JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.

Abstract

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.

Introduction

الدوائر مستقبلات الخلايا T-الختان (TRECs) والدوائر إعادة التركيب الختان حذف K (KRECs) هي عناصر DNA الدائرية الصغيرة التي رفعه في نسبة البائية والخلايا، على التوالي، وذلك خلال عملية إعادة التركيب الحمض النووي الجيني، مما أدى إلى تشكيل ذخيرة متنوعة للغاية من T- ومستقبلات B-الخلية. ليس لديهم وظيفة، ولكن لأنها مستقر ولا يمكن تكرارها، والمخفف أنهم بعد كل انقسام الخلايا، وبالتالي استمرار فقط في واحدة من خلايا ابنة اثنين. ولذلك، مستوياتها في الدم المحيطي يمكن افتراض بمثابة تقدير للالتوتة والعظام الناتج نخاع.

في حين أن الفحص TREC وقد تستخدم إلى حد كبير على مدى السنوات ال 15 الماضية لتقييم مدى انتاج الغدة الصعترية (1)، فحص KREC، والذي تم تطويره في البداية لقياس انتشار B-الخلية ومساهمتها في التوازن B-خلية في الصحة والمرض، 2 وقد اقترح مؤخرا فقط كعلامة من العظام مالسهم الانتاج. 3،4 هنا، نحن تصف طريقة وضعنا لتقدير وقت واحد من كل من TRECs وKRECs. 4

مع هذا الأسلوب المشترك، يتم التخلص من التقلبات المرتبطة الكمي الحمض النووي عن طريق الوقت الحقيقي PCR باستخدام منحنى قياسي فريد من نوعه تم الحصول عليها عن طريق تمييع البلازميد الثلاثي إدراج تحتوي على شظايا من TRECs، KRECs وT-خلية مستقبلات ألفا ثابتة (TCRAC) الجينات في نسبة 1: 1: 1. وهذا يسمح تقييم أكثر دقة للTREC وKREC عدد النسخ. وعلاوة على ذلك، فإن الكمي في وقت واحد من الهدفين في نفس رد الفعل يسمح خفض التكاليف كاشف.

الفحص TREC / KREC المقترحة يمكن أن تكون مفيدة لقياس مدى البائية والخلايا الجدد الإنتاج في الأطفال أو البالغين الذين يعانون من نقص المناعة الشديد المجمعة (SCID)، 4 نقص المناعة المتغير المشترك، 5 أمراض المناعة الذاتية، 6-8 وفيروس نقص المناعة البشرية 9 وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن استخدامها لمراقبة الانتعاش المناعة بعد زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم، و 10 استبدال إنزيم و 11 و المضادة للفيروسات 9 أو المناعة العلاجات. 6-8 وأخيرا، ليتم التعرف على مرضى SCID باستخدام TREC فحص على الرغم من العيوب الوراثية الكامنة، وفقد غاماغلوبولين الدم المرضى يمكن تحديدها باستخدام KREC الكمي وفحص TREC / KREC يمكن استخدامها أيضا للكشف عن نقص المناعة في برامج فحص حديثي الولادة. 12 وفي هذه الحالة، يجب إجراء اختبار على الحمض النووي المستخرج من بقع صغيرة من الدم نشف وتجفف على ورق الترشيح، يجب أن تكون حساسة للغاية ومحددة ل الأمراض المستهدفة، وكذلك استنساخه للغاية وفعالة من حيث التكلفة.

