Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

Resumen

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Resumen

La reparación y la regeneración del músculo esquelético requiere la acción de las células satélite, que son las células madre de músculo residente. Estos se pueden aislar a partir de muestras de biopsia de músculo humano usando digestión enzimática y sus propiedades miogénicas estudiados en cultivo. Cuantitativamente, los dos principales tipos de células adherentes obtenidas a partir de la digestión enzimática son: (i) las células satélite (denominadas células miogénicas o células precursoras del músculo), identificado inicialmente como CD56 ⁺ y más tarde como desmina ⁺ / CD56 ⁺ células y (ii) músculo- fibroblastos derivados, identificadas como CD56 ^- y TE-7 ^+. Los fibroblastos proliferan de manera muy eficiente en la cultura y en las poblaciones de células mixtas estas células pueden invadir células miogénicas de dominar la cultura. El aislamiento y purificación de diferentes tipos de células de músculo humano es por lo tanto una consideración metodológica importante cuando se trata de investigar el comportamiento innato de cualquiera de los tipos de células en cultivo. Aquí DescrIbe un sistema de clasificación basada en la digestión enzimática suave de las células utilizando colagenasa y dispasa seguido por clasificación magnética de células activadas (MACS), que da a la vez una alta pureza (> 95% de células miogénicas) y buen rendimiento (~ 2,8 x 10 ⁶ ± 8,87 x 10 ⁵ células / g de tejido después de 7 días in vitro) de experimentación en la cultura. Este enfoque se basa en la incubación de la población de células derivadas de músculo mezclado con microperlas perlas magnéticas conjugadas con un anticuerpo contra CD56 y luego pasar las células a través de un campo magnético. Células CD56 ⁺ unidos a microperlas son retenidos por el campo mientras que CD56 ^- células pasan sin impedimentos a través de la columna. Las suspensiones celulares de cualquier etapa del proceso de clasificación pueden ser en placas y se cultivaron. A raíz de una intervención dada, la morfología celular, y la expresión y localización de proteínas, incluyendo factores de transcripción nuclear puede cuantificarse utilizando el etiquetado de inmunofluorescencia con anticuerpos específicos y una imagen Processing y el paquete de análisis.

Introducción

La reparación y la regeneración del músculo esquelético requiere la acción de las células satélite ^1, las células madre miogénicas ^2,3. In vivo estas células existen en un estado quiescente reversible situado entre el sarcolema y la lámina basal de cada miofibrillas, pero se activan para proliferar, fusibles y diferenciarse como el tejido muscular están dañados, reparar y regenerar ^3. Las células satélite se pueden aislar a partir de muestras de biopsia de músculo humano joven y de edad avanzada utilizando digestión enzimática ⁴ y sus propiedades miogénicos posteriormente se pueden estudiar en la cultura primaria ^5. La eficiencia de este proceso de aislamiento con respecto a tanto el rendimiento y la pureza de la población de células depende de los métodos utilizados y puede variar de muestra a muestra. Los dos principales tipos de células adherentes obtenidas a partir de la digestión enzimática son las células satélite (células miogénicas ahora denominados o células precursoras de músculo), identificados inicialmente como células CD56 ⁺ / desmina, y mufibroblastos SCLE derivados, identificadas como CD56 ^- y TE7 ^{+ 5} células. Los fibroblastos tienen una tasa de proliferación rápida y no se someten a la detención del crecimiento y la diferenciación terminal irreversible al contacto célula-célula, como las células miogénicas; por lo tanto en poblaciones mixtas, los fibroblastos pueden invadir células miogénicas a dominar la cultura.

Los fibroblastos a menudo se han visto como una irritación para los biólogos musculares, sin embargo, ahora existe un creciente interés en los fibroblastos como células dignos de estudio por derecho propio, en particular, ya que han demostrado tener un papel cooperativo con células miogénicas durante la reparación del músculo ⁶ . El aislamiento y purificación de diferentes tipos de células de músculo humano es por lo tanto una consideración metodológica importante cuando se trata de investigar el comportamiento innato de ambos tipos de células en cultivo. Activada por fluorescencia de células (FACS) es un método por el cual las células pueden ser ordenados para el estudio adicional y / o se contaron y seanalizada. FACS se ha demostrado para enriquecer de forma fiable células miogénicas humanos, pero el rendimiento de las células para el cultivo posterior hasta el momento no ha sido alto ^7. Dado el potencial de replicación limitado de células somáticas, tales como células derivadas de células satélite miogénicas y muy pobre la proliferación y diferenciación asociados con la senescencia ^4, se requieren métodos más suaves. Culturas individuales de fibras musculares ofrecen otra, menos agresivo, los medios de obtención de células satélite murinos todavía residente en su nicho sublaminal y después de su activación en la cultura ^8,9. Sin embargo, esto a menudo no es posible a partir del material de biopsia de músculo humano (porque las fibras rara vez se pueden obtener de tendón a tendón) lo que significa que esta técnica puede no ser accesible a muchos laboratorios de investigación interesados ​​en el estudio de células derivadas de músculo humanos. Por otra parte, la técnica de la fibra individual sólo proporciona el número de células muy limitadas.

