Isolement et quantitative immunocytochimique caractérisation des cellules myogéniques primaires et fibroblastes de muscle squelettique humain

Résumé

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Résumé

La réparation et la régénération du muscle squelettique nécessite l'action des cellules satellites, qui sont les cellules souches musculaires résident. Ceux-ci peuvent être isolés à partir d'échantillons de biopsie de muscle humain en utilisant une digestion enzymatique et leurs propriétés myogéniques étudiés en culture. Quantitativement, les deux principaux types de cellules adhérentes obtenues par digestion enzymatique sont les suivantes: (i) les cellules satellites (appelées cellules myogéniques ou de cellules précurseurs de muscle), identifié initialement comme CD56 ⁺ et par la suite en tant que CD56 ⁺ / desmine ⁺ cellules et (ii) muscle- fibroblastes dérivés, identifiés comme CD56 ^- et TE-7 ^+. Fibroblastes prolifèrent très efficacement dans la culture et dans les populations de cellules mixtes ces cellules peuvent dépassement cellules myogéniques de dominer la culture. L'isolement et la purification de types de muscle humain de cellules différentes est donc une considération méthodologique importante lorsqu'il se agit d'enquêter sur le comportement inné ou l'autre type de cellules en culture. Ici, nous DESCRBIE un système de tri basé sur la digestion enzymatique douce de cellules en utilisant de la collagénase et de la dispase suivie magnétique tri cellulaire activé (MACS) qui donne à la fois une grande pureté (> 95% des cellules myogéniques) et avec un bon rendement (~ 2,8 x 10 ⁶ ± 8,87 x 10 ⁵ cellules / g de tissu après 7 jours in vitro) pour les expériences de culture. Cette approche repose sur l'incubation de la population de cellules dérivées du muscle mixte avec des microbilles magnétiques des billes conjuguées à un anticorps dirigé contre CD56 et puis en faisant passer les cellules si un champ magnétique. CD56 ⁺ liés à microbilles sont conservés par le champ tandis CD56 ^- cellules passer sans entraves à travers la colonne. Les suspensions cellulaires de ne importe quelle étape du processus de tri peuvent être étalées et cultivées. Suite à une intervention donnée, la morphologie cellulaire et l'expression et la localisation des protéines, y compris des facteurs de transcription nucléaires peut être quantifiée en utilisant un marquage par immunofluorescence avec des anticorps spécifiques et une image pe traitement et logiciel d'analyse.

Introduction

La réparation et la régénération du muscle squelettique nécessite l'action des cellules satellites ^1, les cellules souches myogéniques ^2,3. In vivo ces cellules existent dans un état ​​réversible de repos située entre le sarcolemme et lame basale de chaque myofibre, mais se activent à proliférer, fusible et de différencier que le tissu musculaire est endommagé, réparer et régénérer ^3. Les cellules satellites peuvent être isolés à partir d'échantillons de biopsie musculaire humaine jeunes et les personnes âgées en utilisant une digestion enzymatique ⁴ et leurs propriétés myogéniques peut ensuite être étudié en culture primaire ^5. L'efficacité de ce processus d'isolement en ce qui concerne à la fois le rendement et la pureté de la population de cellules dépend des méthodes utilisées et peut varier d'un échantillon à. Les deux principaux types de cellules adhérentes obtenues à partir de la digestion enzymatique sont les cellules satellites (cellules myogéniques maintenant appelés ou des cellules précurseurs du muscle), identifiés initialement comme cellules CD56 ⁺ / desmine, et mufibroblastes SCLE dérivés, identifiés comme CD56 ^- et TE7 ^{+ 5} cellules. Fibroblastes ont un taux de prolifération rapide et ne subissent pas un arrêt de croissance irréversible et différenciation terminale lors d'un contact cellule-cellule comme les cellules myogéniques; Ainsi, dans des populations mixtes, les fibroblastes peuvent dépassement cellules myogéniques à dominer la culture.

Fibroblastes ont souvent été considérée comme une irritation pour les biologistes musculaires, cependant, il ya maintenant un intérêt croissant dans les fibroblastes en cellules dignes d'étude à part entière, d'autant plus qu'ils ont été montré pour avoir un rôle de coopération avec des cellules myogéniques pendant la réparation musculaire ⁶ . L'isolement et la purification de types de muscle humain de cellules différentes est donc une considération méthodologique importante lorsqu'il se agit d'enquêter sur le comportement inné de deux types de cellules en culture. Fluorescence-activated tri cellulaire (FACS) est un procédé par lequel les cellules peuvent être triés pour une étude plus poussée et / ou comptées etanalyser. FACS a été montré pour enrichir de manière fiable cellules myogéniques humaines, mais le rendement des cellules pour la culture subséquente a jusqu'à présent pas été élevé ^7. Compte tenu du potentiel de réplication limitée des cellules somatiques telles que les cellules satellite dérivés de cellules myogéniques et les très pauvres prolifération et la différenciation associés à la sénescence ^4, des approches plus douces sont nécessaires. Simples cultures de fibres musculaires offrent une autre, moins agressive, des moyens d'obtenir des cellules satellites murins résident encore dans leur niche sublaminal et après leur activation dans la culture ^8,9. Cependant, ce ne est souvent pas possible à partir de matériel de biopsie musculaire humaine (parce que les fibres peuvent rarement être obtenus à partir de tendon tendon) ce qui signifie que cette technique peut ne pas être accessible à de nombreux laboratoires de recherche intéressés à l'étude des cellules musculaires humaines dérivées. De plus, la technique de fibre simple ne fournit que le nombre de cellules très limitées.