إدخال KREC الكمي في اختبار يجب تحسين أداء فحص حديثي الولادة لنقص المناعة، والتي عادة أجريت في بعض أجزاء من الولايات المتحدة الأمريكية (WI، MA، CA) منذ عام 2008 عندما أصبحت ولاية ويسكونسن أول من introducالبريد تحليل TRECs في برنامجها فحص ما بعد الولادة. 13

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

بيان الأخلاق: ملاحظة: هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية لمؤسستنا، وSpedali سيفيلي دي بريشيا

1. إعداد "الثلاثي إدراج" البلازميد

  1. اختيار وإعداد المواد الانطلاق المناسبة:
    1. الحصول على عينة تحتوي على خلايا من المحتمل جدا أن يكون TRECs وKRECs كشفها بواسطة PCR، مثل الدم المحيطي للموضوع صحي الشباب التي تم جمعها في أنابيب EDTA.
      ملاحظة: في الأصل، ونحن قد وضعت طريقة استخدام thymocytes لTRECs والخلايا وحيدة النواة من شظايا وزة لKRECs، ولكن مواضيع صحية وعادة ما يكون مبلغ TRECs وKRECs كافية للسماح الكشف عنها بواسطة PCR. ولذلك، ينبغي أن يكون الدم المحيطي بديل صالح، وأسهل للحصول على وللعمل مع. وبالنظر إلى أن TRECs، على وجه الخصوص، ينخفض ​​مع تقدم العمر في البالغين الأصحاء، الدم المحيطي من الشباب البالغين، إن لم يكن من الأطفال، وينصح.
    2. منفصلة mononuc الدم الطرفيةخلايا لير (PBMC) من خلال كثافة التدرج طريقة فصل القياسية.
  2. استخراج الحمض النووي:
    1. استخراج الحمض النووي من PBMC باستخدام أدوات DNA الدم البسيطة التجارية. اتبع تعليمات الشركة الصانعة مع قليل من التعديلات هو موضح أدناه.
      1. احتضان العينات عند 70 ° C (بدلا من 56 درجة مئوية) لمدة 10 دقيقة باستخدام شاكر حاضنة في 1،400 دورة في الدقيقة.
      2. إضافة شطف العازلة تسخينها عند 70 درجة مئوية إلى العمود، واحتضان لمدة 5 دقائق عند 70 درجة مئوية، وأزل الحمض النووي بواسطة الطرد المركزي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تحديد تركيز الحمض النووي المستخرج من تقدير الطيفي في 260/280 نانومتر.
  3. إعداد البلازميد التي تحتوي على إدراج من TREC وKREC المفاصل إشارة (SJ) والجين إشارة TCRAC:
    1. تضخيم الحمض النووي المستخرج من PBMC (للحصول على TREC-SJ، KREC-SJ، وشظايا TCRAC) مع الاشعال محددة لTRECs، KRECs وTCRAC (انظر الجدول 1).
      ملاحظة: في نهاية 5'، الاشعال KREC- وTCRAC محددة تحتوي على HindIII وSpeI المواقع تقييد (في حالة أقل في تسلسل يظهر الجدول رقم 1) مع عدد مناسب من النيوكليوتيدات المرافقة إضافية (المشار إليها في مائل). كل من ميزات ليست موجودة في الكنسي KREC وTCRAC متواليات.
TRECs إلى الأمام 5'-AAA GAG GGC AGC CCT CTC CAA GGC-3 "
عكس 5'-GGC TGA TCT TGT CTG ACA TTT GC-3 "
KRECs إلى الأمام 5'- CCC مجموعة الاهلي CTT TCA GCG CCC ATT ACG TTT CT-3 "
عكس 5'- CCC مجموعة الاهلي CTT GTG AGG GAC ACG CAG CC-3 "
TCRAC إلى الأمام 5'- G العلامة ميلان تات GAG ACC GTG ACTTGC CAG-3 "
عكس 5'- G العلامة ميلان TGC TGT TGT TGA AGG CGT TTG C-3 "

الجدول 1. الاشعال المستخدمة لإجراءات الاستنساخ. وتظهر في نهاية 5'، في الحالة الأدنى النيوكليوتيدات المقابلة لمواقع انزيم التقييد، في حين يتم عرض أضاف بخط مائل المرافقة النيوكليوتيدات.