Aquí se describe un sistema de clasificación basada en el gendigestión enzimática TLE de células utilizando colagenasa y dispasa seguido por dos rondas sucesivas de clasificación magnética de células activadas (MACS), que da a la vez una alta pureza (> 95% de células miogénicas) y rendimiento (~ 2,8 x 10 ⁶ ± 8,87 x 10 ⁵ células / g de tejido) para experimentos en la cultura. CD56 se considera el marcador de superficie estándar de oro para la identificación de las células satélite humanos in situ e in vitro ^{10 11} y proporciona el candidato ideal marcador de superficie para la fijación del talón. En este enfoque anticuerpos CD56 conjugados con óxido de hierro y perlas superparamagnéticas que contiene polisacárido se une a las células y pasa a través de una columna de separación celular magnética de alto gradiente colocado en un fuerte campo magnético ^12,13. Las columnas de separación se llenan con una matriz de lana de acero o de hierro esferas ferromagnéticas que sirven para enfocar líneas de campo magnético hacia su superficie generar fuertes gradientes de campo magnético (~ 4tesla) ¹⁴. En estas columnas incluso células ligeramente magnéticos son atraídos y absorbidos a su superficie ^14. Sin consolidar (CD56 ^-) las células pasan a través de la columna mientras que las células CD56 ⁺ etiquetados con microperlas magnéticas se conservan hasta la retirada del campo magnético ^12,15.

Las suspensiones celulares de cualquier etapa del proceso de clasificación se pueden colocaron en placas a la densidad deseada para la experimentación adicional. A raíz de una intervención dada los constituyentes celulares pueden identificarse utilizando inmunocitoquímica, utilizando imágenes de campo amplio o microscopía de fluorescencia confocal y analizados cuantitativamente usando un enfoque de análisis de imágenes que permite una rápida medición objetiva de todas las células marcadas en cualquier imagen dada. En nuestro laboratorio hemos utilizado este enfoque doble clasificación inmunomagnética seguido por análisis de imagen ¹⁶ para demostrar que CD56 ^- fibroblastos humanos transdifferentiate fácilmente en los adipocitos, mientras que las células myogenics de origen satélite son altamente resistentes a esta conversión adipogenic ^5.

Protocolo

NOTA: Para los estudios realizados en nuestro laboratorio de todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito para participar y todos los experimentos se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de Ética de Servicio Nacional de Salud del Reino Unido (Comité Ético de Investigación Londres; referencia: 10 / H0718 / 10) y de acuerdo con la Ley de Tejidos Humanos y la Declaración de Helsinki.

1. Preparación inicial antes de la biopsia muscular (15 min)

1. Hacer medio de crecimiento de músculo esquelético humano. Para un tubo cónico de 50 ml estéril graduado añadir 2,5 ml de la mezcla de suplemento, 10 ml de suero de ternero fetal, antibióticos (penicilina / estreptomicina) y glutamina a las concentraciones finales correctas (Tabla 1) y luego llenar el tubo hasta 50 ml con basal del músculo esquelético medio.
2. Poner 15 ml de medio basal del músculo esquelético en un tubo cónico de 20 ml estériles y pesarlo. Una vez pesada lugar este tubo en hielo. Utilice esta opción para recibir la muestra de músculo humano.
3. En otro tubo de 20 ml preparar 10 ml de una solución de enzima colagenasa D y dispasa II a una concentración final de 2 mg / ml de cada uno por disolución de partes alícuotas del stock de estas enzimas en el medio basal del músculo esquelético. Filtros de esterilizar esta solución pasándola a través de un filtro de 0,22 micras. Coloque esta mezcla de enzimas estéril en el baño incubadora o agua a 37 ° C durante 15 minutos para calentar.
   NOTA: Esta mezcla de enzimas es ligeramente más suave que la tripsina y mejor mantiene la viabilidad celular ^17.
4. Ponga a un lado una placa de Petri y un par de escalpelos estériles.