Ici, nous décrivons un système de tri en fonction de la gendigestion enzymatique tle de cellules en utilisant de la collagénase et de la dispase suivie de deux cycles successifs de cellules activées magnétique de tri (de MACS) qui donne à la fois une grande pureté (> 95% des cellules myogéniques) et le rendement (~ 2,8 x 10 ⁶ ± 8,87 x 10 ⁵ cellules / g de tissu) pour des expériences dans la culture. CD56 est considéré comme le marqueur de surface or standard pour l'identification des cellules satellites humaines in situ et in vitro ¹⁰ et ¹¹ fournit la surface de marqueur candidat idéal pour la fixation de talon. Dans cette approche anticorps CD56 conjugués à l'oxyde de fer et des billes superparamagnétiques contenant des polysaccharides sont liés aux cellules et passé à travers une colonne de séparation cellulaire magnétique à gradient élevé placé dans un champ magnétique puissant ^12,13. Les colonnes de séparation sont remplis avec une matrice de laine d'acier ou de fer sphères ferromagnétiques qui servent à concentrer les lignes de champ magnétique vers leur surface générer des gradients de champ magnétique intense (~ de 4tesla) ¹⁴. Dans ces colonnes cellules même légèrement magnétiques sont attirés et adsorbées à leur surface ^14. Non consolidé (CD56 ^-), les cellules passent à travers la colonne alors que CD56 ⁺ des cellules marquées avec des microbilles magnétiques sont retenues jusqu'à ce que le retrait du champ magnétique ^12,15.

Les suspensions cellulaires de ne importe quelle étape du processus de tri peuvent être étalées à la densité désirée pour de nouvelles expérimentations. Suite à une intervention donnée les constituants cellulaires peuvent être identifiés en utilisant immunocytochimie, imagé en utilisant grand champ ou la microscopie confocale à fluorescence et analysé quantitativement en utilisant une approche d'analyse d'image qui permet une mesure objective rapide de toutes les cellules marquées dans une image donnée. Dans notre laboratoire, nous avons utilisé cette approche double tri immunomagnétique suivie par analyse d'image ¹⁶ pour démontrer que CD56 ^- fibroblastes humains transdifférencient facilement dans les adipocytes, tandis que la cellule myogéniques d'origine par satellite sont très résistants à cette conversion adipogénique ^5.

Protocole

NOTE: Pour les études réalisées dans notre laboratoire tous les sujets ont donné leur consentement écrit et éclairé à participer et à toutes les expériences ont été réalisées avec l'approbation du Comité d'éthique du National Health Service au Royaume-Uni (Comité éthique de la recherche de Londres; référence: 10 / H0718 / 10) et conformément aux la Loi sur les tissus humains et de la Déclaration d'Helsinki.

1. Préparation initiale Avant la biopsie musculaire (15 min)

1. Faire milieu de croissance de muscle squelettique humain. Pour un 50 ml tube conique stérile graduée ajouter 2,5 ml du mélange de supplément, 10 ml de sérum de veau foetal, des antibiotiques (pénicilline / streptomycine) et glutamine aux concentrations finales correctes (tableau 1) puis remplir le tube de 50 ml avec squelette de base musculaire milieu.
2. Placer 15 ml de milieu de base des muscles squelettiques dans un tube conique stérile de 20 ml et le peser. Une fois pesé lieu ce tube sur la glace. Utilisez cette option pour recevoir l'échantillon de muscle humain.
3. Dans un autre tube de 20 ml préparer 10 ml d'une solution d'enzyme collagénase D et dispase II à une concentration finale de 2 mg / ml par dissolution de chaque licence aliquotes de ces enzymes dans le muscle squelettique milieu de base. Filtre-stériliser la solution par passage à travers un filtre de 0,22 um. Placez ce mélange d'enzymes stérile dans le bain de l'incubateur ou de l'eau à 37 ° C pendant 15 min pour se réchauffer.
   NOTE: Ce mélange d'enzymes est légèrement plus doux que la trypsine et mieux maintient la viabilité des cellules ^17.
4. Mettez de côté une boîte de Pétri et une paire de scalpels stériles.

