Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

Resumo

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Resumo

A reparação e regeneração do músculo esquelético requer a acção de células satélites, que são as células estaminais musculares residente. Estes podem ser isolados a partir de amostras de biópsia do músculo humano, utilizando a digestão enzimática e as suas propriedades miog�icas estudadas em cultura. Quantitativamente, os dois tipos principais de células aderentes obtidas a partir da digestão enzimática são: (i) as células satélites (denominados células miogénicas ou células precursoras do músculo), inicialmente identificadas como CD56 ⁺ e mais tarde como células CD56 ⁺ / ⁺ e desmina (ii) músculo- fibroblastos derivados, identificadas como CD56 ^- e TE-7 ^+. Os fibroblastos proliferam de forma muito eficiente na cultura e nas populações de células mistas essas células podem invadir células miogênicas para dominar a cultura. O isolamento e purificação de diferentes tipos de células de músculo humano é, portanto, um aspecto metodológico importante quando se pretende investigar o comportamento inato de qualquer um dos tipos de células em cultura. Aqui nós descrIBE um sistema de triagem baseada na digestão enzimática suave de células utilizando colagenase e dispase seguido por triagem de células activadas magnético (MACS), que dá um alto grau de pureza (> 95% de células miogénicas) e um bom rendimento (2,8 x 10 ~ ⁶ ± 8,87 ⁵ x 10 células / g de tecido depois de 7 dias in vitro) para experiências em cultura. Esta abordagem baseia-se na incubação da população mista de células derivadas do músculo com microesferas contas magnéticas conjugadas com um anticorpo contra CD56 e, em seguida, passando células embora um campo magnético. As células CD56 ⁺ ligadas a microesferas são mantidas pelo campo enquanto que CD56 ^- células transitar livremente através da coluna. As suspensões de células a partir de qualquer fase do processo de triagem pode ser plaqueada e cultivadas. Após um determinado intervenção, morfologia celular, e a expressão e localização de proteínas, incluindo os factores de transcrição nuclear pode ser quantificada utilizando rotulagem de imunofluorescência com anticorpos específicos e uma imagem pRATAMENTO e pacote de análise.

Introdução

A reparação e regeneração do músculo esquelético requer a acção de células satélites ^1, as células estaminais miog�icas ^2,3. In vivo, estas células existir num estado quiescente reversivelmente localizado entre o sarcolema e lâmina basal de cada myofibre, mas tornar-se activado para proliferar, fusível e diferenciar como o tecido muscular danificado, reparado e regenerado ^3. Células satélite pode ser isolado a partir de amostras de biópsia jovens e idosos músculo humano utilizando digestão enzimática ⁴ e suas propriedades pode ser subsequentemente miog�icas estudado em cultura primária ^5. A eficiência deste processo de isolamento em conta tanto o rendimento e a pureza da população celular depende dos métodos utilizados e podem variar de amostra para amostra. Os dois tipos principais de células aderentes obtidas a partir da digestão enzimática são as células satélites (células miogénicas agora denominadas células precursoras ou músculo), inicialmente identificadas como células CD56 ⁺ / desmina, e mufibroblastos derivados de LECSA, identificadas como CD56 ^- e TE7 ^{+ 5} células. Os fibroblastos têm uma taxa de proliferação rápida e não sejam submetidos a parada do crescimento irreversível e diferenciação terminal em cima do contato célula-célula, como as células miogênicas; assim, em populações mistas, os fibroblastos podem invadida células miogênicas a dominar a cultura.

Os fibroblastos têm sido muitas vezes visto como uma irritação para os biólogos musculares, no entanto, agora há um interesse crescente em fibroblastos como células dignos de estudo em seu próprio direito, nomeadamente no que eles foram mostrados para ter um papel de cooperação com células miogênicas durante a reparação muscular ⁶ . O isolamento e purificação de diferentes tipos de células de músculo humano é, portanto, um aspecto metodológico importante quando se pretende investigar o comportamento inato de ambos os tipos de células em cultura. Activada por fluorescência de células (FACS) é um método pelo qual as células podem ser classificadas para estudo adicional e / ou contados eanalisado. FACS tem sido demonstrado de forma fiável para enriquecer células miogénicas humanos, mas o rendimento de células para cultura posterior, até agora não tem tido grande ^7. Dado o potencial de replicação limitado de células somáticas, tais como células derivadas de células-satélite Miogênicos e os muito pobres proliferação e diferenciação associados à senescência ^4, abordagens mais suaves são obrigatórios. Culturas de fibras musculares individuais oferecem uma outra, menos agressivo, os meios de obtenção de células satélites murino ainda residente em seu nicho sublaminal e após a sua ativação em cultura ^8,9. No entanto, isso muitas vezes não é possível a partir de material da biópsia do músculo humano (porque as fibras raramente pode ser obtido a partir de tendão para tendão) o que significa que esta técnica pode não ser acessível a muitos laboratórios de pesquisa interessados ​​em estudar as células derivadas de músculos humanos. Além disso, a técnica de uma única fibra apenas fornece o número de células muito limitadas.