2. Músculo procedimiento de biopsia (45 min-1 h)

1. Antes de la contratación de los participantes, obtener la aprobación ética completa y aprobación de procedimientos (incluidas las vacunas pertinentes para experimentadores) de todos los órganos de gobierno correspondientes, comités y profesionales de la salud (por ejemplo, ético, institucional, etc. gubernamental).
2. Crear un campo estéril alrededor de la pierna de la (por ejemplo, con sábanas quirúrgicas estériles) unad limpiar completamente el área alrededor del sitio de la biopsia con un agente antibacteriano antiséptico (clorhexidina).
3. Anestesiar el sitio de la biopsia propuesto en la pierna del voluntario por inyección local de lidocaína al 2% en la región subcutánea que recubre la fascia del músculo vasto lateral.
4. Hacer una incisión amplia ~ 5 mm utilizando una hoja de bisturí estéril a través de la piel y la fascia y realizar el procedimiento de biopsia con aguja Bergström ¹⁸ con succión adicional.
5. El uso de pinzas estériles eliminar el músculo desde el lumen de la aguja y sumergirse en un medio basal en hielo. Transporte el tejido al laboratorio para su procesamiento posterior a la brevedad posible, aunque las células miogénicas viables se pueden obtener después de períodos de 24 hr o más.
6. Dé cuenta de la asignatura, limpiar y sellar el sitio de la incisión con múltiples tiras de piel de cierre adhesivas estériles y vestido de forma aséptica con una cubierta impermeable externa.

3. Aislar derivadas de músculo Precursor CeLLS (1 hora, 30 min)

1. Retire el tubo que contiene la muestra de músculo y pesarlo (asegúrese de que el tubo esté seca frotando con tejido). Calcular el peso de la muestra de músculo restando el peso del tubo que contiene el medio y la muestra del tubo que contiene medio solo.
2. Agitar la solución varias veces para lavar la muestra de músculo de la sangre. Deje que el sedimento muscular a temperatura ambiente durante 30 a 60 segundos.
   1. Retire casi todo el volumen de medio del tubo, primero utilizando un auxiliar de pipeteado electrónico o aspirador pero dejar aproximadamente 2-3 ml en el tubo.
   2. Invertir el tubo a una placa de Petri estéril permitiendo que el fluido restante para llevar a la muestra de músculo en el plato; utilizar el bisturí estéril para extraer cualquier músculo restante fragments.Rotate el plato para movilizar el líquido restante y retírela con un pipette.Remove cualquier fragmentos visibles de grasa o tejido conjuntivo.
3. Para biopsias que pesan 100-400 mg, añadir 3 ml de tibiasolución de enzima y el uso de escalpelos estériles cortar la muestra de músculo en trozos muy pequeños (<1-2 mm ^3).
4. Utilizando una amplia ml pipeta calibre 25 elaborar la solución fragmentos musculares y enzima y transferir a un tubo cónico de 10 ml estéril. Lavar la placa de Petri con un mayor 3-5 ml de colagenasa y dispasa solución de enzima y el uso de una más pequeña pipeta de 10 ml recoger los fragmentos musculares restantes y el lugar en el tubo. El volumen exacto no es crítico.
5. Colocar el vial en una incubadora a 37ºC (o baño de agua) durante 60 min con trituración (10 ml pipeta) cada 15 min.
6. Después de 1 hr terminar la disociación enzimática mediante la adición de un volumen equivalente de medio de crecimiento pre-calentado fresco y pasar la suspensión celular a través de un filtro de 100 micras para eliminar cualquier residuos grandes de miofibrillas. Centrifugar la solución de células filtrada a 657 xg durante 6 minutos a temperatura ambiente (20-25 ° C).
7. Resuspender el sedimento celular en 5-7 ml de medio de crecimiento y la placa sin recubrir en un T-25matraz de cultivo tisular. Transfiera esta placa a la incubadora a 37 ° C con 5% de CO ₂ durante 7 días. Cambiar el medio cada 48 horas. En esta etapa las células miogénicas son muy pequeñas y redondeadas y difícil de discernir a partir de células no miogénicas.
   1. En el primer cambio de medio, centrifugar el sobrenadante para sedimentar las células no adherentes. Vuelva a suspender estos en medio fresco y re-placa.
8. Después de 7 días en cultivo, asegúrese de que la mayoría de las células miogénicas (y fibroblastos) han unido pero las células aún no han llegado a la confluencia. Purificar los precursores miogénicos y realizar MACS acuerdo con un protocolo desarrollado originalmente por en los laboratorios de Gherardi y Chazaud ^19,20 y aún más modificada por nosotros ^5.