2. Muscle procédure de biopsie (45 min-1 heure)

1. Avant de recruter des participants, obtenir l'autorisation éthique complète et l'approbation de la procédure (y compris les vaccinations pertinentes pour expérimentateurs) de tous les organes directeurs compétents, les comités et les fournisseurs de soins de santé (par exemple, éthique, institutionnel, gouvernemental, etc.).
2. Créer un champ stérile autour de la jambe du (par exemple, avec des draps chirurgicaux stériles) unD nettoyer la zone autour du site de la biopsie avec un agent antibactérien antiseptique (chlorhexidine).
3. Anesthésier le site de biopsie proposée sur la jambe de l'volontaire par injection locale de lidocaïne à 2% dans la région sous-cutanée recouvrant le fascia du muscle vaste externe.
4. Faire une large incision ~ 5 mm en utilisant une lame chirurgicale stérile à travers la peau et le fascia et effectuer la procédure de biopsie à l'aiguille Bergström ¹⁸ avec aspiration supplémentaire.
5. En utilisant des pinces stériles supprimer le muscle de la lumière d'aiguilles et de plonger dans le milieu de base sur la glace. Transports le tissu au laboratoire pour traitement ultérieur dès que possible bien que les cellules myogéniques viables peuvent être obtenues après des périodes de 24 h ou plus.
6. Compte rendu de l'objet, nettoyer et sceller le site d'incision avec plusieurs bandes adhésives peau fermeture stériles et robe de façon aseptique avec un revêtement imperméable externe.

3. Isoler Muscle dérivé précurseur CeLLS (1 h, 30 min)

1. Retirer le tube contenant l'échantillon de muscle et le peser (assurez-vous que le tube est sec en essuyant avec le tissu). Calculer le poids de l'échantillon de muscle en soustrayant le poids du tube contenant du milieu et de l'échantillon à partir du tube contenant le milieu seul.
2. Agiter la solution plusieurs fois pour laver l'échantillon de sang du muscle. Laissez les sédiments musculaire à la température ambiante pendant 30 à 60 sec.
   1. Retirer pratiquement tout le volume du milieu du tube, en utilisant un premier auxiliaire de pipetage électronique ou aspirateur mais laisser environ 2-3 ml dans le tube.
   2. Inverser le tube sur une boîte de Pétri stérile permettant au fluide restant pour transporter l'échantillon de muscle sur le plat; utiliser le scalpel stérile pour extraire ne importe quel muscle reste fragments.Rotate le plat de mobiliser le liquide restant et l'enlever avec un pipette.Remove des morceaux visibles de graisse ou de tissu conjonctif.
3. Pour biopsies pesant de 100 à 400 mg, ajouter 3 ml de chaudsolution d'enzyme à l'aide de scalpels stériles et couper l'échantillon de muscle en très petits morceaux (<2.1 mm ^3).
4. Utiliser un large alésage 25 ml pipette établir le fragments musculaires et enzyme solution et le transfert à un tube de 10 ml conique stérile. Laver la boîte de Pétri avec un autre 3-5 ml de collagénase et solution enzymatique dispase et en utilisant une petite pipette de 10 ml recueillir des fragments musculaires restantes et les placer dans le tube. Le volume exact ne est pas critique.
5. Placer le flacon dans un 37 ° C incubateur (ou bain d'eau) pendant 60 min avec la trituration (pipette de 10 ml) toutes les 15 min.
6. Après 1 h mettre fin à la dissociation enzymatique par addition d'un volume équivalent de milieu de croissance préchauffé frais et passer la suspension de cellules à travers un filtre de 100 um pour enlever les débris de grande myofibre. Centrifuger la solution de cellules filtré à 657 g pendant 6 min à température ambiante (20-25 ° C).
7. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 7.5 ml de milieu de croissance et une plaque en T-25 non revêtuetissus flacon de culture. Transférer cette plaque dans l'incubateur à 37 ° C avec 5% _de CO2 pendant 7 jours. Changer le support toutes les 48 heures. A ce stade, les cellules myogéniques sont très petites et arrondies et difficile de discerner à partir de cellules non myogéniques.
   1. Au premier changement de milieu, centrifuger le surnageant pour obtenir un culot des cellules non adhérentes. Re-suspendre ceux-ci dans un milieu frais et re-plaque.
8. Après 7 jours de culture, veiller à ce que la plupart des cellules myogéniques (et fibroblastes) ont attaché mais les cellules ne ont pas encore atteint la confluence. Purifier les précurseurs myogéniques et effectuer MACS selon un protocole développé à l'origine par les laboratoires de Gherardi et Chazaud ^19,20 et en outre modifié par ⁵ nous.