Aqui nós descrevemos um sistema de triagem com base no gendigestão enzimática tle de células utilizando colagenase e dispase seguido por duas rondas sucessivas de triagem de células activadas magnético (MACS), que dá um alto grau de pureza (> 95% de células miogénicas) e rendimento (2,8 x 10 ~ ⁶ ± 8,87 x 10 ⁵ células / g de tecido) para experimentos em cultura. CD56 é considerado o marcador de superfície padrão de ouro para a identificação de células satélites humanos in situ e in vitro ^{10 11} e proporciona o marcador de superfície candidato ideal para a fixação do grânulo. Nesta abordagem, os anticorpos CD56 conjugado com óxido de ferro superparamagnético e grânulos contendo polissacáridos estão ligados às células e passado através de uma coluna de separação de células magnético de gradiente elevado colocada num campo magnético forte ^12,13. As colunas de separação são cheios com uma matriz de lã de aço ou de ferro ferromagnéticos esferas que servem para concentrar as linhas de campo magnético para a sua superfície gerar fortes gradientes de campo magnético (~ 4tesla) ¹⁴. Nestas colunas mesmo células ligeiramente magnéticas são atraídas e adsorvido à sua superfície ^14. Unbound (CD56 ^-) células passam através da coluna enquanto que as células CD56 ⁺ marcadas com microesferas magnéticas são mantidos até a retirada do campo magnético ^12,15.

As suspensões de células a partir de qualquer fase do processo de triagem pode ser plaqueada a uma densidade desejada para posterior experimentação. Após um determinado intervenção os constituintes celulares podem ser identificados usando imunocitoquímica, fotografada usando de campo amplo ou microscopia de fluorescência confocal e analisados ​​quantitativamente usando uma abordagem de análise de imagem que permite a rápida medição objectivo de todas as células marcadas em qualquer imagem. Em nosso laboratório temos usado essa abordagem triagem imunomagn�ica duplo seguido por análise de imagem ¹⁶ para demonstrar que CD56 ^- fibroblastos humanos prontamente transdiferenciam em adipócitos, enquanto célula miogênicas de origem satélite são altamente resistentes a esta conversão adipogênica ^5.

Protocolo

NOTA: Para os estudos realizados em nosso laboratório de todos os indivíduos deram o seu escrito, o consentimento informado para participar e todos os experimentos foram realizados com aprovação do Comitê de Ética Serviço Nacional de Saúde do Reino Unido (Comitê de Ética em Pesquisa Londres; referência: 10 / H0718 / 10) e de acordo com a Human Tissue Act e da Declaração de Helsinki.

1. Preparação inicial antes da biópsia do músculo (15 min)

1. Adicione meio de crescimento do músculo esquelético humano. Para uma estéril tubo de 50 ml formou adicionar 2,5 ml da mistura de suplemento, 10 ml de soro fetal de vitela, antibióticos (penicilina / estreptomicina) e de glutamina para as concentrações finais correctas (Tabela 1), em seguida, encher o tubo de 50 ml com basal músculo esquelético médio.
2. Colocar 15 ml do meio de base do músculo esquelético em 20 ml estéreis tubo cónico e pesá-lo. Uma vez que pesava lugar este tubo no gelo. Use-o para receber a amostra de músculo humano.
3. Em outro tubo de 20 ml preparar 10 ml de uma solução de enzima colagenase e Dispase II D a uma concentração final de 2 mg / mL por dissolução de cada banco de aliquotas destas enzimas no músculo esquelético meio basal. Filtro-esterilizar esta solução por passagem através de um filtro de 0,22 um. Coloque esta mistura de enzima estéril em banho de água ou incubadora a 37 ° C durante 15 minutos para aquecer.
   NOTA: Esta mistura de enzimas é um pouco mais suave do que a tripsina e melhor mantém a viabilidade das células ^17.
4. Separe uma placa de Petri e um par de bisturis esterilizados.