4. inmunomagnético Bead Clasificación de células basada en la expresión CD56 (1,5 horas)

1. Después de 7 días de enjuague de la monocapa celular (que por lo general van a contener 50-60% de células miogénicas ⁵⁾ con tres bolsasde solución tampón de fosfato temperatura ambiente (PBS) para eliminar cualquier resto de células no adherentes y los restos del aislamiento.
   1. Trypinize las células (0,04% de tripsina en PBS libre de Ca ^{2 +} con EDTA 0,73 mM) durante 3 minutos. Una vez que las células se han desprendido, añadir 5.10 ml de medio de crecimiento del músculo esquelético para evitar el exceso de digestión. Sedimentar las células por centrifugación a 657 xg durante 6 min a temperatura ambiente (20-25 ° C) y se resuspende en un volumen apropiado de medio completo para el recuento.
   2. Contar una pequeña muestra de la suspensión de células usando el método deseado (por ejemplo, usando un hemocitómetro o un dispositivo de recuento automatizado) y calcular a partir del número de células y la viabilidad.
2. Placa unos pocillos en una placa de 96 pocillos (o mayor buque, si es necesario) para inmunocitoquímica o flujo caracterización basada en citometría de la población antes de la clasificación (fibroblastos y células miogénicas serán los más abundantes tipos presentes células).
3. Para el anuncio de suspensión celulard 15 ml de PBS estéril para diluir las células y medio. Centrifugar las células de nuevo y resuspender en 170 l de tampón de clasificación temperatura ambiente (1% de BSA en una solución de lavado MACS, esteriliza por medio de pasar a través de un filtro de 0,22 micras).
   1. Añadir 35 l de microperlas magnéticas bien mezclados conjugados con un anticuerpo primario CD56 (clon AF12-7H3, 130-050-401) en la solución de células, pipeta para mezclar y dejar incubar durante 15 min a 4 ° C con agitación suave en el punto medio.
4. Después de la incubación, se diluye la solución de células y perlas con 10 ml de tampón MACS de clasificación y centrifugar a 657 xg durante 6 min. Resuspender las células en 1 ml de tampón de clasificación.
5. Añadir el separador de MACs (imán) a las MACS sostienen stand. Tenga cuidado al añadir imán al soporte debido al campo magnético fuerte. Ranura en la columna y se ajusta el filtro de separación previa. Pipeta 1 ml de tampón de clasificación a través del filtro de pre-separación y columna para la lubricación.
6. ImmediatEly después de esto, mezclar suavemente la suspensión celular y gotear toda la 1 ml a través del filtro de pre-separación y en la columna.
7. Lavar la columna tres veces con 1 ml (o 500 l) de tampón de clasificación. Recoger las células no retenidas que pasan a través de la columna en la primera clase en un tubo cónico de 50 ml estéril que contiene una pequeña cantidad de medio de crecimiento. Estas células son el primer tipo CD56 ^- fracción y serán altamente enriquecido para los fibroblastos del tejido conectivo. No deje que la columna se seque entre lavados.
8. Después se lava el quitar el filtro de separación y añadir 2,5 ml de tampón MACS a la columna. A continuación, retire inmediatamente la columna del imán y recoger la primera especie CD56 ⁺ fracción en un tubo cónico de 50 ml separado presionando el émbolo en la parte superior de la columna.
   NOTA: El émbolo encaja muy bien en la parte superior de la columna y puede ser bastante complicado para operar; sin embargo, esto se debe hacer mientras que la columna sigue siendo full del buffer, por lo que se requiere velocidad. Evite apretar el émbolo demasiado duro y rápido.
9. Antes de chapado evaluar la viabilidad de las células, utilizando, por ejemplo, el ensayo de azul de tripano. Determinar el porcentaje de células viables de los campos 8 x 1 mm ² de conteo (las dos cámaras del hemocitómetro).
   NOTA: Las células puede ser simple o doble ordenados dependiendo de la pureza requerida. Si se hace con cuidado estas células toleran el procedimiento de doble clasificación muy bien y la viabilidad es muy alta> 95%. Por doble clasificación, establecer otra columna, lubrique con 1 ml de tampón de clasificación y proceda desde el paso 4.6.
   1. Si la imagen se va a realizar, células de la placa directamente sobre cubreobjetos de vidrio situadas en placas de 24 pocillos recubiertas con ²¹ y su elección de la molécula de ECM para la fijación celular (por ejemplo, colágeno o laminina). Aquí, utilizar 0,1-0,5 mg / ml de colágeno-I (Tabla 3).