4. Immunomagnétique Perle tri de cellules CD56 Basé sur Expression (1,5 h)

1. Après sept jours rinçage la monocouche cellulaire (qui contiendront typiquement 50-60% de cellules myogéniques ⁵⁾ avec trois échangesde solution tampon de phosphate à température ambiante (PBS) pour éliminer toutes les cellules et les débris non adhérentes restantes de l'isolement.
   1. Trypinize les cellules (0,04% de trypsine dans du PBS exempt de Ca2 ⁺ à 0,73 mM d'EDTA) pendant 3 minutes. Une fois que les cellules ont enlevé, ajouter 5 à 10 ml de milieu de croissance du muscle squelettique pour éviter une sur-digestion. Pellet les cellules par centrifugation à 657 g pendant 6 min à température ambiante (20-25 ° C) et remettre en suspension dans un volume approprié de milieu complet pour le comptage.
   2. Compter un petit échantillon de la suspension cellulaire en utilisant la méthode désirée (par exemple, en utilisant un hémocytomètre ou un dispositif de comptage automatique) et calculer à partir du nombre de cellules et la viabilité.
2. Plate quelques puits dans un (récipient ou plus si nécessaire) plaque de 96 puits pour immunocytochimique ou de débit caractérisation de la population sur la base de cytométrie en avant le tri (fibroblastes et les cellules myogéniques seront types de cellules les plus abondants).
3. Pour la suspension de cellules annonced 15 ml de PBS stérile pour diluer cellules et le milieu. Centrifuger les cellules à nouveau et les remettre en suspension dans 170 ul de la température ambiante tri tampon (1% de BSA dans une solution de rinçage MACS, stérilisé par passage à travers un filtre de 0,22 um).
   1. Ajouter 35 ul de microbilles magnétiques bien mélangés conjugués à un anticorps primaire CD56 (clone AF12-7H3, 130-050-401) dans la solution cellulaire, pipette pour mélanger et laisser incuber pendant 15 min à 4 ° C sous agitation douce à la mi-parcours.
4. Après incubation, diluer la solution de cellules et billes avec 10 ml de tampon MACS tri et centrifuger à 657 g pendant 6 min. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon de tri.
5. Ajouter le séparateur MACS (aimant) pour les MACS détenant stand. Prenez soin lors de l'ajout aimant au stand en raison de la fort champ magnétique. Fente dans la colonne et adapter le filtre de pré-séparation. Pipette 1 ml de tampon de tri à travers le filtre de pré-séparation et de la colonne pour la lubrification.
6. ImmédiatEly après cela, mélanger doucement la suspension de cellules et de se égoutter l'ensemble 1 ml à travers le filtre de pré-séparation et dans la colonne.
7. Laver la colonne trois fois avec 1 ml (ou 500 pi) de tampon de tri. Recueillir les cellules non retenu qui passent à travers la colonne de la première sorte dans un tube conique de 50 ml stérile contenant une petite quantité de milieu de croissance. Ces cellules sont CD56 de la première sorte ^- fraction et seront hautement enrichies pour les fibroblastes du tissu conjonctif. Ne laissez pas la colonne sécher entre les lavages.
8. Après des lavages de la retirer le filtre de pré-séparation et ajouter 2,5 ml de tampon MACS à la colonne. Ensuite, retirer immédiatement la colonne de l'aimant et recueillir le Tri CD56 ⁺ fraction dans un tube conique de 50 ml séparée en appuyant sur ​​le piston dans le haut de la colonne.
   REMARQUE: Le piston se intègre très bien dans le haut de la colonne et peut être assez difficile à utiliser; Toutefois, cela doit être fait tandis que la colonne est toujours full de tampon, afin vitesse est nécessaire. Évitez d'enfoncer le piston trop dur et rapide.
9. Avant le placage évaluer la viabilité des cellules en utilisant, par exemple, le dosage au bleu trypan. Déterminer le pourcentage de cellules viables à partir de champs de 8 x 1 mm ² de comptage (deux chambres du hémocytomètre).
   REMARQUE: Les cellules peut être simple ou double triés en fonction de la pureté requise. Si fait avec soin ces cellules tolèrent la procédure de double tri très bien et la viabilité est très élevé> 95%. Pour double tri, mettre en place une autre colonne, lubrifier avec 1 ml de tampon de tri et passez à l'étape 4.6.
   1. Si l'imagerie doit être effectuée, les cellules de la plaque directement sur ​​des lamelles de verre situées à 24 puits revêtues ²¹ et avec un choix de molécule d'ECM pour la fixation des cellules (par exemple du collagène ou de la laminine). Ici, utiliser 0,1 à 0,5 mg / ml de collagène I (tableau 3).

5. Tri des Humune fibroblastes musculaires dérivé immédiatement après l'isolement.

1. Pour purifier progéniteurs fibroblastes immédiatement après l'isolement, employer le protocole que ci-dessus avec les modifications suivantes:
   1. Immédiatement après que les cellules d'isolement de remettre en suspension dans un milieu complet et filtre une fois si une passoire 100 um de la cellule, puis de nouveau si une passoire 40 um. Ajouter 5 ml de PBS et de spin à 657 g pendant 6 min.
   2. Remettre en suspension les cellules dans MACS tampon de tri et incuber dans des microbilles de fibroblastes anti-humaines pour 15-30 min à température ambiante.
   3. Utilisez la colonne de LS et le séparateur Midi-MACS (tableau 3) et installer le filtre 40 um de pré-séparation.
   4. Effectuez une ou deux sortes en fonction de la pureté requise, transférer les cellules dès que possible dans un milieu contenant du sérum, effectuer un comptage, et étaler à la densité désirée

6. immunocytochimique coloration (un jour et nuit).