2. Procedimento de biópsia muscular (45 min-1 hr)

1. Antes de recrutar participantes, obter autorização ético completo e aprovação processual (incluindo vacinas relevantes para experimentadores) de todos os órgãos sociais relevantes, comissões e serviços de saúde (por exemplo, ético, institucional, etc. governamental).
2. Criar um campo estéril a em torno da perna (por exemplo, com lençóis cirúrgicos estéreis) umd limpe bem a área em torno do local da biópsia com um agente antibacteriano anti-séptico (clorexidina).
3. Anestesiar o local da biópsia proposto na perna do voluntário por injeção local de lidocaína a 2% na região subcutânea que recobre a fáscia do músculo vasto lateral.
4. Faça um ~ 5 milímetros incisão ampla usando uma lâmina cirúrgica estéril através da pele e fáscia e realizar o procedimento de biópsia por agulha Bergström ¹⁸ com sucção adicional.
5. Utilizando uma pinça estéril remover o músculo do lúmen de agulhas e mergulhar em meio basal no gelo. Transportar o tecido para o laboratório para posterior processamento, logo que possível embora as células miogénicas viáveis ​​podem ser obtidas depois de períodos de 24 h ou mais.
6. Discuta o assunto, limpar e selar o local da incisão com várias tiras de pele de fechamento adesivas estéreis e vestido de forma asséptica com uma cobertura impermeável exterior.

3. Isolando derivados de Muscle Precursor CeLLS (1 hr, 30 min)

1. Remover o tubo contendo a amostra de músculo e pesá-lo (certificar-se de tubo é seca limpando-o com o tecido). Calcule o peso da amostra de músculo subtraindo o peso do tubo de amostra contendo o meio e do tubo contendo apenas meio de cultura.
2. Agitar a solução várias vezes para lavar a amostra de sangue do músculo. Deixe o músculo sedimento à temperatura ambiente durante 30-60 seg.
   1. Remover quase todo o volume do meio do tubo, primeiro usando um auxiliar de pipetagem electrónico ou aspirador mas deixar aproximadamente 2-3 ml no tubo.
   2. Inverter o tubo sobre a placa de petri esterilizada permitindo que o fluido restante para transportar uma amostra do músculo para o prato; usar o bisturi estéril para extrair qualquer músculo remanescente fragments.Rotate o prato para mobilizar o líquido restante e removê-lo com uma pipette.Remove quaisquer pedaços visíveis de gordura ou de tecido conjuntivo.
3. Para biópsias pesando 100-400 mg, adicionar 3 ml de warmsolução de enzima e utilizando bisturis esterilizados cortar a amostra de músculo em pedaços muito pequenos (<1-2 mm ^3).
4. Usando um grande furo de 25 ml pipeta elaborar a solução fragmentos musculares e enzima e transferir para um estéril 10 ml tubo cônico. Lave a placa de Petri com mais um 3-5 ml de solução de enzima colagenase e dispase e usando um menor de 10 ml pipeta recolher quaisquer fragmentos musculares restantes e colocar no tubo. O volume exacto não é crítica.
5. Colocar o frasco dentro de uma incubadora a 37 ° C (ou banho de água) durante 60 minutos, com trituração (10 ml pipeta) a cada 15 min.
6. Depois de 1 hr terminar dissociação enzimática por adição de um volume equivalente de meio de crescimento fresco pré-aquecido e passar a suspensão de células através de um filtro de 100 um para remover qualquer detrito grande myofibre. Centrifuga-se a solução filtrada a célula 657 xg durante 6 minutos à temperatura ambiente (20-25 ° C).
7. Ressuspender o sedimento de células em 5-7 ml de meio de crescimento e uma placa em T-25 não revestidobalão de cultura de tecidos. Transferir esta placa à incubadora a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 7 dias. Alterar o meio cada 48 horas. Nesta fase as células miogénicas são muito pequenas e arredondadas e difícil de discernir a partir de células não miogénicas.
   1. Na primeira mudança de meio, centrifugar o sobrenadante para sedimentar quaisquer células não aderentes. Re-suspender estes em meio fresco e re-plate.
8. Após 7 dias em cultura, garantir que a maioria das células miogénicas (e fibroblastos) ter anexado mas as células ainda não atingiram a confluência. Purifica-se os precursores e executar MACS miogénicos de acordo com um protocolo desenvolvido originalmente por nos laboratórios de Gherardi e Chazaud ^19,20 e ainda modificado por nós ^5.