5. Clasificación de Humun fibroblastos derivadas de músculo Inmediatamente después del aislamiento.

1. Para purificar progenitores fibroblastos inmediatamente después del aislamiento, emplear el protocolo que el anterior con las siguientes modificaciones:
   1. Inmediatamente después de volver a suspender las células aislamiento en medio completo y el filtro una vez a través de un colador de células 100 micras y luego de nuevo a través de un filtro de 40 micras. Añadir 5 ml de PBS y centrifugado a 657 g durante 6 min.
   2. Resuspender las células en tampón MACS de clasificación y se incuban en microperlas de fibroblastos anti-humanos durante 15-30 minutos a temperatura ambiente.
   3. Utilice la columna de la LS y el separador de Midi-MACS (Tabla 3) e instalar el filtro de separación de 40 micras.
   4. Realizar uno o dos tipos dependiendo de la pureza requerida, transferir las células tan pronto como sea posible en medio que contiene suero, realizar un recuento, y depositarse en la densidad deseada

6. La tinción inmunocitoquímica (1 día y la noche).

1. Arreglarcélulas en sus pozos por la adición de un volumen igual de 8% de paraformaldehído en PBS enfriado con hielo durante 10 min con agitación suave. Después de 10 minutos aspirado fijador y lavar dos veces con PBS.
2. Para inmunotinción antígenos de superficie celular, células de bloques durante al menos 1 h en 1% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS y luego la sonda con los anticuerpos primarios pertinentes (Tabla 4).
   1. Para antígenos intracelulares, permeabilizar las células después de la fijación mediante la adición de 0,2% Triton X-100 en PBS con 1% de BSA y NaN ₃ (0,01%) durante 10 min, entonces el bloque y se incuba con anticuerpos primarios. Realice todas las incubaciones de anticuerpos primarios noche a temperatura ambiente (o a 4 ° C) con agitación suave en una plataforma oscilante.
3. Eliminar el anticuerpo primario no unido y lavar las células tres veces con PBS frío. Incubar durante 1 hora de incubación con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia específicos de especie (Tabla 4) a temperatura ambiente.
4. Después de la eliminación deanticuerpos secundarios no unidos, enjuagar las células con tres intercambios de PBS y luego contratinción con el tinte de ADN fluorescente Hoechst 33342 (1 mg / ml) solución durante 10 min en una plataforma oscilante.
5. Para la visualización simultánea de ambos antígenos de superficie celular y antígenos intracelulares, las células de sonda primero con anticuerpos primarios a antígenos de la superficie celular seguido por sus anticuerpos secundarios apropiados. A continuación, volver a fijar las células en frío PFA, permeabilizar, bloqueo y se incuba con anticuerpos primarios contra antígenos citoplasmáticos o nucleares seguidos por sus anticuerpos secundarios apropiados.
6. Después de la tinción, retire cubreobjetos de sus pozos utilizando pinzas curvas y enjuagar la parte posterior del cubreobjetos usando agua destilada. Coloque la celda cubreobjetos deslice hacia abajo sobre una gota de medio de montaje ²² set en un portaobjetos de vidrio anti-fade.

7. Oil Red O tinción en combinación con inmunofluorescencia tinción de las células (2 horas)

1. Revelarel contenido de lípidos de las células plateado en placas de 24 pocillos por tinción con Oil Red O (1 - ([4- (Xylylazo) xililo] azo) -2-naftol) ^5,23. En primer lugar preparar una solución madre de 0,5% (w / v) Oil Red O disolviendo 500 mg de Oil Red O en 60 ml de 99% de trietilo-fosfato y 40 ml de agua destilada. Mantener esta solución a temperatura ambiente en la oscuridad hasta su uso.
2. En el día de uso, hacer un 36% (w / v) de solución de trietilo-fosfato de trabajo, que contiene 12 ml de solución madre de Oil Red O y 8 ml de agua destilada. Filtrar esta solución a través de papel de filtro número 42 para eliminar todo cristalizado Oil Red O (que perjudica la calidad de la imagen).
3. Calentar suavemente esta solución de trabajo en un baño de agua durante 1 hr después de lo cual la solución se centrifugó a 1.200 xg durante 6 min. Eliminar el sobrenadante y filtrar de nuevo a través de papel de filtro (número 42) y transferir a un tubo de 20 ml fresco.
4. Después las células se han fijado, permeabilised y inmunoteñidas, retire el PBS y añadir 500 l de Oil Red O / Trietilo-phossolución de fosfato en los pocillos durante 60 minutos. Triton-X a la concentración utilizada aquí para la permeabilización de la membrana celular no afecta el contenido de lípidos celulares ^23.
   NOTA: Oil Red O se excita por longitudes de onda entre 540 y 580 nm y por lo tanto el filtro de Texas-Red se puede utilizar para detectar Oil Red O emisión en microscopía de fluorescencia ^23. Tenga en cuenta que la emisión de fluorescencia de Oil Red O puede ocasionalmente fugas en el canal rojo lejano si las células están muy fuertemente teñidas (es decir, muy alto contenido de grasa).
5. Después de la incubación, retirar el exceso de aceite rojo O y aclarar las células cinco veces con 500 l de PBS. Montar los cubreobjetos como para inmunotinción como se describe en la sección 6. Detectar Oil Red O tinte por tanto campo claro / fase microscopía de contraste o por microscopía de epifluorescencia utilizando el filtro rojo de Texas (desplazamiento libre, EX BP 560/40, BS FT 585, EM BP 630 / 75, Carl Zeiss).