1. Fixercellules dans les puits par l'addition d'un volume égal de 8% de paraformaldehyde dans du PBS glacé pendant 10 min sous agitation douce. Après 10 min aspiration fixateur et laver deux fois avec PBS.
2. Pour immunocoloration des antigènes de surface cellulaire, des cellules de bloc pendant au moins 1 h dans 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du PBS et ensuite la sonde avec les anticorps primaires correspondants (tableau 4).
   1. Pour antigènes intracellulaires, perméabiliser les cellules après fixation par addition de 0,2% de Triton X-100 dans du PBS avec 1% de BSA et _{de NaN3} (0,01%) pendant 10 min, puis bloquer et incuber avec des anticorps primaires. Effectuer toutes les incubations d'anticorps primaires pendant une nuit à la température ambiante (ou à 4 ° C) avec agitation douce sur un plateau à bascule.
3. Retirer anticorps primaire non lié et laver les cellules trois fois avec du PBS froid. Incuber pendant 1 heure d'incubation avec des anticorps secondaires marquées par fluorescence spécifiques d'espèces (tableau 4) à la température ambiante.
4. Après élimination duAnticorps secondaires non liés, laver les cellules avec trois échanges de PBS puis Counterstain avec l'ADN colorant fluorescent Hoechst 33342 (1 pg / ml) de la solution pendant 10 min sur une plate-forme à bascule.
5. Pour la visualisation simultanée des deux antigènes de surface des cellules et des antigènes intracellulaires, les cellules de la sonde d'abord avec des anticorps primaires à des antigènes de surface cellulaire sont suivis par des anticorps secondaires appropriés. Ensuite, re-fixer les cellules dans le froid PFA, perméabilisent, bloc et incuber avec des anticorps primaires contre des antigènes cytoplasmiques ou nucléaires suivis par leurs anticorps secondaires appropriés.
6. Après coloration, retirez lamelles de leurs puits à l'aide des pinces courbes et rincer à l'arrière de la lamelle avec de l'eau distillée. Posez la cellule de lamelle glisser vers le bas sur une goutte de milieu de montage ²² ensemble sur une lame de microscope en verre anti-fade.

7. Oil Red O coloration en combinaison avec immunofluorescence de cellules (2 h)

1. Révélerla teneur en lipides des cellules plaquées dans 24 puits par coloration avec Oil Red O (1 - ([4- (Xylylazo) xylyle] azo) -2-naphtol) ^5,23. Tout d'abord préparer une solution mère de 0,5% (p / v) de Oil Red O en dissolvant 500 mg de Oil Red O dans 60 ml de 99% de triéthyle-phosphate et 40 ml d'eau distillée. Maintenir cette solution à la température ambiante dans l'obscurité jusqu'à utilisation.
2. Le jour d'utilisation, faire un 36% (p / v) de triéthyle-phosphate de travail, contenant 12 ml de solution stock Oil Red O et 8 ml d'eau distillée. Filtrer cette solution à travers le numéro de papier filtre 42 pour éliminer toute cristallisé Oil Red O (qui diminue la qualité de l'image).
3. Réchauffer doucement cette solution de travail dans un bain d'eau pendant 1 heure, après quoi la solution est centrifugée à 1200 g pendant 6 min. Eliminer le surnageant et filtrer de nouveau à travers un papier filtre (n ° 42) et transférer dans un tube propre de 20 ml.
4. Après que les cellules ont été fixées, perméabilisées et immunocolorées, retirez le PBS et ajouter 500 pi de Oil Red O / triéthyle-Phosphate solution dans les puits pendant 60 min. Triton-X à la concentration utilisée ici pour perméabilisation de la membrane cellulaire ne affecte pas le contenu cellulaire des lipides ^23.
   REMARQUE: Oil Red O est excitée par des longueurs d'onde entre 540 et 580 nm et par conséquent le filtre Texas-Red peuvent être utilisés pour détecter Oil Red O émission en ²³ microscopie à fluorescence. Notez que l'émission de fluorescence du Oil Red O peut parfois se infiltrer dans le canal rouge lointain si les cellules sont très fortement colorées (ce est à dire le contenu, très riche en matières grasses).
5. Après incubation, éliminer l'excès de Oil Red O et rincer les cellules cinq fois avec 500 pi de PBS. Monter les lamelles comme pour immunomarquage comme décrit au chapitre 6. Détecter Oil Red O colorant à la fois par fond clair / microscopie à contraste de phase ou par microscopie à épifluorescence en utilisant le filtre rouge Texas (déplacer gratuitement, EX BP 560/40, BS FT 585, EM BP 630 / 75, Carl Zeiss).

