Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

Zusammenfassung

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Zusammenfassung

Die Reparatur und Regeneration von Skelettmuskel erfordert die Wirkung von Satellitenzellen, die die residenten Muskelstammzellen sind. Diese können von menschlichen Muskel-Biopsie-Proben mit enzymatische Verdauung und deren myogene Eigenschaften untersucht in der Kultur isoliert werden. Quantitativ sind die aus der enzymatischen Verdauung erhaltenen beiden Haupt adhärenten Zelltypen: (i) die Satellitenzellen (genannt myogenen Zellen oder Muskel-Vorläuferzellen), zunächst als CD56 ⁺ identifiziert und später als CD56 ⁺ / Desmin ⁺ Zellen und (ii) Muskel- Fibroblasten, wie CD56 identifiziert ^- und TE-7 ^+. Fibroblasten vermehren sehr effizient in der Kultur und in gemischten Zellpopulationen diese Zellen myogenen Zellen, die Kultur zu dominieren überrannt. Die Isolierung und Reinigung der verschiedenen Zelltypen von menschlichen Muskel ist somit ein wichtiger methodischer Berücksichtigung, wenn sie versuchen, um die angeborene Verhalten der beiden Zelltypen in Kultur zu untersuchen. Hier descr wirIBE ein System der Sortierung auf der Basis der sanften enzymatische Verdauung von Zellen unter Verwendung von Collagenase und Dispase durch magnetische Zellsortierung (MACS), unter dessen gibt sowohl eine hohe Reinheit (> 95% myogenen Zellen) und guter Ausbeute (~ 2,8 × 10 ⁶ ± 8,87 x 10 ⁵ Zellen / g Gewebe nach 7 Tagen in vitro) für Experimente in der Kultur. Dieser Ansatz basiert auf Inkubieren der gemischten Muskel abstammenden Zellpopulation mit magnetischen Mikrokügelchen Kügelchen mit einem Antikörper gegen CD56, konjugiert und dann vorbei Zellen wenn ein Magnetfeld beruht. CD56 ⁺ Zellen an Mikrokügelchen gebunden sind durch das Feld während CD56 behielt ^- Zellen durch die Säule ungehindert. Zellsuspensionen aus jeder Stufe des Sortierprozesses kann plattiert und kultiviert werden. Nach einer bestimmten Intervention, die Zellmorphologie und die Expression und die Lokalisierung von Proteinen einschließlich Kerntranskriptionsfaktoren unter Verwendung von Immunfluoreszenz-Markierung mit spezifischen Antikörpern und einem Bild p quantifizierenrocessing und Analysepaket.

Einleitung

Die Reparatur und Regeneration von Skelettmuskel erfordert die Wirkung von Satellitenzellen ^1, die myogene Stammzellen ^2,3. In vivo diese Zellen existieren in einem Ruhezustand reversibel zwischen Sarkolemma und Basallamina jedes myofibre befindet sich aber aktiviert zu werden, um zu proliferieren, Sicherung und zu differenzieren, wie Muskelgewebe beschädigt, repariert und regeneriert ^3. Satelliten-Zellen können aus jungen und älteren menschlichen Muskel-Biopsie-Proben mit enzymatische Verdauung ⁴ und deren myogene Eigenschaften isoliert werden anschließend in Primärkultur ⁵ untersucht werden. Die Effizienz dieses Isolierungsverfahren in Bezug auf sowohl Ausbeute und Reinheit der Zellpopulation abhängig von den verwendeten Verfahren und kann von Probe zu Probe variieren. Die aus enzymatische Verdauung erhalten zwei Haupt adhärenten Zelltypen sind die Satellitenzellen (jetzt genannt myogenen Zellen oder Muskel-Vorläuferzellen), zunächst als CD56 ⁺ / Desmin Zellen und mu identifiziertscle abgeleiteten Fibroblasten, wie CD56 identifiziert ^- und TE7 ⁺ Zellen ^5. Fibroblasten haben eine schnelle Proliferationsrate und keine irreversiblen Wachstumsstillstand und terminale Differenzierung bei der Zell-Zell-Kontakt wie myogenen Zellen zu unterziehen; damit in Mischpopulationen kann Fibroblasten myogenen Zellen überlaufen, um die Kultur zu dominieren.

Fibroblasten wurden oft als eine Irritation für Muskel Biologen angesehen, aber es ist jetzt ein wachsendes Interesse an Fibroblasten-Zellen eine Untersuchung wert in ihrem eigenen Recht, vor allem, da sie gezeigt haben, um eine kooperative Rolle mit myogenen Zellen im Muskel-Reparatur ⁶ haben . Die Isolierung und Reinigung von verschiedenen Zelltypen aus menschlichem Muskel ist damit ein wichtiger methodischen Betrachtung beim Versuch, den angeborenen Verhalten beider Zellarten in Kultur zu untersuchen. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) ist ein Verfahren, durch das Zellen für eine weitere Untersuchung nach und / oder gezählt undanalysiert. FACS wurde gezeigt, zuverlässig zu bereichern menschlichen myogenen Zellen, aber die Ausbeute an Zellen für die anschließende Kultur bisher nicht hoch ^7. Angesichts der begrenzten Replikationspotenzial der Körperzellen wie Satelliten-Zellen abgeleiteten myogenen Zellen und die ganz Armen Proliferation und Differenzierung mit Seneszenz ⁴ verbunden sind, werden sanfter Ansätze erforderlich. Einzelne Muskelfaserkulturen bieten eine andere, weniger aggressiv, bedeutet der Erhalt murine Satellitenzellen noch in den sublaminalen Nische und nach ihrer Aktivierung in der Kultur ^8,9 ansässig. Dies ist jedoch häufig nicht möglich, aus der menschlichen Muskelbiopsie Material (weil Fasern können selten von Sehne zu Sehne erhalten werden), was bedeutet, dass diese Technik möglicherweise nicht für viele Forschungslabors Interesse an einem Studium menschlichen Muskel-abgeleitete Zellen sein. Darüber hinaus liefert die Einzelfaser-Technik nur sehr begrenzt Zellzahlen.