8. Obtención de micrografías de microscopía de fluorescencia para la posterior Unálisis

NOTA: Asegúrese de que se desliza de compararse cuantitativamente se tiñen con las mismas soluciones, fotografiado en idénticas condiciones (por ejemplo, la exposición, la cámara y los ajustes de adquisición, etc.) y capturado en la misma sesión de la microscopía. Todo el formato post-adquisición también debe ser idénticas y estar en estricta conformidad con las directrices sugeridas para las imágenes digitales ^24.

1. Para la adquisición de imágenes (microscopía widefield), encienda la fuente de luz del microscopio y la fluorescencia y dejar para la cantidad recomendada de tiempo para permitir que la fuente de luz de fluorescencia se caliente y se estabilice.
2. Ajuste la corriente oscura de la cámara mediante el bloqueo de la trayectoria de la luz a la cámara; adquirir una imagen a máxima resolución y usar esto para corregir las imágenes adquiridas posteriormente.
3. Ilumine sondas de inmunofluorescencia por epifluorescencia entregado por las guías de luz líquidos (tubo flexible de fluoroplástico lleno de aceite de silicona fenilmetil) unnd señales visualizadas a través roja (filtro ajustado 45 HQ Tejas turno libre de rojo, verde (filtro ajustado 44 FITC turno especial libre) y azul (filtro configurado filtros de paso de banda libre) 49 turnos DAPI en un microscopio invertido epi-fluorescencia (10X, 20X, 40X, planificar objetivos apocromáticos con 0.25, 0.75, 0.95 aperturas numéricas, respectivamente).
4. Para evitar la saturación de píxeles encontrar la exposición óptima dentro del rango lineal del detector para cada marcador fluorescente usando la función de 'sobreexposición' de software de adquisición de imagen. Tome nota de la exposición estandarizado para cada marcador fluorescente.
5. Captura de canales individuales y ahorrar en escala de grises o tiff pseudocoloreada (etiquetado formato de archivo de imagen) archivos de imágenes en la profundidad de bit más alto (preferiblemente de 16 bits - 65.536 valores de gris) proporcionada por el dispositivo de grabación (por ejemplo, enfriado CCD (dispositivo de carga acoplada) montado en el microscopio) . Ajuste la resolución de la imagen de 1388 x 1040 o superior. Asegúrese de incluir una barra de escala o un objeto de conocida dimensiones en la imagen.
6. Siempre que sea posible guardar archivos en formato de 16 bits archivo de imagen etiquetado (.tiff) y no en formato .jpeg para evitar la pérdida de información ^25.
7. Si hay alguna preocupación por la uniformidad de la iluminación (software incluido con el microscopio puede tener la corrección automática para esto) tomar una imagen de 'flat-field' de cubreobjetos sin células, pero manchado y montado de la misma manera diapositivas como experimentales; esto puede ser usado para corregir defectos de iluminación posterior a la adquisición en el software de análisis de imagen.
8. Para la adquisición de imágenes (microscopía confocal), optimizar la ganancia del detector y la potencia del láser para cada experimento de imágenes (evitar la saturación). En general, la fluorescencia medida es proporcional al nivel de potencia láser. Definición del tamaño del agujero de alfiler a '1 aireado' para lograr la mejor relación señal-ruido (resolución mejorada puede lograrse a 0,5 aireado para señales especialmente fuertes). Tome secciones ópticas a diferentes niveles a lo largo del eje z a través de la hormigacélulas ibody marcado y guardar una proyección máxima de 16 bits para cada canal para el análisis de imágenes.

9. Medidas Escénicas de la etiqueta fluorescente factores de transcripción nuclear utilizando el procesamiento y análisis de imágenes de software (5 min por campo de visión).