8. Obtention micrographies de microscopie à fluorescence pour la suite Unealy

REMARQUE: Veiller à ce que glisse à comparer quantitativement sont colorées avec les mêmes solutions, photographié à des conditions identiques (par exemple, l'exposition, l'appareil photo et les paramètres d'acquisition, etc.) et capturé dans la même session de la microscopie. Tous post-acquisition formatage devrait également être identiques et être en stricte conformité avec les lignes directrices proposées pour les images numériques ^24.

1. Pour l'acquisition d'image (microscopie à champ large), mettez la source de lumière microscope et fluorescence et partir pour la quantité recommandée de temps pour permettre à la source de lumière de fluorescence se réchauffer et de se stabiliser.
2. Réglez le courant d'obscurité pour la caméra en bloquant le chemin de lumière à la caméra; acquérir une image à la résolution maximale et l'utiliser pour corriger les images acquises ultérieurement.
3. Illuminez sondes d'immunofluorescence par épifluorescence délivré par guides de lumière liquides (tube flexible fluoré rempli d'huile silicone phénylméthyl) unème signaux visualisés au rouge (jeu de filtres 45 HQ Texas décalage vers le rouge libre, vert (jeu de filtres 44 FITC postes spécial gratuit) et bleu (jeu de filtres 49 DAPI décalage filtres passe libre de bande) sur un microscope épi-fluorescence inversé (10X, 20X, 40X, planifier objectifs apochromatiques avec 0,25, 0,75, 0,95 ouvertures numériques respectivement).
4. Pour éviter la saturation du pixel trouver l'exposition optimale dans la gamme linéaire du détecteur pour chaque marqueur fluorescent en utilisant la fonction «surexposition» du logiciel d'acquisition d'image. Prenez note de l'exposition standardisée pour chaque marqueur fluorescent.
5. Capturez des canaux individuels et enregistrez niveaux de gris ou tiff pseudocolored (format de fichier d'image étiqueté) des dossiers d'images dans la profondeur la plus élevée de bits (de préférence 16 bits - 65 536 valeurs de gris) fourni par le dispositif d'enregistrement (par exemple refroidi CCD (dispositif à couplage de charge) monté sur le microscope) . Réglez la résolution de l'image pour 1388 x 1040 ou plus. Soyez sûr d'inclure une barre d'échelle ou l'objet de di connuemensions dans l'image.
6. Lorsque ce est possible d'enregistrer des fichiers dans 16 format de fichier d'image binaires étiqueté (.tiff) et non au format .jpeg pour éviter la perte d'informations ^25.
7. Se il ya des préoccupations quant à la régularité de l'éclairage (logiciel livré avec microscope peut avoir pour cette correction automatique) prendre une image «flat-field» de lamelle sans cellules, mais teinté et monté de la même manière que des diapositives expérimentales; ceci peut être utilisé pour corriger les défauts d'éclairement post-acquisition dans le logiciel d'analyse d'image.
8. Pour l'acquisition d'image (microscopie confocale), optimiser le gain de détecteur et de la puissance laser pour chaque expérience d'imagerie (éviter la saturation). En général, la fluorescence mesurée est proportionnelle au niveau de puissance de laser. Régler la taille sténopé à '1 aéré' pour atteindre meilleur rapport signal-bruit (meilleure résolution peut être obtenue à 0,5 aéré pour les signaux particulièrement forts). Prendre sections optiques à différents niveaux le long de l'axe z à travers la fourmicellules ibody marqué et enregistrer une projection maximale de 16 bits pour chaque canal pour l'analyse d'image.

9. Les mesures de la scène marqué par fluorescence facteurs de transcription nucléaires par traitement d'images et de logiciel d'analyse (5 min par champ de vision).

