 100 ולאחר מכן שוב למרות מסננת 40 מיקרומטר. הוסף 5 מיליליטר של PBS וספין ב657 XG במשך 6 דקות.
   2. Resuspend תאי MACS מיון חיץ דגירה בmicrobeads פיברובלסטים Anti-אדם במשך 15-30 דקות בטמפרטורת חדר.
   3. השתמש בעמודת LS ומפריד Midi-MACS (לוח 3) ולהתקין המסנן לפני ההפרדה 40 מיקרומטר.
   4. בצע מיני אחד או שניים בהתאם לטוהר הנדרש, להעביר את התאים בהקדם האפשרי למדיום המכיל סרום, לבצע ספירה, וצלחת החוצה בצפיפות הרצויה

6. Immunocytochemical מכתים (יום 1 ולילה).

1. תקןתאים בבארות שלהם על ידי התוספת של נפח שווה של paraformaldehyde 8% בPBS קר כקרח במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה. לאחר מקבע לשאוב 10 דקות ולשטוף פעמיים עם PBS.
2. לimmunostain אנטיגנים פני תא, תאי גוש במשך שעה לפחות 1 ב 1% אלבומין בסרום שור (BSA) בPBS ולאחר מכן לבדוק עם הנוגדנים הרלוונטיים העיקריים (לוח 4).
   1. לאנטיגנים תאיים, permeabilize תאים לאחר קיבוע על ידי תוספת של 0.2% Triton-X 100 ב- PBS עם BSA 1% ונאן ₃ (0.01%) במשך 10 דקות, ואז לחסום דגירה עם נוגדנים ראשוניים. לבצע את כל incubations הנוגדן הראשוני לילה בטמפרטורת חדר (או ב 4 מעלות צלזיוס) עם תסיסה עדינה על פלטפורמת נדנדה.
3. הסר נוגדן ראשוני מאוגד ולשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS הקר. דגירה של הדגירה שעה 1 עם נוגדנים משני שכותרתו fluorescently מינים ספציפיים (לוח 4) בטמפרטורת חדר.
4. לאחר הסרתנוגדנים משני מאוגד, לשטוף תאים עם שלושה חילופים של PBS ולאחר מכן counterstain עם צבע ניאון DNA Hoechst 33342 (1 מיקרוגרם / מיליליטר) פתרון עבור 10 דקות על פלטפורמת נדנדה.
5. להדמיה בו זמנית של שני אנטיגנים פני התא ואנטיגנים תאיים, תאי הבדיקה ראשון עם נוגדנים ראשוניים ועד לתא אנטיגנים משטח ואחריו הנוגדנים משני המתאימים שלהם. בשלב הבא, מחדש לתקן את התאים בקור PFA, Permeabilize, בלוק ולדגור עם נוגדנים עיקריים נגד אנטיגנים cytoplasmic או גרעיניים ואחריו הנוגדנים משני המתאימים שלהם.
6. לאחר צביעה, להסיר coverslips מהבארות שלהם באמצעות מלקחיים מעוקלים ולשטוף האחורי של coverslip שימוש במים מזוקקים. הנח את תא coverslip להחליק על ירידה של אנטי לדעוך הרכבה סט ²² בינוני בשקופית מיקרוסקופ זכוכית.

7. מכתים השמן האדום O בשילוב עם Immunofluorescent צביעת תאים (2 שעות)