1. Acceso a archivos de imagen TIFF individuo y de superposición correspondiente canales haciendo clic y arrastrando una imagen en otra. Cada canal aparecerá entonces como una capa separada en el panel de capas.
2. Seleccione aligerar el menú de filtros para permitir capas por debajo, para ser visualizados simultáneamente. Alternativamente, ajustar la opacidad de las capas superiores al 50%.
   NOTA: Las imágenes TIFF se pueden guardar con el Lempel-Ziv-Welch (LZW) compresión de datos "sin pérdida" para reducir los tamaños de archivo sin pérdida de información.
3. En la ventana de análisis (Análisis> Seleccionar puntos de datos> Personalizar), seleccione Análisis y elegir las mediciones requeridas (por ejemplo, la densidad integrada, Densit significary, la circularidad, histograma, etc.). Deseche cualquier mediciones innecesarias desmarcando la casilla junto a ellos. Si se requieren mediciones de área en micras, haga clic en Análisis> Configurar escala de medida. La herramienta gobernante aparecerá automáticamente - rastrear la longitud de la barra de escala y escriba su longitud conocida en micrómetros. El software entonces convertir las mediciones de área en micras cuadradas.
   NOTA: Si se selecciona el análisis de histogramas, cuando se registran las mediciones aparecerá una carpeta adicional (la localización de los cuales puede ser elegido) con 8 bits histogramas para cada área de selección individual en la micrografía, así como la suma de todas las selecciones individuales (esto siempre aparece como histograma en 1 si se realizan varias selecciones). Este análisis no puede realizarse por el software en formato de 16 bits, pero es muy útil para examinar la distribución de las intensidades de los píxeles a lo largo de un objeto de interés.
4. Para el análisis de la intensidad de fluorescencia nuclear primero construir un representante 'Color Range Selección Mask' (CRSM) por Hoechst o ADN manchado DAPI para definir el área nuclear. Una vez que las imágenes del canal deseado se superponen, sólo la capa de canal Hoechst se debe dejar a la vista, garantizando el "icono del ojo 'junto a ella en la pestaña capas se selecciona y luego se pone de relieve capa (se vuelve azul), mientras que todas las demás capas deben ser sin seleccionar. Asegúrese de que el menú desplegable de la mezcla es un retroceso en "Normal" en la pestaña de capas.
5. Abra el cuadro de diálogo Rango de color (Selección> Gama de colores) y establezca la opción desplegable de selección para "colores muestreados. Con la vista previa de selección establecido en 'máscara rápida' (fondo rojo) seleccionar todos los tonos de color azul dentro de los núcleos manteniendo pulsada la tecla shift (aparece signo '+') y haciendo clic dentro de los núcleos utilizando la herramienta cuentagotas que aparece.
   1. Si se seleccionan los tonos no deseados, eliminarlos pulsando la tecla Alt ('aparece ─'sign) y haciendo clicen ellos. Mantener la escala borrosidad en cero para que los tonos de color seleccionadas manualmente se incluyen en la medición y clusters de color localizados 'deben dejarse sin marcar.
6. Guardar este CRSM a disco duro del ordenador como un programa específico de archivo de extracción (.axt). Con otro campo aleatorio de núcleos, carga, actualizar y guardar el CRSM (Select, gama de colores, de carga). Haga esto por lo menos cinco campos aleatorios para asegurar que las selecciones nucleares son representativos.
   1. Utilice una versión en color de una imagen en escala de grises para la creación de una máscara para aislar características porque el ojo humano es más capaz de discriminar entre diferentes tonos de color que entre varios tonos de gris ^26.
7. Utilice la CRSM nuclear a las regiones nucleares del segmento para la tinción. Una vez que los núcleos se han seleccionado, haga clic en Imagen> Ajuste> Umbral y mueva el control deslizante hacia la derecha, de modo que los núcleos se vuelven negro. Alternativamente,haga clic derecho y seleccione "llenar" a continuación, elija 'Llena de: negro'. Luego haga clic en Selección> Invertir y ahora presione Eliminar para eliminar todos los antecedentes (si la opción aparece elija 'llenar a: Blanca'). Este binarizes esencialmente la imagen en función de su selección. A continuación, cargue el plugin de cuencas en la ficha filtros para separar los núcleos superpuestos (Filtro> imagen binaria> separación característica de cuencas).
   1. Si muchos núcleos están fuertemente solapada, retire los núcleos de análisis anulando su selección (Mantenga pulsada la tecla Alt y sin apretar dibujar alrededor de ellos con la herramienta Lazo).
8. En la capa nuclear ahora binario, ir a Selección> Gama de colores y> Sombras, para seleccionar los distintos núcleos. Turno de espera Alternativa y clic dentro de cualquier núcleo negro. Serán inmediatamente seleccionaron todos los núcleos. A continuación, traslado de esta selección a la capa que contiene la tinción de factor de transcripción nuclear (por ejemplo miogenina) seleccionando esa capa y anulando la selección de todosotras capas. Líneas que marchan ahora mostrarán la posición de los núcleos en el canal miogenina.
9. Si se trabaja con imágenes pseudocoloreada sólo haga clic en la paleta Canales (a la derecha de la pestaña de capas) y seleccione sólo el canal verde (la imagen aparecerá ahora gris). Luego haga clic en Imagen> Modo> Escala de grises. Una advertencia aparecerá "Acoplar capas visibles y deseche las capas ocultas 'haga clic en Aceptar, a continuación, otra advertencia dirá' descartar otros canales 'haga clic en Aceptar de nuevo. Sólo una capa única de escala de grises seleccionado núcleos ahora estará presente en la paleta de capas.
   1. Haga clic en Grabar medidas en el registro de medidas para obtener datos de los núcleos seleccionados. Si la capa a analizar (por ejemplo miogenina tinción) ya es una imagen en escala de grises de 16 bits en bruto y luego simplemente presione Grabar medidas.
   2. Exportación medidas seleccionadas como TXT archivo a la ubicación de su elección. Estos pueden ser procesados ​​y analizados en otro software de manejo de datos p másackages
      NOTA: El comando Edición> Paso atrás (pulse todos Alt, Ctrl y las teclas Z simultáneamente) restaura todas las capas anteriores si es necesario.
   3. Correcta para no específica fluorescencia de fondo ²⁷ que los resultados sean cuantitativa y comparable como mediciones de la intensidad de fluorescencia son siempre una mezcla de señal y el fondo.
      1. Seleccione la herramienta de selección de plaza y comprobar 'Tamaño fijo' elegir 20 por 20 píxeles (o mayor si se desea y en función de la confluencia de las células en la imagen). Mientras mantiene turno seleccionar diez o más zonas de fondo extendido por todo el campo de visión. Pulse 'Mediciones de registro' en el registro de medidas.
      2. Calcular la densidad media integrado (suma de todos los valores de gris píxeles) por píxel de las 10 regiones de fondo seleccionadas (dado que el 'valor medio gris "en el registro de medición). Multiplicar el promedio de densidad de fondo por píxel por el número de píxeles en el objeto de destino ( Es decir, cada núcleo) para dar fondo promedio por objeto.
      3. Reste fondo de fluorescencia de los objetos de densidad integrada originales para dar el fondo último valor corregido. Este enfoque representa el potencial del campo de variación del campo en no específica fluorescencia de fondo.
         NOTA: Es de suma importancia para seleccionar sólo las regiones de fondo de buena fe como esta corrección tiene un impacto considerable en los valores finales. Zoom en el uso de la lupa se recomienda al hacer selecciones.
      4. También puede ser útil dividir el fondo general de valor corregido por el área del núcleo en píxeles (mismo que tomar el nivel medio del gris / intensidad por núcleo) para minimizar cualquier posible influencia de la señal de fondo nuclear localizada que contribuir más a la densidad integrada valor con el aumento del tamaño nuclear (Figura 3C).