Hier beschreiben wir ein System zur Sortierung auf der Basis des Generatortle enzymatische Verdauung von Zellen unter Verwendung von Collagenase und Dispase durch zwei aufeinanderfolgende Runden der magnetischen Zellsortierung (MACS), das sowohl eine hohe Reinheit (> 95% myogenen Zellen) und Ausbeute (~ gibt anschließend 2,8 x 10 ⁶ ± 8,87 x 10 ⁵ Zellen / g Gewebe) für Experimente in der Kultur. CD56 wird als Goldstandard Oberflächenmarker zur Identifizierung von menschlichen Satellitenzellen in situ ¹⁰ und in vitro ¹¹ und stellt die ideale Oberflächenmarker Kandidat Wulst Befestigung. Bei diesem Ansatz CD56 Antikörpern zu Eisenoxid und polysaccharidhaltigen superparamagnetische Perlen werden zu den Zellen durch eine Hochgradienten-Magnetzellseparationssäule in einem starken Magnetfeld ^12,13 angeordnet gebunden geleitet konjugiert. Die Trennsäulen sind mit einer Matrix aus ferromagnetischen Stahlwolle oder Eisenkugeln, die magnetischen Feldlinien in Richtung ihrer Fläche, die starke Magnetfeldgradienten (~ 4tesla) konzentrieren dienen gefüllte ¹⁴. In diesen Spalten auch leicht magnetisch Zellen werden angezogen und auf ihrer Oberfläche ¹⁴ adsorbiert. Unbound (CD56 ^-) Zellen durch die Säule, während CD56 ⁺ Zellen mit magnetischen Mikrokügelchen gekennzeichnet sind, bis zur Entfernung aus dem Magnetfeld ^12,15 beibehalten.

Zellsuspensionen aus jeder Stufe des Sortierprozesses kann bei der gewünschten Dichte für weitere Experimente plattiert werden. Nach einer bestimmten Intervention die zellulären Bestandteile mittels Immunzytochemie ermittelt werden, aufgenommen mit Weitfeld oder konfokaler Fluoreszenzmikroskopie und unter Verwendung eines Bildanalyseansatz, die einen schnellen objektive Messung aller markierten Zellen in einem gegebenen Bild ermöglicht quantitativ analysiert. In unserem Labor haben wir diese doppelte immun Sortierung Ansatz gefolgt von Bildanalyse ¹⁶ verwendet haben, dass CD56 zeigen ^- menschlichen Fibroblasten leicht in Fettzellen transdifferen, während myogenen Zells von satelliten Ursprungs sind sehr widerstandsfähig gegen diese adipogenen Umwandlungs ^5.

Protokoll

HINWEIS: Für die Studien in unserem Labor durchgeführt, alle Probanden gaben ihre schriftliche Einwilligung nach Aufklärung zu beteiligen und alle Experimente wurden mit britischen National Health Service Ethikkommission die Genehmigung durchgeführt (London Forschung Ethik-Kommission; Referenz: 10 / H0718 / 10) und in Übereinstimmung mit Die Human Tissue Act und Deklaration von Helsinki.

1. Erste Vorbereitung Vor der Muskelbiopsie (15 min)

1. Stellen menschlichen Skelettmuskel Wachstumsmedium. Um eine graduierte sterile 50 ml konischen Röhrchen hinzufügen 2,5 ml der Beilage Mischung, 10 ml fötalem Kälberserum, Antibiotika (Penicillin / Streptomycin) und Glutamin an die richtigen Endkonzentrationen (Tabelle 1) und füllen Sie dann das Rohr auf 50 ml mit der Skelettmuskulatur basalen Medium.
2. Setzen 15 ml des Skelettmuskels Basalmedium in einem sterilen 20 ml konischen Röhrchen und gewogen. Sobald gewogen Ort dieses Röhrchen auf Eis. Verwenden Sie diese Option, um die menschliche Muskelprobe zu erhalten.
3. In einem anderen 20-ml-Tube vorbereiten 10 ml einer Kollagenase D und Dispase II-Enzymlösung auf eine Endkonzentration von 2 mg / ml durch Auflösen Lager Aliquots dieser Enzyme im Skelettmuskel Basalmedium. Filter-Sterilisierung dieser Lösung, indem sie durch ein 0,22 um-Filter. Dieses sterile Enzymmischung im Brutschrank oder Wasserbad bei 37 ° C für 15 Minuten, um sich aufzuwärmen.
   ANMERKUNG: Diese Mischung von Enzymen geringfügig sanfter als Trypsin und besser hält die Lebensfähigkeit der Zellen ^17.
4. Beiseite eine Petrischale und ein Paar sterile Skalpelle.