4. Immunomagnetic Bead Seleção de células com base em CD56 Expression (1,5 h)

1. Após 7 dias de enxágüe a monocamada de células (que normalmente contêm 50-60% de células miogênicas ⁵⁾ com três trocasde solução tampão de fosfato temperatura ambiente (PBS) para remover quaisquer restantes células não aderentes e os restos do isolamento.
   1. Trypinize as células (0,04% de tripsina em PBS livre de Ca ²⁺ com 0,73 mM de EDTA), durante 3 minutos. Uma vez que as células têm destacado, adicione 5-10 ml de meio de crescimento do músculo esquelético para evitar o excesso de digestão. Agregar as células por centrifugação a 657 xg durante 6 minutos à temperatura ambiente (20-25 ° C) e ressuspender em um volume apropriado de meio completo para a contagem.
   2. Contagem de uma pequena amostra da suspensão celular usando o método desejado (por exemplo, utilizando um hemocitómetro ou um dispositivo de contagem automatizada) e calcular o número inicial de células e viabilidade.
2. Placa de alguns poços em uma placa de 96 poços (ou maior navio se necessário) para immunocytochemical ou fluxo caracterização baseada citometria da população antes de triagem (fibroblastos e células miogênicas serão os mais abundantes tipos presentes células).
3. Para o anúncio suspensão de célulasD 15 ml de PBS estéril para diluir as células e meio. Centrifugar novamente as células e ressuspender-los em 170 ul de tampão de triagem temperatura ambiente (1% de BSA numa solução de lavagem MACS, esterilizado por meio de passagem através de um filtro de 0,22 nm).
   1. Adicionar 35 ul de microesferas magnéticas bem misturadas conjugados a um anticorpo primário CD56 (clone AF12-7H3, 130-050-401) para a solução de células, pipeta para misturar e deixa-se incubar durante 15 min a 4 ° C com agitação suave no meio ponto.
4. Após a incubação, dilui-se a solução da célula e pérola com 10 ml de tampão e centrifuga-se MACS triagem em 657 xg durante 6 minutos. Ressuspender as células em 1 ml de tampão de triagem.
5. Adicionar o separador MACs (ímã) para os MACS segurando estande. Tome cuidado ao adicionar ímã para o suporte devido ao forte campo magnético. Slot na coluna e montar o filtro de pré-separação. Pipetar 1 mL de tampão de triagem por meio do filtro de pré-coluna de separação e para a lubrificação.
6. Immédiately após este, misturar suavemente a suspensão de células e de todo o gotejamento de 1 ml através de um filtro de pré-separação e para dentro da coluna.
7. Lava-se a coluna três vezes com 1 ml (ou 500 ul) de tampão de triagem. Recolher as células não-retido que passam através da coluna no primeiro tipo num tubo cónico de 50 ml estéril contendo uma pequena quantidade de meio de crescimento. Essas células são a primeira espécie CD56 ^{- Fração} e será altamente enriquecido para fibroblastos de tecido conjuntivo. Não deixe a coluna secar entre as lavagens.
8. Após lavagens a remover o filtro de pré-separação e adicionar 2,5 ml de tampão à coluna MACS. Em seguida, remover imediatamente a coluna do magnete e recolhem o primeiro tipo CD56 ⁺ fracção num tubo cónico de 50 ml separado por compressão do êmbolo para o topo da coluna.
   NOTA: O êmbolo se encaixa muito firmemente na parte superior da coluna e pode ser bastante complicado para operar; no entanto, isso deve ser feito enquanto a coluna ainda é full de tampão, de modo que é necessária velocidade. Evite pressionar o êmbolo muito duro e rápido.
9. Antes de avaliar a viabilidade do plaqueamento das células, utilizando, por exemplo, o ensaio de azul de tripano. Determine a porcentagem de células viáveis ​​a partir de campos de 8 x 1 mm ² de contagem (ambas as câmaras do hemocitômetro).
   NOTA: As células podem ser simples ou dupla classificados dependendo da pureza requerida. Se feito com cuidado essas células tolerar o procedimento duplo de classificação muito bem e viabilidade é muito alto> 95%. Para dupla classificação, configurar outra coluna, lubrifique com 1 ml de classificação de tampão e prossiga a partir do passo 4.6.
   1. Se imagem é para ser realizado, células da placa diretamente em lamelas de vidro situadas em placas de 24 poços ²¹ e revestidos com sua escolha de molécula de ECM para a fixação das células (por exemplo, colágeno ou laminina). Aqui, utilizar 0,1-0,5 mg / ml de colagénio-I (quadro 3).