1. לחשוףתוכן השומנים של תאים מצופים ב 24 מנות גם על ידי צביעה עם השמן האדום O (1 - ([4 (Xylylazo) xylyl] אזו) -2-naphthol) ^5,23. ראשית להכין פתרון מניות של 0.5% (w / v) שמן האדום O על ידי המסת 500 מ"ג של השמן האדום O ב 60 מיליליטר של 99% triethyl-פוספט ו -40 מיליליטר של מים מזוקקים. שמור פתרון זה בטמפרטורת חדר בחושך עד לשימוש.
2. ביום של שימוש, להפוך את 36% (w / v) פתרון triethyl-פוספט עבודה, המכיל 12 מיליליטר של פתרון מניות הנפט האדום O ו -8 מיליליטר של מים מזוקקים. סנן את הפתרון הזה באמצעות מספר נייר סינון 42 כדי להסיר את כל המגובש השמן האדום O (שפוגע באיכות תמונה).
3. בעדינות לחמם פתרון עובד זה באמבט מים במשך שעה 1 לאחר שהפתרון הוא הסתובב ב1,200 XG במשך 6 דקות. הסר את supernatant ולסנן שוב דרך נייר סינון (מספר 42) ולהעביר צינור 20 מיליליטר טרי.
4. לאחר תאים תוקנו, permeabilised וimmunostained, להסיר את PBS ולהוסיף 500 μl של השמן האדום O / Triethyl-phosפתרון phate לבארות במשך 60 דקות. Triton-X בריכוז המשמש כאן לpermeabilisation קרום תא אינו משפיע על תוכן שומנים סלולריים ^23.
   הערה: השמן האדום O היא נרגשת אורכי גל שבין 540 ו580 ננומטר, ולכן המסנן טקסס-האדום יכול לשמש כדי לזהות פליטת השמן האדום O במיקרוסקופ פלואורסצנטי ^23. שים לב כי פליטת הקרינה משמן האדום O לעתים יכולה לדלוף לתוך התעלה הרחוקה אדומה אם תאים מאוד מאוד מוכתמים (תכולת שומן כלומר, גבוהה מאוד).
5. לאחר דגירה, להסיר עודפי שמן האדום O ולשטוף את התאים חמש פעמים עם 500 μl של PBS. הר coverslips כלimmunostaining כאמור בסעיף 6. זיהוי צבע השמן האדום O על ידי שני brightfield / מיקרוסקופ לעומת השלב או על ידי מיקרוסקופ epifluorescence באמצעות המסנן האדום טקסס (משמרת חופשית, EX BP 560/40, BS FT 585, EM BP 630 / 75, Carl Zeiss).

8. קבלת micrographs ממיקרוסקופ פלואורסצנטי לעוקביםalysis

הערה: ודא שמחליק להשוואת כמותית מגואלות באותו הפתרונות, צולמה בתנאים זהים (לדוגמא, חשיפה, מצלמה והגדרות רכישה וכו ') וכבשו באותה ההפעלה מיקרוסקופ. כל העיצוב שלאחר הרכישה צריך גם להיות זהה ויהיה בהתאם להנחיות קפדניות הציעו לתמונות דיגיטליות ^24.

1. לרכישת תמונה (מיקרוסקופיה widefield), להפעיל את מקור אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולצאת לכמות המומלצת של זמן כדי לאפשר את מקור הקרינה האור להתחמם ולייצב.
2. הגדר את הזרם האפל למצלמה על ידי חסימת נתיב האור למצלמה; לרכוש תמונה ברזולוציה מקסימלית ולהשתמש בזה כדי לתקן תמונות שנרכשו לאחר מכן.
3. להאיר בדיקות immunofluorescent ידי epifluorescence מועבר על ידי מדריכי אור נוזליים (צינור גמיש של fluoroplastic מלא בשמן סיליקון phenylmethyl)nd אותות דמיינו דרך אדום (מסנן להגדיר 45 HQ טקסס משמרת אדומה חופשי ירוק (מסנן, נקבע 44 משמרת FITC מיוחדת חינם) וכחול (מסנן להגדיר מסננים לעבור להקה חינם) 49 משמרת DAPI על מיקרוסקופ פלואורסצנטי העלית הפוך (10X, 20X, 40X, מתכנן יעדי apochromatic עם 0.25, 0.75, 0.95 פתחים מספריים בהתאמה).
4. כדי למנוע הרוויה פיקסל למצוא את החשיפה האופטימלית בטווח ליניארי של הגלאי לכל סמן ניאון באמצעות התכונה 'חשיפת היתר' של תוכנת רכישת תמונה. רשום את החשיפה הסטנדרטית לכל תווית ניאון.
5. ללכוד ערוצים בודדים ולשמור בגווני אפור או TIFF pseudocolored (פורמט קובץ תמונה מתויג) קבצי תמונות בעומק סיבית הגבוהה ביותר (רצוי 16 ביט - 65,536 ערכים אפורים) המסופק על ידי מכשיר ההקלטה (למשל מקורר CCD (טעון מכשיר בשילוב) מצויד למיקרוסקופ) . הגדר את רזולוציית התמונה ל1,388 x 1,040 או גבוה יותר. הקפד לכלול סרגל קנה מידה או אובייקט של di הידועmensions בתמונה.
6. איפה אפשר לשמור את הקבצים בפורמט 16 ביט מתויג קובץ תמונה (.tiff) ולא בתבנית jpeg כדי למנוע אובדן של מידע ^25.
7. אם קיים חשש כלשהו על השוויון של תאורה (תוכנה יחד עם מיקרוסקופ יכול להיות תיקון אוטומטי לזה) לקחת תמונה "שטוח שדה 'של coverslip ללא תאים אך מוכתם ורכוב באותו אופן ניסיוני שקופיות כ; זה יכול לשמש גם כדי לתקן את הפגמים תאורת פוסט-רכישה בתוכנת ניתוח תמונה.
8. לרכישת תמונה (מיקרוסקופיה confocal), לייעל רווח גלאי וכוח הלייזר עבור כל ניסוי הדמיה (למנוע הרוויה). באופן כללי, את הקרינה שנמדדה היא פרופורציונלית לרמת כוח הלייזר. גודל חריר מוגדר 'אוורירי 1' כדי להשיג יחס אות לרעש הטוב ביותר (רזולוציה משופרת עשוי להיות מושגת על 0.5 אוורירי לאותות חזקים במיוחד). קח חלקים אופטיים ברמות שונות לאורך ציר z דרך הנמליםibody שכותרתו תאים ולשמור הקרנה מקסימלי 16 ביט לכל ערוץ לניתוח תמונה.