2. Muskelbiopsie Verfahren (45 min-1 Stunde)

1. Vor der Rekrutierung von Teilnehmern zu erhalten volle ethischen Clearance und Verfahrenszulassung (einschließlich der relevanten Impfungen für Experimentatoren) aus allen relevanten Gremien, Ausschüssen und im Gesundheitswesen (zB ethische, institutionellen, staatlichen etc.).
2. Erstellung einer sterilen Bereich die um das Bein (beispielsweise mit sterilen chirurgischen Blatt) eind mit einer antiseptischen antibakterielles Mittel (Chlorhexidin) gründlich zu reinigen Sie den Bereich um die Biopsiestelle.
3. Betäuben des vorgeschlagenen Biopsiestelle auf der Freiwilligen Bein durch lokale Injektion von 2% Lidocain in das subkutane Gebiet über der Faszie des Musculus vastus lateralis.
4. Machen Sie eine ca. 5 mm breiten Einschnitt mit einer sterilen chirurgischen Klinge über die Haut und Bindegewebe und führen Sie die Bergström Nadelbiopsie Verfahren ¹⁸ mit zusätzlicher Absaugung.
5. Mit einer sterilen Pinzette entfernen Sie die Muskeln von den Nadellumen und tauchen in Basismedium auf Eis. Transportieren Sie das Gewebe an das Labor zur Weiterverarbeitung so schnell wie möglich, obwohl tragfähige myogenen Zellen können nach Zeiten 24 h oder mehr erreicht werden.
6. Besprechen Sie das Thema, zu reinigen und zu versiegeln die Einschnittstelle mit mehreren sterilen Klebe Haut-Verschlussstreifen und aseptisch Kleid mit einem äußeren wasserdichten Hülle.

3. Isolieren muskelderivierte Vorläufer Cells (1 h, 30 min)

1. Entfernen Sie den Schlauch der Muskel enthaltenden Probe und gewogen (stellen Sie sicher, Rohr trocken durch Abwischen mit Gewebe). Berechnen des Gewichts des Muskels Probe durch Abziehen des Gewichts des Rohrs enthaltenden Medium und Probenröhrchen, das von dem Medium allein.
2. Schwenken Sie die Lösung mehrmals, um den Muskel Blutprobe waschen. Lassen Sie die Muskeln Sediment bei Raumtemperatur für 30 bis 60 Sekunden.
   1. Entfernen fast das gesamte Volumen des Mediums aus dem Rohr, zunächst unter Verwendung einer Elektronik Pipettierhilfe oder Saugvorrichtung sondern fahren etwa 2-3 ml in der Röhre.
   2. Das Röhrchen auf eine sterile Petrischale so dass der restliche Fluid in die Muskelprobe auf die Schale zu tragen; verwenden Sie den sterilen Skalpell zu extrahieren verbleibende Muskel fragments.Rotate das Gericht, um die restliche Flüssigkeit zu mobilisieren, und entfernen Sie sie mit einem pipette.Remove sichtbare Stücke von Fett oder Bindegewebe.
3. Für Biopsien mit einem Gewicht von 100 bis 400 mg, 3 ml warmemEnzym-Lösung und unter Verwendung von sterilen Skalpellen schneiden die Muskelprobe in sehr kleine Stücke (<1-2 mm ^3).
4. Mit einem breiten Bohrung 25 ml Pipette Erstellung des Muskelfragmente und Enzymlösung und in ein steriles 10 ml konischen Röhrchen. Mit weiteren 3-5 ml Kollagenase und Dispase Enzymlösung und mit einem kleineren 10 ml Pipette gesammelt verbleibende Muskelfragmente und Stelle in dem Rohr Waschen der Petrischale. Das genaue Volumen ist nicht kritisch.
5. Stellen Sie die Durchstechflasche in einem 37 ° C Inkubator (oder Wasserbad) für 60 min mit Verreiben (10 ml Pipette) alle 15 min.
6. Nach 1 Stunde beendet enzymatische Spaltung durch Zugabe eines äquivalenten Volumens von frischem vorgewärmten Nährmedium und übergeben die Zellsuspension durch ein 100-um-Filter, um alle großen myofibre Trümmer zu entfernen. Zentrifugieren Sie die gefilterte Zelle Lösung bei 657 g für 6 Minuten bei Raumtemperatur (20-25 C).
7. Zellpellet in 5-7 ml Wachstumsmedium und der Platte in einem unbeschichteten T-25Zellkulturflasche. Übertragen diese Platte in den Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO ₂ für 7 Tage. Ändern Sie das Medium alle 48 Stunden. In diesem Stadium myogenen Zellen sehr klein sind und gerundet und nur schwer von nicht myogenen Zellen zu unterscheiden.
   1. Auf der ersten Mediumwechsel, Zentrifuge den Überstand, alle nicht-haftenden Zellen zu pelletieren. Re-suspend diese in frischem Medium und Wiederplatte.
8. Nach 7 Tagen in Kultur, zu gewährleisten, dass die meisten der myogenen (und Fibroblasten-Zellen) wurden befestigt, aber die Zellen sind noch nicht erreicht Konfluenz. Reinige die myogene Vorläufer und führen MACS nach einem Protokoll ursprünglich von in den Laboren der Gherardi und Chazaud ^19,20 entwickelt und von uns weiter ⁵ modifiziert.