5. Seleção de Humum derivado do músculo fibroblastos imediatamente depois do isolamento.

1. Para purificar fibroblastos progenitores imediatamente após o isolamento, empregar o protocolo tal como acima com as seguintes modificações:
   1. Imediatamente após Suspenda as células de isolamento em meio completo e filtro uma vez que um filtro mm célula 100 e, em seguida, novamente através de uma peneira de 40 mm. Adicionar 5 ml de PBS e girar em 657 g durante 6 min.
   2. Ressuspender as células em tampão de triagem MACS e incubar em fibroblastos microesferas anti-humanos durante 15-30 min à temperatura ambiente.
   3. Utilize a coluna LS e o separador Midi-MACS (Tabela 3) e instalar o filtro de pré-separação de 40 mm.
   4. Executar um ou dois tipos, dependendo da pureza requerida, transferência das células, logo que possível, em meio contendo soro, realizar uma contagem, e a placa a uma densidade desejada

6. Immunocytochemical coloração (1 dia e durante a noite).

1. Fixarcélulas nas suas cavidades por adição de um volume igual de 8% de paraformaldeído em PBS arrefecido em gelo durante 10 min com agitação suave. Após 10 min aspirado fixador e lava-se duas vezes com PBS.
2. Para imunocoloração antigénios da superfície celular, as células de bloco para pelo menos 1 h, em 1% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS e em seguida sondar com os anticorpos primários relevantes (Tabela 4).
   1. Para antigénios intracelulares, permeabilizar as células após a fixação por adição de 0,2% de Triton X-100 em PBS com BSA a 1% e _NaN3 (0,01%) durante 10 min, então o bloco e incubar com anticorpos primários. Executar todas as incubações do anticorpo primário durante a noite à temperatura ambiente (ou a 4 ° C), com agitação suave, numa plataforma oscilante.
3. Remover o anticorpo primário não ligado e lave as células três vezes com PBS frio. Incubar durante 1 hora de incubação com anticorpos secundários fluorescentemente marcado específicos de espécie (Tabela 4) à temperatura ambiente.
4. Após a remoção doanticorpos secundários não ligados, lavar as células com três trocas de PBS e, em seguida, contracoloração com o corante de ADN fluorescente Hoechst 33342 (1 ug / ml) solução durante 10 minutos numa plataforma oscilante.
5. Para a visualização simultânea de ambos os antigénios da superfície das células e antigénios intracelulares, células primeira sonda com anticorpos primários para os antigénios de superfície celular seguidos pelos respectivos anticorpos secundários apropriados. Em seguida, re-fixar as células frio PFA, permeabilizar, bloco e incubar com anticorpos primários contra antígenos citoplasmáticos ou nucleares seguidos pelos seus anticorpos secundários apropriados.
6. Após a coloração, remover lamelas das suas cavidades, utilizando pinças curvas e enxaguar a parte de trás da lamela utilizando água destilada. Coloque o celular lamela deslize para baixo em uma gota de montagem médio ²² set em uma lâmina de vidro anti-fade.

7. Oil Red O Coloração por imunofluorescência em combinação com coloração de células (2 h)

1. Revelaro teor de lípidos de células plaqueadas em placas de 24 poços através de coloração com Vermelho de Óleo O (1 - ([4- (Xylylazo) xilil] azo) -2-naftol) ^5,23. Em primeiro lugar preparar uma solução de estoque de 0,5% (w / v) de Oil Red O dissolvendo 500 mg de Oil Red O, em 60 ml de 99% de trietil-fosfato e 40 ml de água destilada. Manter esta solução à temperatura ambiente no escuro até ser utilizado.
2. No dia da utilização, fazer uma de 36% (w / v) de solução de trietil-fosfato de trabalho, contendo 12 ml de solução de estoque Oil Red O e 8 mL de água destilada. Filtrar esta solução através do número de papel de filtro 42 para remover todos cristalizada Oil Red O (o que prejudica a qualidade da imagem).
3. Aquecer suavemente esta solução de trabalho em um banho de água durante 1 hora, após o que a solução é centrifugada a 1.200 x g durante 6 min. Remover o sobrenadante e filtra-se novamente através de papel de filtro (número 42) e transferência para um tubo de 20 ml fresco.
4. Depois de células foram fixadas, permeabilizadas e imunocorados, remova o PBS e adicionar 500 mL de Oil Red O / Triethyl-fossolução phate aos poços para 60 min. Triton-X na concentração utilizada aqui para permeabilização da membrana celular não afeta o teor lipídico celular ^23.
   NOTA: Oil Red O é excitado por comprimentos de onda entre 540 e 580 nm e, consequentemente, o filtro de Texas-vermelho pode ser usado para detectar Oil Red O emissão em microscopia de fluorescência ^23. Note-se que a emissão de fluorescência de Oil Red O ocasionalmente pode vazar para o canal vermelho distante, se as células são muito fortemente coradas (conteúdo ou seja, muito rica em gordura).
5. Após a incubação, remover o excesso de Oil Red O e lavar as células cinco vezes com 500 ul de PBS. Montar as lamelas como para immunostaining conforme descrito no capítulo 6. Detectar corante Oil Red O tanto por microscopia de contraste de brightfield / fase ou por microscopia de epifluorescência, utilizando o filtro Texas Red (shift livre, EX BP 560/40, BS FT 585, EM BP 630 / 75, Carl Zeiss).