9. מדידות ביצוע של שכותרתו fluorescently גורמי שעתוק גרעיניים באמצעות עיבוד תמונה וניתוח תוכנה (מינימום 5 לכל שדה ראיה).

1. גישה לקבצי TIFF פרט תמונה וערוצי כיסוי המתאימה על ידי לחיצה וגרירת תמונה אחת לאחרת. אז כל ערוץ יופיע כשכבת נפרדת בלוח השכבות.
2. בחר להאיר מתפריט המסנן כדי לאפשר שכבות מתחת להיות דמיינו במקביל. לחלופין, להתאים את האטימות של השכבות העליונים ל -50%.
   ניתן לשמור תמונות TIFF עם-זיו-וולש למפל הדחיסה 'lossless' (LZW) נתונים להורדת גודל קובץ ללא אובדן המידע: הערה.
3. בחלון הניתוח (ניתוח> בחר נתונים נקודות> מותאם אישית), בחר ניתוח ולבחור את המדידות נדרשת (צפיפות משולבת לדוגמא,, אומר density, מעגלי, היסטוגרמה וכו '). לבטל את כל מדידות מיותרות על ידי ביטול סימון בתיבה שלידם. אם מדידות שטח נדרשות בלחיצת מיקרומטר על ניתוח> סט המדידה Scale. כלי השליט באופן אוטומטי יופיע - עקבות אורכו של סרגל קנה המידה ולהיכנס אורכו הידוע במיקרומטרים. לאחר מכן התוכנה תהיה להמיר מדידות שטח למיקרון מרובע.
   הערה: אם ניתוח ההיסטוגרמה נבחר, כאשר מדידות נרשמו תיקייה נוספת תופיע (המיקום של מה שיכול להיות שנבחר) עם 8 היסטוגרמות קצת לכל תחום פרט בחירה במיקרוסקופ, כמו גם הסיכום של כל בחירות הפרט (זה תמיד מופיע כהיסטוגרמה-1 אם בחירות מרובות שנעשו). ניתוח זה לא יכול להתבצע על ידי התוכנה בפורמט 16 ביט, אבל הוא שימושי מאוד לבחינת חלוקת עוצמות פיקסל בכל אובייקט של עניין.
4. לניתוח של עוצמת הקרינה הגרעינית הראשון לבנות representative 'צבע טווח מסכת הבחירה' (CRSM) לHoechst או DNA המוכתם DAPI להגדיר אזור גרעיני. ברגע שתמונות הערוץ הרצוי הם כיסו, רק את שכבת ערוץ Hoechst יש להשאיר לאור על ידי הבטחה של סמל העין 'הסמוך לו בכרטיסיית השכבות נבחרה ולאחר מכן שכבה מסומנת (הופך לכחול), ואילו כל השכבות האחרות צריכה להיות לבטל את הבחירה. ודא נפתחת המיזוג מוגדר חזרה ל'רגיל 'בכרטיסיית השכבות.
5. פתח את תיבת הדו-שיח טווח הצבע (בחר> טווח צבע) ולהגדיר את נפתחת אפשרות בחירה ל'צבעי נדגמה '. עם התצוגה המקדימה הבחירה מוגדרת 'מסכה מהירה' (רקע אדום) בחר את כל גווני הצבע הכחולים בתוך הגרעינים על ידי החזקת המקש Shift (סימן '+' מופיע) ולחיצה בתוך הגרעינים באמצעות הכלי טפטפת העין שמופיע.
   1. אם צלילים לא רצויים נבחרים, להסיר אותם על ידי לחיצה על מקש Alt ('─'sign מופיע) ולחיצהעליהם. לשמור על קנה המידה הטשטוש באפס, כך שגווני צבע רק נבחרו באופן ידני כלולים במדידה ו'אשכולות צבע מותאמים למקום "צריכים להיות נותרו מסומנים.
6. להציל CRSM זה לדיסק הקשיח של המחשב כ- ספציפית לתכנית לחלץ קובץ (קובץ .AXT). עם עוד שדה אקראי של גרעינים, עומס, עדכון, ולשמור את CRSM (בחר, טווח צבע, טען). לעשות את זה לפחות חמישה שדות אקראיים כדי להבטיח שבחירות גרעיניות הן נציג.
   1. השתמש בגרסה צבעונית של תמונה בגווני אפור ליצירת מסכה לבודד את התכונות כי העין האנושית היא יכולת טובה יותר להבחין בין גוונים השונים של צבע מאשר בין גוונים שונים של אפור ^26.