4. immunomagnetische Bead Sorting der Zellen auf CD56 Expression (1,5 h)

1. Nach 7 Tagen Spülen der Zellmonolayer mit drei Börsen (die in der Regel werden 50-60% myogenen Zellen ⁵ enthalten)von Raumtemperatur-Phosphat-Pufferlösung (PBS), um alle verbleibenden nicht-adhärenten Zellen und Zelltrümmer aus der Isolation zu entfernen.
   1. Trypinize die Zellen (0,04% Trypsin in Ca ²⁺ -freiem PBS mit 0,73 mM EDTA) für 3 Minuten. Sobald Zellen abgelöst, fügen Sie 5-10 ml der Skelettmuskulatur Wachstumsmedium zu über Verdauung zu verhindern. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 657 × g für 6 Minuten bei Raumtemperatur (20-25ºC) und Resuspension in einem geeigneten Volumen von Komplettmedium für die Zählung.
   2. Über eine kleine Probe der Zellsuspension unter Verwendung des gewünschten Verfahrens (zB unter Verwendung eines Hämozytometers oder automatischen Zählvorrichtung) und berechnen Ausgangszellzahl und Lebensfähigkeit.
2. Platte einige Vertiefungen in einer Platte mit 96 Vertiefungen (oder mehr Behälter falls erforderlich) für immunzytochemische oder Durchflusszytometrie basierend Charakterisierung der Population vor der Sortierung (Fibroblasten und myogenen Zellen werden die am häufigsten vorkommende Zelltypen vorhanden sein).
3. Zur Zellsuspension add 15 ml steriler PBS zu den Zellen und Medium verdünnen. Zentrifuge die Zellen wieder und in 170 & mgr; l Raumtemperatur Sortierpuffer resuspendieren sie (1% BSA in einer MACS Spüllösung, über die durch einen 0,22 um-Filter sterilisiert).
   1. Mit 35 ul gut gemischt, um eine CD56 primären Antikörper (Klon AF12-7H3, 130-050-401) konjugiert in die Zelllösung magnetische Microbeads Pipette mischen und für 15 min bei 4 ° C unter leichtem Schütteln bei Inkubat Halbzeit.
4. Nach der Inkubation verdünnt das Zell- und Wulst-Lösung mit 10 ml von MACS Sortierpuffer und Zentrifugieren bei 657 x g für 6 min. Resuspendieren der Zellen in 1 ml des Sortierpuffers.
5. Fügen Sie die MAC-Separator (Magnet) zu den MACS hält Stand. Achten Sie beim Hinzufügen von Magneten auf dem Stand durch den starken Magnetfeld. Schlitz in der Säule und passen die Vortrennung Filter. Wird 1 ml Sortierpuffer durch die Pre-Trennfilter und Spalte für die Schmierung.
6. Immediately danach vorsichtig mischen die Zellsuspension und tropft die gesamte 1 ml durch Pre-Trennfilter und in die Spalte.
7. Dreimal mit 1 ml (oder 500 & mgr; l) des Sortierpuffers Die Säule. Sammeln der nicht-zurückgehaltenen Zellen, die durch die Säule auf die erste Art in einem sterilen 50 ml konischen Röhrchen, die eine kleine Menge an Wachstumsmedium passieren. Diese Zellen sind das zuerst sortieren CD56 ^- Fraktion und wird sehr für Bindegewebe Fibroblasten angereichert werden. Lassen Sie die Spalte austrocknen zwischen den Waschgängen.
8. Nach dem Waschen das Entfernen Sie das Vortrenn-Filter und fügen Sie 2,5 ml MACS-Puffer auf die Säule. Dann sofort den Spalten vom Magneten zu sammeln und das erste Sortier CD56 ^{+ -Fraktion} in einem separaten 50 ml konischen Röhrchen durch Niederdrücken des Kolbens in den oberen Teil der Säule.
   HINWEIS: Der Kolben passt sehr eng in den oberen Teil der Säule und kann ziemlich schwierig zu bedienen sein; Allerdings muss dies geschehen, während die Spalte noch f werdenVoll des Puffers, so Geschwindigkeit erforderlich. Vermeiden Sie Herunterdrücken des Kolbens zu hart und schnell.
9. Vor der Plattierung beurteilt die Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung von beispielsweise der Trypanblau-Assay. Bestimmen Sie den Prozentsatz der lebensfähigen Zellen von 8 x 1 mm ² Zählen Felder (beide Kammern des Hämozytometer).
   HINWEIS: Die Zellen können entweder Einzel- oder Doppel nach Abhängigkeit von der erforderlichen Reinheit sein. Wenn sorgfältig durchgeführt diese Zellen tolerieren die Doppelsortierverfahren sehr gut und die Lebensfähigkeit ist sehr hoch,> 95%. Für Doppel Sortierung, bis eine weitere Spalte gesetzt, schmieren mit 1 ml Sortierpuffer und fahren Sie mit Schritt 4.6.
   1. Wenn Bildgebung ist es, den Deckgläsern in 24-Well-Platten ²¹ angeordnet und mit Ihrer Wahl von ECM-Molekül für die Zellhaftung (zB Kollagen oder Laminin) beschichtet durchgeführt werden, Plattenzellen direkt an. Hier verwenden 0,1-0,5 mg / ml Kollagen-I (Tabelle 3).

5. Sortierung der Humein Muscle-abgeleiteten Fibroblasten unmittelbar nach der Isolierung.

1. Um Fibroblasten-Vorläuferzellen unmittelbar nach der Isolierung zu reinigen, setzen Sie das Protokoll wie oben mit folgenden Änderungen:
   1. Unmittelbar nach der Isolierung Zellen in Vollmedium und Filter einmal obwohl ein 100 um Zellsieb und dann wieder wenn auch ein 40 um Sieb. 5 ml PBS und Spin bei 657 g für 6 Minuten.
   2. Die Zellen in MACS Sortierpuffer und Inkubation in Anti-Human Fibroblast Microbeads für 15-30 min bei Raumtemperatur.
   3. Verwenden Sie den LS-Säule und die Midi-MACS-Separator (Tabelle 3) und installieren Sie die 40 & mgr; m vor dem Trennfilter.
   4. Führen einer oder zwei Arten abhängig von der erforderlichen Reinheit, Transfer der Zellen so schnell wie möglich in serumhaltigem Medium, führen eine Zählung, und die Platte bei der gewünschten Dichte

6. immunzytochemische Färbung (1 Tag und Nacht).