1. Accès tiff individuelle des fichiers d'image et de superposition correspondant canaux en cliquant et en faisant glisser une image dans une autre. Chaque canal apparaîtra alors comme une couche séparée dans le panneau Calques.
2. Sélectionnez Eclaircir à partir du menu de filtre pour permettre couches dessous pour être visualisées simultanément. Sinon, réglez l'opacité des couches supérieures à 50%.
   REMARQUE: les images TIFF peuvent être enregistrés avec le Lempel-Ziv-Welch (LZW) compression de données "sans pertes" pour réduire la taille des fichiers sans perte d'information.
3. Dans la fenêtre d'analyse (Analyse> Sélectionner des points de données> Personnalisé), sélectionnez Analyse et choisir les mesures nécessaires (par exemple, la densité intégrée, Densité de signifiery, la circularité, histogramme, etc.). Jeter les mesures inutiles en décochant la case à côté d'eux. Si les mesures de surface sont nécessaires um cliquez sur Analyse> Définir l'échelle de mesure. L'outil de la règle apparaît automatiquement - tracer la longueur de la barre d'échelle et entrez sa longueur connue en micromètres. Le logiciel va alors convertir les mesures de la région en microns carrés.
   NOTE: Si l'analyse de l'histogramme est sélectionné, lorsque les mesures sont enregistrées dans un dossier supplémentaire apparaît (dont l'emplacement peut être choisi) avec 8 histogrammes de bits pour chaque zone de sélection individuelle sur la micrographie ainsi que la somme de toutes les sélections individuelles (ce apparaît toujours comme l'histogramme-1 si plusieurs sélections sont faites). Cette analyse ne peut être effectuée par le logiciel dans un format de 16 bits, mais il est très utile pour examiner la distribution des intensités de pixels dans l'ensemble un objet d'intérêt.
4. Pour l'analyse de l'intensité de fluorescence nucléaire d'abord construire un reprérepré- 'Couleur Range Sélection Mask' (CRSM) pour Hoechst ou de l'ADN teinté de DAPI pour définir domaine nucléaire. Une fois les images de canaux souhaités sont superposées, seule la couche de canal Hoechst doit être laissé en vue en assurant la «icône de l'œil» à côté de lui dans l'onglet couches est sélectionnée, puis la couche est en surbrillance (devient bleu), tandis que toutes les autres couches doivent être désélectionné. Assurez-vous que la liste déroulante mélange est réglé sur 'Normal' dans l'onglet couches.
5. Ouvrez la boîte de dialogue Color Range (Sélection> Plage de couleurs) et définir la sélection déroulant pour l'option «couleurs» échantillonnés. Avec l'aperçu de sélection mis à 'masque rapide »(fond rouge) sélectionner tous les tons de couleur bleue dans les noyaux en maintenant la touche Maj (signe« + »apparaît) et en cliquant dans les noyaux aide de l'outil pipette qui apparaît.
   1. Si des tonalités non désirées sont sélectionnées, retirez-les en appuyant sur la touche Alt ('─'sign apparaît) et en cliquant sursur eux. Maintenir l'échelle de flou à zéro afin que les tons de couleurs sélectionnées manuellement sont inclus dans l'évaluation et les «grappes de couleurs localisées» doit être laissée sans contrôle.
6. Enregistrer cette CRSM sur le disque dur de l'ordinateur comme un spécifique au programme (fichier .AXT) du fichier extrait. Avec un autre champ aléatoire de noyaux, charge, mise à jour et enregistrez le CRSM (Select, Gamme de couleurs, Load). Faites cela pour au moins cinq champs aléatoires pour se assurer que les sélections nucléaires sont représentatifs.
   1. Utilisez une version de couleur d'une image en niveaux de gris pour la création d'un masque pour isoler caractéristiques parce que l'œil humain est mieux en mesure de faire la distinction entre les différentes nuances de couleur que les nuances de gris entre ²⁶ variable.
7. Utilisez le CRSM nucléaire régions nucléaires de segments pour la coloration. Une fois noyaux ont été sélectionnés, cliquez sur Image> Réglages> Seuil et déplacez le curseur tout le chemin vers la droite, de sorte que les noyaux deviennent noires. Alternativement,clic droit et sélectionnez «Remplir» puis choisissez «Remplissez à: noir». Ensuite, cliquez sur Select> Inverse et maintenant appuyez sur Suppr pour supprimer tous fond (si l'option apparaît choisissez 'à combler: Blanc'). Ce binarise essentiellement l'image en fonction de votre sélection. Puis charger le plugin du bassin versant de l'onglet filtres pour séparer les noyaux se chevauchent (Filter> image binaire> fonction séparation des bassins versants).
   1. Si de nombreux noyaux sont fortement chevauchement, retirez les noyaux de l'analyse en les désactivant (Maintenez la touche Alt et dessiner vaguement autour d'eux avec l'outil lasso).
8. Sur la couche nucléaire maintenant binaire, aller à Sélection> Plage de couleurs et> Ombres, pour sélectionner noyaux individuels. Alternative changement de garde et clic dans une quelconque noyau noir. Tous les noyaux seront immédiatement être sélectionnés. Puis transférer cette sélection pour la couche contenant du facteur de transcription nucléaire coloration (par exemple myogénine) en sélectionnant cette couche et désélectionner tousd'autres couches. Marching lignes vont maintenant montrer la position des noyaux dans le canal de myogénine.
9. Si vous travaillez avec des images pseudocolored seulement cliquer sur le palette Couches (à droite de l'onglet couches) et ne sélectionnez que le canal vert (l'image apparaît maintenant gris). Ensuite, cliquez sur Image> Mode> Niveaux de gris. Un avertissement apparaîtra 'aplatir les calques visibles et jetez couches cachées de cliquer sur Valider, puis un autre avertissement dire «jetez les autres chaînes de nouveau sur OK. Une seule couche de niveaux de gris sélectionnée noyaux sera désormais présente dans la palette des calques.
   1. Cliquez sur Enregistrer les mesures dans le journal des mesures pour obtenir des données pour les noyaux sélectionnés. Si la couche à analyser (par exemple myogénine coloration) est déjà une 16 bits image brute en niveaux de gris, puis appuyez simplement sur ​​Enregistrer les mesures.
   2. Exportation mesures sélectionnées en fichier txt à l'emplacement de votre choix. Ceux-ci peuvent ensuite être traitées et analysées dans un autre logiciel de traitement de données packages
      NOTE: L'Edition> étape commande vers l'arrière (de presse tous Alt, touches Ctrl et Z simultanément) restaure toutes les couches précédentes si nécessaire.
   3. Correct pour non fond spécifique fluorescence ²⁷ pour que les résultats soient comparables quantitative et que des mesures d'intensité de fluorescence sont toujours un mélange de signal et arrière-plan.
      1. Sélectionnez l'outil de sélection carrée et vérifier «taille fixe 'choisir 20 par 20 pixels (ou plus si désiré et en fonction de la confluence de cellules dans l'image). Tout en maintenant SHIFT sélectionner dix ou plusieurs zones de fond répartis dans tout le champ de vision. Mesures de presse Record 'dans le journal des mesures.
      2. Calculer la densité moyenne intégrée (somme de toutes les valeurs de gris de pixels) par pixel de l'ensemble des 10 régions socio-démographiques (étant donné que la «valeur moyenne grise» dans le journal de mesure). Multiplier la densité du fond moyenne par pixel par le nombre de pixels de l'objet cible ( -À-dire, chaque noyau) pour donner fond moyen par objet.
      3. Soustraire fluorescence de fond à partir des objets de densité intégrée d'origine pour obtenir la valeur corrigée finale fond. Cette approche tient compte pour le champ potentiel de variation du champ de la fluorescence de fond non spécifique.
         NOTE: Il est de la plus haute importance de ne sélectionner que les régions de fond de bonne foi que cette correction a un impact considérable sur les valeurs finales. Zoom utilisant la loupe est recommandée lorsque vous effectuez des sélections.
      4. Il peut également être utile de diviser le fond valeur générale corrigé par la surface du noyau en pixels (même que la prise du niveau moyen de gris / intensité par noyau) afin de minimiser toute influence de potentiel de signal de fond localisée nucléaire qui contribuent davantage à la densité intégrée valeur avec l'augmentation de la taille nucléaire (figure 3C).