7. השתמש בCRSM הגרעיני לאזורים גרעיניים מגזר לצביעה. ברגע שהגרעינים שנבחרו לחצו על תמונה> התאמה> סף והזיזו את המחוון כל הדרך לימין, כך שהגרעינים ישחירו. לחלופין,לחץ לחיצה ימנית ובחר 'מלא' ולאחר מכן בחר 'מלא ל: שחור'. לאחר מכן לחץ על בחר> הפוך ועכשיו לחץ על Delete כדי להסיר את כל הרקע (אם האפשרות מופיעה לבחור "למלא ל: לבן '). זה בעצם binarizes התמונה המבוססת על הבחירה שלך. לאחר מכן טען את תוסף קו פרשת מים מכרטיסיית המסננים להפריד גרעינים חופפים (Filter> תמונה בינארי> הפרדת תכונת פרשת מים).
   1. אם גרעינים רבים חופפים במידה רבה, להסיר את הגרעינים מניתוח על ידי ביטול בחירתם (החזק את מקש Alt ועל רפיון לצייר סביבם עם הכלי לאסו).
8. על השכבה הגרעינית עכשיו בינארי, ללכת לבחרו> טווח צבע ו> צללים, כדי לבחור גרעינים בודדים. משמרת אלטרנטיבית אחיזה ולחץ בתוך כל גרעין אחד שחור. כל הגרעינים באופן מיידי שנבחרו. לאחר מכן להעביר את הבחירה לשכבה המכילה צביעת גורם שעתוק גרעיני (למשל myogenin) על ידי בחירת שכבה ושביטול בחירה כלשכבות אחרות. קווים צועדים כעת יציגו את העמדה של גרעינים בערוץ myogenin.
9. אם עובד עם תמונות pseudocolored לחץ רק על פלטת הערוצים (מימין לכרטיסיית שכבות) ובחר את הערוץ הירוק בלבד (התמונה תופיע כעת אפורה). לאחר מכן לחץ על תמונה> מצב> Grayscale. אזהרה תופיע "שיטוח שכבות גלויות וזורקי שכבות נסתרות 'אישור לחץ, אז אזהרה נוספת תגיד' להשליך ערוצים אחרים" לחץ על אישור שוב. רק שכבה אחת של גרעינים בגווני אפור שנבחרו עכשיו תהיה נוכחת בלוח השכבות.
   1. לחץ שיא מדידות ביומן המדידה לקבלת נתונים לגרעינים שנבחרו. אם השכבה להיות מנותחת (למשל myogenin מכתים) הוא כבר תמונת גלם 16 bit גווני אפור ואז פשוט ללחוץ שיא מדידות.
   2. מדידות נבחרו יצוא כקובץ txt למיקום על פי בחירתך. אז יכולים להיות מעובד אלה נוספים ונותחו בעמ תוכנת טיפול בנתונים האחרackages
      הערה: Edit> פקודת צעד אחורה (כל Alt, Ctrl ומקש Z בו-זמנית לעיתונות) משחזרת את כל השכבות הקודמות במידת צורך.
   3. נכון לקרינת רקע ספציפית שאינם ²⁷ לתוצאות להיות כמותי וכמו להשוות מדידות של עוצמת הקרינה הם תמיד תערובת של אות ורקע.
      1. בחר את כלי הבחירה המרובע ולבדוק "גודל קבוע" לבחור 20 על ידי 20 פיקסלים (או גדולים יותר אם תרצה בכך ובהתאם לconfluency של תאים בתמונה). בעוד מחזיק משמרת לבחור עשרה או יותר תחומים רקע פזורים ברחבי שדה הראייה. "המדידות רשומות" העיתונות ביומן המדידה.
      2. לחשב את הצפיפות הממוצעת המשולבת (הסכום של כל הערכים האפורים פיקסל) לכל פיקסל של כל 10 אזורי הרקע שנבחרו (ניתן כ'הערך האפור אומר 'ביומן המדידה). להכפיל את צפיפות הרקע הממוצעת לכל פיקסל במספר הפיקסלים באובייקט היעד ( כלומר, כל גרעין) לתת רקע ממוצע לאובייקט.
      3. הקרינה רקע פחת מאובייקטי צפיפות משולבת מקורית להניב הערך המתוקן רקע הסופי. גישה זו מהווה שדה פוטנציאלי לוריאצית שדה בקרינת רקע שאינו ספציפית.
         הערה: הוא בעל חשיבות עליונה לבחירת אזורי רקע רק בתום לב כתיקון זה יש השפעה ניכרת על הערכים הסופיים. התקרבות באמצעות זכוכית המגדלת מומלצת בעת ביצוע בחירות.
      4. זה יכול להיות גם שימושי לחלק את הערך הכללי רקע תוקן על ידי האזור של הגרעין בפיקסלים (כמו לקיחת רמה האפורה / עוצמת ממוצעת לגרעין) כדי למזער את השפעה פוטנציאלית של אות רקע מקומית גרעינית שתתרום יותר לצפיפות המשולבת ערך עם עלייה בגודל גרעיני (איור 3 ג).