1. BefestigenZellen in ihren Vertiefungen durch Zugabe von einem gleichen Volumen von 8% Paraformaldehyd in eiskaltem PBS für 10 min unter leichtem Schütteln. Nach 10 Minuten absaugen Fixiermittel und zweimal mit PBS waschen.
2. Zelloberflächenantigene, Blockzellen für mindestens 1 Stunde in 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS Immunfärbung und anschließend mit den entsprechenden primären Antikörpern (Tabelle 4) zu untersuchen.
   1. Für intrazelluläre Antigene zu permeabilisieren Zellen nach Fixierung durch Zugabe von 0,2% Triton-X 100 in PBS mit 1% BSA und NaN ₃ (0,01%) für 10 min, dann blockieren und mit primären Antikörpern inkubiert. Führen alle primären Antikörper-Inkubationen über Nacht bei Raumtemperatur (oder bei 4 ° C) unter leichtem Schütteln auf einem Schüttler Plattform.
3. Entfernen ungebundener primärer Antikörper und waschen Sie die Zellen dreimal mit kaltem PBS. Inkubieren für 1 Stunde Inkubation mit artspezifischen fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpern (Tabelle 4) bei Raumtemperatur.
4. Nach Entfernen desungebundenem sekundärem Antikörper gründlich Zellen mit drei Austausch von PBS und dann mit dem fluoreszierenden DNA-Farbstoff Hoechst 33342 (1 & mgr; g / ml) für 10 min auf einer Schwingplattform gegenfärben.
5. Für die gleichzeitige Visualisierung von beiden Zelloberflächenantigenen und intrazelluläre Antigene, Sondenzellen zuerst mit primären Antikörpern gegen Oberflächenantigene werden von ihrem entsprechenden Sekundärantikörper Zelle. Als nächstes Wieder fixieren die Zellen in kaltem PFA, durchlässig, Block und Inkubation mit primärem Antikörper gegen zytoplasmatische oder nukleäre Antigene werden von ihrem entsprechenden Sekundärantikörper.
6. Nach der Färbung zu entfernen Deckgläser aus ihren Brunnen mit einer gebogenen Pinzette und spülen Sie die Rückseite des Deckglas mit destilliertem Wasser. Legen Sie das Deckzelle nach unten rutschen auf einen Tropfen Anti-verblassen Eindeckmedium ²² Satz auf einem Glasobjektträger.

7. Oil Red O Färbung in Kombination mit Immunfluoreszenzfärbung von Zellen (2 h)

1. Zeigen^5,23 - den Lipidgehalt der Zellen in 24-Well-Platten durch Färbung mit Oil Red O (([4- (Xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol 1) ausplattiert. Bereiten Sie zuerst eine Stammlösung von 0,5% (w / v) Oil Red O durch Auflösen von 500 mg Oil Red O in 60 ml 99% Triethyl-Phosphat und 40 ml destilliertem Wasser. Aufrechterhaltung dieser Lösung bei Raumtemperatur im Dunkeln bis zur Verwendung.
2. Am Tag der Anwendung, machen Sie eine 36% (w / v) Triethyl-Phosphat-Arbeitslösung, mit 12 ml Oil Red O-Stammlösung und 8 ml destilliertem Wasser. Filtern Lösung durch Filterpapier Nr 42, alle kristallisierten Oil Red O (die Bildqualität beeinträchtigt) zu entfernen.
3. Erwärmen sanft mit der Arbeitslösung in einem Wasserbad für 1 Stunde, wonach die Lösung bei 1.200 g für 6 Minuten zentrifugiert. Überstand verwerfen und wieder filtriert durch Filterpapier (Nummer 42) und in ein frisches 20-ml-Tube.
4. Nachdem die Zellen wurden fixiert, permeabilisiert und immun, entfernen Sie die PBS und fügen Sie 500 ul Oil Red O / Triethyl-phosphate Lösung zu den Vertiefungen für 60 min. Triton-X an der Zellmembran für Permeabilisierung hier verwendeten Konzentration keinen Einfluss auf zelluläre Lipidgehalt ^23.
   HINWEIS: Oil Red O wird von Wellenlängen zwischen 540 und 580 nm und damit der Texas-Red-Filter erregt verwendet werden, um Oil Red O-Emission in der Fluoreszenzmikroskopie ²³ zu erkennen. Beachten Sie, dass die Fluoreszenzemission von Oil Red O gelegentlich ins lange rote Kanal beseitigen, wenn Zellen sehr stark gefärbt (dh sehr hohen Fettgehalt).
5. Nach der Inkubation überschüssiges Oil Red O und spülen Sie die Zellen fünfmal mit 500 ul PBS. Montieren Sie die Deckgläser für Immunfärbung, wie in Kapitel 6 Erkennung Oil Red O Farbstoff sowohl Hellfeld- / Phasenkontrastmikroskopie oder durch Epifluoreszenzmikroskopie mit dem Texas-Rot-Filter beschrieben (verschieben frei, EX BP 560/40, BS FT 585, EM BP 630 / 75, Carl Zeiss).