8. A obtenção de micrografias de microscopia de fluorescência para posterior UmANÁLISE

NOTA: Certifique-se de que desliza para ser comparado quantitativamente estão manchadas com as mesmas soluções, fotografado em condições idênticas (por exemplo, exposição, configurações de câmera e de aquisição etc.) e capturado na mesma sessão de microscopia. Toda a formatação de pós-aquisição também devem ser idênticas e em estrita conformidade com as diretrizes sugeridas para imagens digitais ^24.

1. Para a aquisição de imagens (microscopia widefield), ligue a fonte de luz e microscópio de fluorescência e deixar para a quantidade recomendada de tempo para permitir que a fonte de luz de fluorescência para aquecer e se estabilizar.
2. Ajustar a corrente de escuro para a câmera, bloqueando o caminho da luz para a câmera; adquirir uma imagem com resolução máxima e usar isso para corrigir imagens adquiridos posteriormente.
3. Iluminar sondas de imunofluorescência por epifluorescência entregue por guias de luz líquidos (tubo flexível de fluoroplastic preenchido com óleo fenil silicone) and sinais visualizados através vermelho (conjunto de filtros de 45 HQ Texas desvio para o vermelho livre, verde (conjunto de filtros 44 FITC turno especial livre) e azul (conjunto de filtros filtros de passagem livre) banda de 49 turnos DAPI em um microscópio invertido epi-fluorescência (10X, 20X, 40X, planejar objetivos apocromáticas com 0,25, 0,75, 0,95 aberturas numéricas, respectivamente).
4. Para evitar a saturação de pixel encontrar a exposição ideal dentro da gama linear do detector para cada marcador fluorescente usando o recurso "Superexposição" do software de aquisição de imagem. Anote a exposição padronizado para cada etiqueta fluorescente.
5. Captura de canais individuais e salvar em tons de cinza ou tiff pseudocolored (image file format) arquivos de imagens em profundidade bit mais alto (de preferência de 16 bits - 65.536 valores de cinza) fornecida pelo dispositivo de gravação (por exemplo, arrefecido CCD (Charged Coupled Device) ajustada ao microscópio) . Defina a resolução de imagem de 1388 x 1040 ou superior. Certifique-se de incluir uma barra de escala ou objeto de di conhecidamensões na imagem.
6. Sempre que possível salvar arquivos no formato de arquivo bit tag de imagem de 16 (.tiff) e não em formato .jpeg para evitar a perda de informações ^25.
7. Se houver quaisquer preocupações sobre a uniformidade de iluminação (software empacotado com microscópio pode ter correção automática para isso) dar uma imagem 'flat-field' de lamela sem células, mas manchado e montado da mesma forma slides como experimentais; este pode ser utilizado para corrigir defeitos de iluminação após a aquisição em software de análise de imagem.
8. Para a aquisição de imagens (microscopia confocal), otimizar o ganho de detector e potência do laser para cada experiência de imagem (evitar a saturação). Em geral, a fluorescência medida é proporcional ao nível de potência de laser. Defina o tamanho pinhole para '1 arejado' para alcançar melhor relação sinal-ruído (melhor resolução pode ser alcançado em 0,5 arejado para sinais particularmente fortes). Tome secções ópticas em patamares ao longo do eixo z através da formigacélulas ibody marcado e salvar uma projeção máxima de 16 bits para cada canal para análise de imagens.

9. Medidas de palco de fluorescente etiquetado fatores de transcrição nuclear Usando Processamento de Imagem e Análise de Software (5 min por campo de visão).