תוצאות

תאי myogenic מטוהרים וfibroblasts יכולים להיות מתורבת במדיום בידול adipogenic במשך שלושה ימים ואחריו בינוני תזונת adipogenic מכל מקום בין 7-30 ימים כדי להעריך את הפוטנציאל שלהם לadipogenesis. שימוש באוכלוסיות התאים המטוהרים, מכתים השמן האדום O בשילוב עם immunostaining עבור סמני שושלת adipogenic וmyogenic הרא?...

Discussion

שתארנו הליך מיון immunomagentic להעשרה סלקטיבית של מבשרים המופק משריר אנושיים מדגימות קטנות של חומר ביופסיה של שריר. טכניקה זו כבר לא יסולא בפז במעבדה שלנו להתגברות על האובדן של תרבויות המופק משריר האנושיים לfibroblasts, אלא גם להבנת ההתנהגות הייחודית של אוכלוסיות שונות של אבות...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase  D	Roche	11088866001
Dispase II	Sigma	D4693-1G	Must be filter sterilized before use
Trypsin/EDTA	(Gibco) Invitrogen	15400-054
100 μm cell strainer	BD Biosciences	352360
Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid)	Sigma, Dorset, UK	C8919
Minisart SRP15 syringe filter (0.2 μm)	Sartorius	17573ACK	Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane
CD56 human Microbeads	Miltenyi Biotech	130-050-401	Be aware of the limited shelf life of microbeads
Anti- fibroblast Microbeads, human	Miltenyi Biotech	130-050-601
40 μm Pre-separation filters	Miltenyi Biotech	130-041-407
Large Cell Collumns	Miltenyi Biotech	130-042-202	These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here.
LS columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
MiniMacs Seperator	Miltenyi Biotech	130-042-102	This separator fits the large cell column but not the LS column.
MidiMACS	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS multistand	Miltenyi Biotech	130-042-303
BSA	Sigma		Must be filter sterilized before use
Oil Red O	Sigma	O0625
Triethyl phosphate	Sigma	538728
Whatman Paper	Sigma	Z241121-1PAK	No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering.
ProLong Gold Antifade Reagent	Molecular Probes, Invitrogen	P36930	This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence.
AxioVision	Carl Zeiss	Contact Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended	Adobe (purchased from Pugh Computers)	ADPH16982*