8. Erreichen Mikroskopische Aufnahmen von Fluoreszenzmikroskopie für spätere Einalysis

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass quantitativ verglichen werden Folien mit den gleichen Lösungen gefärbt, bei gleichen Bedingungen (zB Belichtung, Kamera und Akquisitionseinstellungen etc.) fotografiert und in der gleichen Sitzung Mikroskopie erfasst. Alle nach der Übernahme der Formatierung sollte auch gleich und in strikter Übereinstimmung mit den vorgeschlagenen Leitlinien für digitale Bilder ^24.

1. Für die Bildaufnahme (Weitfeld-Mikroskopie), schalten Sie das Mikroskop und Fluoreszenzlichtquelle und lassen für die empfohlene Menge an Zeit, damit die Fluoreszenzlichtquelle, um sich aufzuwärmen und zu stabilisieren.
2. Stellen Sie den Dunkelstrom für die Kamera durch die Blockierung der Lichtweg zur Kamera; erwerben Sie ein Bild in maximaler Auflösung und nutzen diese, um anschließend aufgenommenen Bildern zu korrigieren.
3. Illuminate Immunfluoreszenzsonden durch Epifluoreszenz von Flüssigkeitslichtleiter (Schlauch aus Fluorkunststoff mit phenylmethyl Silikonöl gefüllt) ein zugend Signale durch rote visualisiert (Filtersatz 45 HQ Texas Rotverschiebung frei, grün (FITC-Filtersatz 44 Sonderschicht frei) und Blau (Filter setzen 49 DAPI Verschiebung frei) Bandpassfilter auf eine umgekehrte Epi-Fluoreszenzmikroskop (10X, 20X, 40X, planen apochromatischen Objektiven mit 0,25, 0,75, 0,95 numerischen Aperturen beziehungsweise).
4. Um zu vermeiden, Pixelsättigung finden die optimale Belichtung im linearen Bereich des Detektors für jeden Fluoreszenzmarker mit dem "Überbelichtung" Merkmal der Bildaufnahme-Software. Notieren Sie sich die standardisierte Belichtung für jede Fluoreszenzmarkierung.
5. Nehmen Sie einzelne Kanäle und speichern Sie Graustufen oder pseudocolored TIFF (Tagged Image File Format) Bild-Dateien in höchster Farbtiefe (vorzugsweise 16-Bit - 65.536 Grauwerte) von der Aufzeichnungsvorrichtung (zB gekühlte CCD (Charged Coupled Device) an das Mikroskop montiert) . Stellen Sie die Bildauflösung auf 1388 x 1040 oder höher. Achten Sie darauf, eine Maßstabsleiste oder Objekt bekannter di schließenDimensionen in dem Bild.
6. Wenn möglich Speichern von Dateien in 16-Bit-Tagged Image File Format (TIFF) und nicht im JPEG-Format zu Informationsverlust ²⁵ zu verhindern.
7. Wenn es irgendwelche Bedenken hinsichtlich der Gleichmäßigkeit der Beleuchtung (Software gebündelt mit Mikroskop kann eine automatische Korrektur dafür haben) einen "Flat-Field 'Bild der Deckglas ohne Zellen aber angefärbt und in der gleichen Weise wie experimentelle Objektträger; Dies kann verwendet werden, um für die Beleuchtung Mängel nach der Übernahme in der Bildanalyse-Software korrigieren.
8. Für die Bildaufnahme (konfokale Mikroskopie), optimieren Detektorverstärkung und Laserleistung für jedes Imaging Experiment (Sättigung zu vermeiden). Im allgemeinen ist die gemessene Fluoreszenz proportional der Laserleistungspegel. Stellen Pinholegröße auf '1 luftig ", um das beste Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen (eine verbesserte Auflösung kann bei 0,5 luftig für besonders starke Signale erreicht werden kann). Nehmen optische Schnitte in verschiedenen Höhen entlang der z-Achse durch das antibody markierten Zellen und speichern Sie eine 16-Bit-maximale Projektion für jeden Kanal für die Bildanalyse.

9. Darstellende Messungen der Fluoreszenz-markierten Nuclear Transcription Factors Mit Bildverarbeitung und -analyse-Software (5 min pro Gesichtsfeld).