1. Acesso a arquivos de imagem TIFF indivíduo e sobreposição correspondente canais clicando e arrastando uma imagem em outra. Cada canal irá aparecer como uma camada separada no painel de camadas.
2. Selecione Clarear a partir do menu filtro para permitir camadas abaixo de ser visualizadas simultaneamente. Em alternativa, ajustar a opacidade das camadas superiores a 50%.
   NOTA: As imagens TIFF podem ser salvas com o 'lossless' Lempel-Ziv-Welch (LZW) de compressão de dados para diminuir os tamanhos dos arquivos sem perda de informação.
3. Na janela de análise (Análise> Selecionar Pontos de Dados> Personalizado), selecione Análise e escolher as medidas necessárias (por exemplo, a densidade Integrado, densit dizery, circularidade, histograma, etc.). Descarte qualquer medições desnecessárias, desmarcando a caixa ao lado deles. Se a medição da área são necessários mm clique em Análise> Definir Escala de Medida. A ferramenta régua aparecerá automaticamente - traçar o comprimento da barra de escala e insira seu comprimento conhecido em micrômetros. O software irá então converter a medição da área em microns quadrados.
   NOTA: Se a análise do histograma é selecionada, quando as medições são registradas uma pasta adicional aparecerá (cuja localização pode ser escolhido) com 8 bits histogramas para cada área de seleção individual na micrografia, bem como o somatório de todas as seleções individuais (isto sempre aparece como Histograma-1 se várias seleções são feitas). Esta análise não pode ser executada pelo software no formato de 16 bits, mas é muito útil para a análise da distribuição de intensidades de pixel ao longo de um objecto de interesse.
4. Para a análise da intensidade de fluorescência nuclear primeiro construir uma representante "Color Range Seleção Máscara '(CRSM) para Hoechst ou DNA manchado DAPI para definir a área nuclear. Uma vez que as imagens dos canais desejados são sobrepostas, apenas a camada canal Hoechst deve ser deixado à vista, garantindo o "ícone do olho 'adjacente a ela na guia camadas é selecionada e, em seguida, camada é realçado (fica azul), enquanto que todas as outras camadas deve ser desmarcada. Certifique-se que a lista suspensa de mistura é definido de volta para 'Normal' no separador camadas.
5. Abra a caixa de diálogo Color Range (Select> Color Range) e defina a opção suspensa seleção para "cores incluídos na amostra. Com a visualização da seleção definida como 'máscara rápida' (fundo vermelho) selecionar todos os tons de azul da cor dentro dos núcleos, segurando a tecla shift (sinal '+' aparece) e clicando dentro dos núcleos usando a ferramenta conta-gotas que aparece.
   1. Se os tons indesejados são selecionados, removê-los com a tecla Alt ('─'sign aparece) e clicando emem cima delas. Manter a escala imprecisão em zero para que os tons de cor única selecionados manualmente são incluídos na mensuração e "clusters de cor localizadas 'deve ser deixada em branco.
6. Salve esta CRSM no disco rígido do computador como um programa específico (.AXT) arquivo de extração. Com outro campo aleatório de núcleos, carga, atualizar e salvar o CRSM (Select, Color Range, Load). Faça isso por pelo menos cinco campos aleatórios para garantir que as seleções nucleares são representativos.
   1. Use uma versão colorida de uma imagem em tons de cinza para a criação de uma máscara para isolar recursos, pois o olho humano é mais capaz de discriminar entre diferentes tons de cor do que entre vários tons de cinza ^26.
7. Use a CRSM nuclear para segmentar regiões nucleares para a coloração. Uma vez que os núcleos foram selecionadas Clique na imagem> Adjustment> Threshold e mova o controle deslizante totalmente para a direita, de modo que os núcleos ficar preta. Alternativamente,clique com botão direito e selecione "Fill", em seguida, escolha a opção 'Encha a: black'. Em seguida, clique em Select> Inverse e agora pressione Delete para remover todo o fundo (se a opção aparece escolher 'encher a: White'). Este binarizes essencialmente a imagem com base na sua seleção. Em seguida, carregar o plugin divisor de águas a partir da guia filtros para separar sobrepostas núcleos (Filter> imagem binária> separação característica de Bacias Hidrográficas).
   1. Se muitos núcleos são fortemente sobreposição, remova os núcleos de análise, desmarcando-los (Segure a tecla Alt e vagamente chamar ao seu redor com a ferramenta laço).
8. Na camada nuclear agora binário, vá em Select> Color Range e> Sombras, para selecionar os núcleos individuais. Segure shift Alternativa e clique em qualquer um núcleo negro. Todos os núcleos irá imediatamente ser seleccionado. Em seguida, transfira esta seleção para a camada que contém fator de transcrição nuclear coloração (por exemplo, miogenina) selecionando a camada e desmarcando tudooutras camadas. Linhas de marcha irá agora mostrar a posição dos núcleos no canal miogenina.
9. Se trabalhar com imagens pseudocolored só clicar na paleta Canais (à direita da guia camadas) e selecione apenas o canal verde (a imagem aparecerá agora cinza). Em seguida, clique em Imagem> Modo> Tons de Cinza. Um aviso aparecerá 'achatar as camadas visíveis e descartar as camadas ocultas' clique em OK, em seguida, um outro aviso vai dizer 'descartar outros canais' clique em OK novamente. Apenas uma única camada de tons de cinza selecionado núcleos será agora presente na paleta de camadas.
   1. Clique Medidas registro no Registro de Medidas para a obtenção de dados para os núcleos selecionados. Se a camada a ser analisado (coloração por exemplo miogenina) já é uma imagem crua 16 bit em tons de cinza, em seguida, basta pressionar Medidas Record.
   2. Exportação medições selecionadas como um arquivo txt para o local de sua escolha. Estes, então, podem continuar a ser processados ​​e analisados ​​em outro software de manipulação de dados packages
      NOTA: O comando Editar> step (press todos Alt, Ctrl e teclas Z simultaneamente) restaura todas as camadas anteriores, se necessário.
   3. Correta para não fundo específico de fluorescência ²⁷ para que os resultados sejam quantitativa e comparáveis ​​como medições de intensidade de fluorescência são sempre uma mistura de sinal e de fundo.
      1. Selecione a ferramenta de seleção quadrado e verificar "tamanho fixo" escolher 20 por 20 pixels (ou maior, se desejar e, dependendo da confluência de células na imagem). Mantendo mudança selecionar dez ou mais áreas de fundo espalhados por todo o campo de visão. Prima 'Record' Medidas no Registro de Medidas.
      2. Calcule a densidade média integrada (soma de todos os valores de cinza de pixel) por pixel de todas as 10 regiões de fundo selecionada (dado como o "valor médio cinzenta" no registo de medição). Multiplique a média densidade de fundo por pixel pelo número de pixels no objeto alvo ( Ou seja, cada núcleo) para dar fundo média por objeto.
      3. Subtrair fluorescência de fundo dos objetos densidade integrada original para produzir o valor corrigido fundo final. Esta abordagem representa campo potencial para variação no campo de fundo não específico de fluorescência.
         NOTA: É de extrema importância para selecionar apenas as regiões de fundo de boa fé como esta correção tem um impacto considerável sobre os valores finais. Aproximar-se usando a lupa é recomendado ao fazer seleções.
      4. Também pode ser útil para dividir o valor do fundo geral corrigido pela área do núcleo em pixels (mesmo que tomar significativo nível de cinzento / intensidade por núcleo) para minimizar qualquer influência potencial de sinal de fundo localizada nuclear que contribuem mais para a densidade integrada valor, com o aumento do tamanho nuclear (Figura 3C).