Resultados

Células miogénicas y fibroblastos purificadas pueden ser cultivadas en un medio de diferenciación adipogénica durante tres días seguidos por medio de la nutrición adipogenic desde cualquier lugar entre 7-30 días para evaluar su potencial para la adipogénesis. Uso de las poblaciones de células purificadas, la tinción con Oil Red O en combinación con inmunotinción para marcadores de linaje adipogénicos y miogénicas mostró que sólo la fracción de fibroblastos era capaz de diferenciación adipogénica

Discusión

Hemos descrito un procedimiento de clasificación immunomagentic para el enriquecimiento selectivo de precursores derivadas de músculo humanos a partir de pequeñas muestras de material de biopsia muscular. Esta técnica ha sido muy valiosa en nuestro laboratorio para superar la pérdida de cultivos de músculo humanos derivados de los fibroblastos, sino también para la comprensión del comportamiento único de poblaciones distintas de células progenitoras derivadas de músculo. Células miogénicas Una vez purificad...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase  D	Roche	11088866001
Dispase II	Sigma	D4693-1G	Must be filter sterilized before use
Trypsin/EDTA	(Gibco) Invitrogen	15400-054
100 μm cell strainer	BD Biosciences	352360
Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid)	Sigma, Dorset, UK	C8919
Minisart SRP15 syringe filter (0.2 μm)	Sartorius	17573ACK	Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane
CD56 human Microbeads	Miltenyi Biotech	130-050-401	Be aware of the limited shelf life of microbeads
Anti- fibroblast Microbeads, human	Miltenyi Biotech	130-050-601
40 μm Pre-separation filters	Miltenyi Biotech	130-041-407
Large Cell Collumns	Miltenyi Biotech	130-042-202	These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here.
LS columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
MiniMacs Seperator	Miltenyi Biotech	130-042-102	This separator fits the large cell column but not the LS column.
MidiMACS	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS multistand	Miltenyi Biotech	130-042-303
BSA	Sigma		Must be filter sterilized before use
Oil Red O	Sigma	O0625
Triethyl phosphate	Sigma	538728
Whatman Paper	Sigma	Z241121-1PAK	No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering.
ProLong Gold Antifade Reagent	Molecular Probes, Invitrogen	P36930	This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence.
AxioVision	Carl Zeiss	Contact Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended	Adobe (purchased from Pugh Computers)	ADPH16982*