1. Zugang einzelne TIFF-Bilddateien und Overlay entsprechenden Kanäle durch Klicken und Ziehen eines Bildes in ein anderes. Jeder Kanal wird dann als separate Schicht in der Ebenen-Palette angezeigt.
2. Wählen Sie aus dem Filter-Menü zum Erhöhen Schichten unter die gleichzeitig dargestellt werden können. Alternativ stellen Sie die Deckkraft der oberen Schichten zu 50%.
   HINWEIS: TIFF-Bilder können mit dem "verlustfrei" Lempel-Ziv-Welch (LZW) Datenkompression Dateigrößen ohne Informationsverlust zu senken gespeichert werden.
3. Im Analysefenster (Analysis> Wählen Sie Datenpunkte> Benutzerdefiniert), wählen Sie Analysis und wählen Sie die erforderlichen Messungen (zB Integrierte Dichte bedeuten density, Kreisförmigkeit, Histogramm etc.). Entsorgen Sie nicht mehr benötigte Messungen, indem Sie das Kontrollkästchen neben ihnen. Bei Flächenmessungen sind in um Sie auf Analyse> Messskala festlegen erforderlich. Das Lineal wird automatisch angezeigt - verfolgen Sie die Länge der Maßstabsleiste und geben Sie seine bekannter Länge in Mikrometern. Die Software wird dann wandeln Flächenmessungen in Quadratmikrometer.
   HINWEIS: Wenn die Histogrammanalyse ausgewählt wird, wenn die Messungen aufgezeichnet werden zusätzlich Ordner erscheint (die Position davon kann gewählt werden) mit 8-Bit-Histogramme für jeden einzelnen Auswahlbereich im Schliffbild als auch die Summe aller Einzelauswahl (dies erscheint immer als Histogramm-1, wenn mehrere Optionen gewählt wird). Diese Analyse kann durch die Software nicht in 16-Bit-Format durchgeführt werden, sondern ist sehr nützlich zur Untersuchung der Verteilung von Pixelintensitäten ganzen eines Objekts von Interesse.
4. Für die Analyse von Kernfluoreszenzintensität einen Vertre ersten konstruierentreter "Farbbereich Auswahl Maske '(CRSM) für Hoechst und DAPI gefärbten DNA Kernbereich zu definieren. Sobald die gewünschte Kanal Bilder überlagert sind, sollte nur der Hoechst Kanalschicht im Hinblick auf, indem sie die "Augensymbol" neben ihr auf der Registerkarte Schichten links ausgewählt werden und dann Schicht wird markiert (wird blau), während alle anderen Schichten sollte abgewählt. Achten Sie darauf, die Vermischung Dropdown wieder auf "Normal" in der Registerkarte Schichten gesetzt.
5. Öffnen Sie das Dialogfeld Farbauswahl (Auswahl> Farbbereich) und stellen Sie die Auswahlmöglichkeit Dropdown-Liste "Aufgenommene Farben". Mit der Auswahl Vorschau zu "quick mask" (roter Hintergrund) eingestellt wählen Sie alle Blautöne in den Kernen, indem Sie die Shift-Taste ("+" Zeichen erscheint), und klicken Sie innerhalb der Kerne mit dem Pipette-Werkzeug, das erscheint.
   1. Wenn unerwünschte Töne ausgewählt sind, entfernen Sie sie, indem Sie die Alt-Taste ('─'sign erscheint) und klickenauf sie. Pflegen Sie die Unschärfe Skalenendwert bei Null, so dass nur manuell ausgewählt Farbtöne sind in die Bewertung einbezogen und "Lokalisierte Farbgruppen" sollte nicht gegengesteuert werden.
6. Speichern Sie diese CRSM auf die Festplatte des Computers als-programmspezifischen Extraktdatei (AXT-Datei). Mit einem weiteren Zufallsfeld von Kernen, Last, aktualisieren und speichern Sie die CRSM (Select, Farbbereich, Load). Tun Sie dies für mindestens fünf Zufallsfelder, um sicherzustellen, dass die Kernauswahl repräsentativ sind.
   1. Verwenden Sie eine farbige Version von einem Graustufenbild für die Schaffung einer Maske, um Merkmale zu isolieren, weil das menschliche Auge ist besser in der Lage, zwischen verschiedenen Schattierungen der Farbe unterscheiden als zwischen verschiedenen Grautönen, ^26.
7. Verwenden Sie die Kern CRSM zu segmentieren Kernregionen für die Färbung. Wenn Kerne haben auf Bild> Einstellung> Schwellenwert ausgewählt, klicken Sie und bewegen Sie den Schieberegler ganz nach rechts, so dass die Kerne schwarz. Alternativrechten Maustaste und wählen Sie "Füllen" und wählen Sie "füllen zu: schwarz. Klicken Sie dann auf Select> Inverse und jetzt drücken Sie Löschen, um alle Hintergrund zu entfernen (wenn die Option erscheint wählen Sie "zu füllen, um: Weiß). Dieser digitalisiert im Wesentlichen die auf der Grundlage Ihrer Auswahl Bild. Dann laden Sie die Wasserscheide-Plugin auf der Registerkarte Filter können sich überlappenden Kerne (Filter> Binary Bild> Watershed Funktion Trennung) zu trennen.
   1. Wenn viele Kerne sind stark überlappenden, entfernen Sie die Kerne von der Analyse durch Deaktivieren von ihnen (Halten Sie die Alt-Taste und locker um sich zu ziehen mit dem Lasso-Werkzeug).
8. Auf der nun binäre Kernschicht, gehen Sie zu wählen> Farbbereich und> Schatten, einzelne Kerne zu wählen. Alternative Halteschicht und klicken Sie in einem schwarzen Kern. Alle Kerne werden sofort gewählt werden. Dann übertragen Sie diese Auswahl, um die Schicht, die nukleare Transkriptionsfaktor-Färbung (zB Myogenin), indem Sie diese Schicht und deaktivieren alleanderen Schichten. Marschlinien wird nun die Position der Kerne im Myogenin Kanal.
9. Wenn die Arbeit mit pseudocolored Bilder klicken nur auf der Kanäle-Palette (auf der rechten Seite der Registerkarte Schichten), und wählen Sie nur den grünen Kanal (das Bild wird nun grau angezeigt). Klicken Sie dann auf Bild> Modus> Graustufen. Es erscheint eine Warnung "Flatten sichtbaren Ebenen und entsorgen verborgenen Schichten" klicken Sie auf OK, dann noch eine Warnung sagen verwerfen andere Kanäle "klicken Sie auf OK erneut. Nur eine einzige Schicht aus Grau ausgewählten Kerne wird nun in der Ebenen-Palette vorhanden sein.
   1. Klicken Sie auf Aufnahme Messungen im Messprotokoll, um Daten für die ausgewählten Kerne zu erhalten. Wenn der zu analysierenden Schicht (zB Myogenin Färbung) ist bereits ein rohes 16-Bit-Graustufenbild und drücken Sie dann einfach Messungen aufzeichnen.
   2. Export ausgewählten Messungen als TXT-Datei in den Ordner Ihrer Wahl. Diese können dann weiterverarbeitet und in andere Datenverarbeitung Software p analysiert werdenackages
      HINWEIS: Das Bearbeiten> Rückschritt-Befehl (Presse alle Alt, Ctrl und Z-Tasten gleichzeitig) setzt alle vorhergehenden Schichten, falls erforderlich.
   3. Korrigieren für unspezifische Hintergrundfluoreszenz ²⁷ Ergebnisse quantitativ und vergleichbar Messungen der Fluoreszenzintensität werden immer eine Mischung von Signal und Hintergrund.
      1. Wählen Sie das quadratische Auswahlwerkzeug und prüfen "feste Größe" wählen, 20 mal 20 Pixeln (oder größer auf Wunsch und je nach der Konfluenz der Zellen im Bild). Halten Sie Shift auszuwählen zehn oder mehr Hintergrundbereiche in der gesamten Sichtfeld verteilt. Drücken Sie "Messungen aufzeichnen" im Messprotokoll.
      2. Berechnen Sie die durchschnittliche integrierte Dichte (Summe aller Pixelgrauwerte) pro Pixel aller 10 ausgewählten Hintergrundbereichen (als "mittlerer Grauwert" im Messprotokoll angegeben). Multiplizieren die durchschnittliche Hintergrunddichte pro Pixel durch die Anzahl der Pixel in dem Zielobjekt ( Dh jeder Kern) um durchschnittlich Hintergrund pro Objekt geben.
      3. Subtrahieren der Hintergrundfluoreszenz von den Objekten original integrierten Dichte, um die endgültige korrigierte Hintergrundwert zu erhalten. Dieser Ansatz macht Potentialfeld zu Feldvariation in unspezifische Hintergrundfluoreszenz.
         HINWEIS: Es ist von größter Bedeutung für nur bona fide Hintergrundbereichen zu wählen, da diese Korrektur hat einen erheblichen Einfluss auf die endgültigen Werte. Vergrößern mit Hilfe der Lupe wird empfohlen, beim Auswählen.
      4. Es kann auch nützlich sein, die allgemeine Hintergrundkorrekturwert durch die Fläche des Kerns in Pixel (wie unter mittleren Graupegel / Intensität pro Kern), um einen möglichen Einfluß des Atom lokalisierten Hintergrundsignals, die mehr auf die integrierte Dichte beitragen minimieren aufzuteilen Wert mit zunehmender Kerngröße (3C).