Résultats

Cellules fibroblastes et myogéniques purifiés peuvent être cultivées en milieu de différenciation adipocytaire pendant trois jours, suivie par du milieu de la nutrition adipogénique de ne importe où entre 7-30 jours pour évaluer leur potentiel de l'adipogenèse. Utilisation des populations cellulaires purifiées, Oil Red O en combinaison avec une coloration immuno-coloration pour les marqueurs de lignage adipogènes et myogéniques ont montré que seule la fraction de fibroblastes était capable de différen...

Discussion

Nous avons décrit un procédé de tri immunomagentic pour l'enrichissement sélectif de précurseurs musculaires humaines dérivées à partir de petits échantillons de matériau de biopsie musculaire. Cette technique a été inestimable dans notre laboratoire pour surmonter la perte de cultures dérivées du muscle de fibroblastes humains, mais également pour comprendre le comportement unique de populations distinctes de progéniteurs dérivées du muscle. Cellules myogéniques Une fois purifiés peuvent être ?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase  D	Roche	11088866001
Dispase II	Sigma	D4693-1G	Must be filter sterilized before use
Trypsin/EDTA	(Gibco) Invitrogen	15400-054
100 μm cell strainer	BD Biosciences	352360
Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid)	Sigma, Dorset, UK	C8919
Minisart SRP15 syringe filter (0.2 μm)	Sartorius	17573ACK	Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane
CD56 human Microbeads	Miltenyi Biotech	130-050-401	Be aware of the limited shelf life of microbeads
Anti- fibroblast Microbeads, human	Miltenyi Biotech	130-050-601
40 μm Pre-separation filters	Miltenyi Biotech	130-041-407
Large Cell Collumns	Miltenyi Biotech	130-042-202	These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here.
LS columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
MiniMacs Seperator	Miltenyi Biotech	130-042-102	This separator fits the large cell column but not the LS column.
MidiMACS	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS multistand	Miltenyi Biotech	130-042-303
BSA	Sigma		Must be filter sterilized before use
Oil Red O	Sigma	O0625
Triethyl phosphate	Sigma	538728
Whatman Paper	Sigma	Z241121-1PAK	No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering.
ProLong Gold Antifade Reagent	Molecular Probes, Invitrogen	P36930	This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence.
AxioVision	Carl Zeiss	Contact Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended	Adobe (purchased from Pugh Computers)	ADPH16982*