Resultados

As células miogénicas purificada e fibroblastos podem ser cultivadas em meio de diferenciação adipogênica durante três dias, seguidos de meio de nutrição adipogénica de qualquer lugar entre 7-30 dias, para avaliar o seu potencial para a adipogénese. Usando as populações de células purificadas, Oil Red O coloração em combinação com a imunomarcação para marcadores de linhagem adipog�icas e miog�icas mostrou que apenas a fracção de fibroblastos era capaz de diferenciação de adipócitos

Discussão

Nós descrevemos um procedimento de triagem immunomagentic para o enriquecimento selectivo de precursores derivadas de músculos humanos a partir de pequenas amostras de material de biópsia do músculo. Esta técnica tem sido valiosa no nosso laboratório para superar a perda de culturas derivadas de músculos humanos para fibroblastos, mas também para a compreensão do comportamento exclusivo das populações distintas de células progenitoras derivadas de músculos. Uma vez que as células miogénicas purificados po...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase  D	Roche	11088866001
Dispase II	Sigma	D4693-1G	Must be filter sterilized before use
Trypsin/EDTA	(Gibco) Invitrogen	15400-054
100 μm cell strainer	BD Biosciences	352360
Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid)	Sigma, Dorset, UK	C8919
Minisart SRP15 syringe filter (0.2 μm)	Sartorius	17573ACK	Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane
CD56 human Microbeads	Miltenyi Biotech	130-050-401	Be aware of the limited shelf life of microbeads
Anti- fibroblast Microbeads, human	Miltenyi Biotech	130-050-601
40 μm Pre-separation filters	Miltenyi Biotech	130-041-407
Large Cell Collumns	Miltenyi Biotech	130-042-202	These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here.
LS columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
MiniMacs Seperator	Miltenyi Biotech	130-042-102	This separator fits the large cell column but not the LS column.
MidiMACS	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS multistand	Miltenyi Biotech	130-042-303
BSA	Sigma		Must be filter sterilized before use
Oil Red O	Sigma	O0625
Triethyl phosphate	Sigma	538728
Whatman Paper	Sigma	Z241121-1PAK	No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering.
ProLong Gold Antifade Reagent	Molecular Probes, Invitrogen	P36930	This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence.
AxioVision	Carl Zeiss	Contact Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended	Adobe (purchased from Pugh Computers)	ADPH16982*