Ergebnisse

Gereinigtes myogenen Zellen und Fibroblasten in adipogene Differenzierungsmedium für drei Tage, gefolgt von adipogene Nährmedium von überall zwischen 7-30 Tage, um ihr Potenzial für die Adipogenese beurteilen kultiviert werden. Verwendung der gereinigten Zellpopulationen, Oil Red-O-Färbung in Kombination mit Immunfärbung für adipogenen und myogenen Marker zeigte, daß nur die Fibroblasten-Anteil geeignet adipogene Differenzierung (Abbildung 2) war. Die massive Anhäufung von Fett durch die Fibrob...

Diskussion

Wir haben eine immunomagentic Sortierverfahren für die selektive Anreicherung von menschlichen Muskel-abgeleitete Vorläufer aus kleinen Proben der Muskelbiopsie Material beschrieben. Diese Technik hat sich für die Überwindung der Verlust des menschlichen Muskel-abgeleitete Kulturen auf Fibroblasten von unschätzbarem Wert in unserem Labor, sondern auch für das Verständnis der einzigartigen Verhalten unterschiedliche Populationen von Muskel-Vorläuferzellen abgeleitet. Nachdem gereinigtes myogenen Zellen können Ve...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase  D	Roche	11088866001
Dispase II	Sigma	D4693-1G	Must be filter sterilized before use
Trypsin/EDTA	(Gibco) Invitrogen	15400-054
100 μm cell strainer	BD Biosciences	352360
Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid)	Sigma, Dorset, UK	C8919
Minisart SRP15 syringe filter (0.2 μm)	Sartorius	17573ACK	Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane
CD56 human Microbeads	Miltenyi Biotech	130-050-401	Be aware of the limited shelf life of microbeads
Anti- fibroblast Microbeads, human	Miltenyi Biotech	130-050-601
40 μm Pre-separation filters	Miltenyi Biotech	130-041-407
Large Cell Collumns	Miltenyi Biotech	130-042-202	These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here.
LS columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
MiniMacs Seperator	Miltenyi Biotech	130-042-102	This separator fits the large cell column but not the LS column.
MidiMACS	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS multistand	Miltenyi Biotech	130-042-303
BSA	Sigma		Must be filter sterilized before use
Oil Red O	Sigma	O0625
Triethyl phosphate	Sigma	538728
Whatman Paper	Sigma	Z241121-1PAK	No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering.
ProLong Gold Antifade Reagent	Molecular Probes, Invitrogen	P36930	This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence.
AxioVision	Carl Zeiss	Contact Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended	Adobe (purchased from Pugh Computers)	ADPH16982*