    1. إجراء التفاعلات PCR في الحجم النهائي من 25 ميكرولتر، ويتألف من 1X العازلة II، 1.5 ملي MgCl 2، مزيج dNTP (كل 200 ميكرومتر)، الاشعال في تركيز النهائي من 900 نانومتر، AmpliTaq DNA البلمرة (2.5 U / 25 ميكرولتر)، و 100 نانوغرام من الحمض النووي.
    2. استخدام المعلمات PCR التالية: الخطوة الأولى في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، وأخيرا 1 دورة من 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. وينبغي أن تكون أطوال المنتج PCR: 380 نقطة أساس لTRECs، 166 نقطة أساس لKالمجموعات الاقتصادية الإقليمية، 381 نقطة أساس لTCRAC.
    3. إدراج منتج PCR من TREC-SJ في الموقع متقبل TA من متجه pCR2.1-TOPO. تحويل DNA البلازميد في الخلايا المختصة كيميائيا XL1 والأزرق بفعل الحرارة صدمة بعد بروتوكول المتوفرة مع الخلايا. بين المستعمرات التي تنمو بسبب مقاومة الأمبيسلين، وتحديد تلك التي تحمل إدراج، والتي سوف تظهر بيضاء بسبب خسر تكامل β غالاكتوزيداز، وتطعيم لهم في طبق الرئيسي. وأخيرا، وتحديد المستعمرات التي تحتوي على جزء TREC بواسطة PCR.
    4. توسيع واحدة من المستعمرات التي تم تحديدها وتنقية DNA البلازميد باستخدام miniprep عدة البلازميد واتبع تعليمات الشركة الصانعة. هضم DNA البلازميد وTCRAC تضخيم المنتج مع SpeI انزيم التقييد وligate جزء TCRAC إلى الموقع تقييد SpeI.
    5. تحويل DNA البلازميد في الخلايا XL1 والأزرق والتعرف على المستعمرات التي تحتوي على جزء TCRAC بواسطة PCR. توسيع واحدة من المستعمرات التي تم تحديدها وتنقية وDNA البلازميد باستخدام طقم البلازميد miniprep.
    6. هضم DNA البلازميد والمنتج KREC تضخيم مع HindIII واستنساخ جزء KREC-SJ إلى الموقع تقييد HindIII. تحويل DNA البلازميد في الخلايا XL1 والأزرق والتعرف على المستعمرات التي تحتوي على جزء ثالث من قبل PCR.
    7. التحقق، عن طريق التسلسل المباشر، وجود إدراج ثلاثة وغياب الطفرات. خريطة النهائي بلازميد الثلاثي إدراج تتمثل في الشكل 1.

figure-protocol-6103
الشكل 1. الثلاثي إدراج البلازميد خريطة. الثلاثي إدراج خريطة البلازميد التي تبين موقف تسلسل TREC، KREC، TCRAC والمواقع انزيم قيود. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    غ = "3">
    1. توسيع واحدة من المستعمرات التي تم تحديدها، تنقية DNA البلازميد باستخدام طقم البلازميد midiprep. تحديد تركيز الحمض النووي البلازميد التي كتبها التقدير الطيفي في 260/280 نانومتر ونوعية الحمض النووي عن طريق الكهربائي للهلام. تخزين مأخوذة المناسبة من البلازميد في -80 ° C (على سبيل المثال، 50 ميكرولتر لكل منهما).

2. معيار إعداد كيرف

ملاحظة: إعداد جميع التخفيفات في 0.1X TE عازلة في مكان المصممة خصيصا لاحتواء DNA المرحل.

  1. حساب كتلة من الأرقام نسخة البلازميد من الفائدة (انظر الجدول 2)، مع الأخذ بعين الاعتبار أن حجم البلازميد هو 4،846 سنة مضت وأن متوسط ​​كتلة في بي بي هو 1.096 × 10 -21 ز / بي بي، وبالتالي: م ع = ( 4،846 بي بي) س (1.096 × 10 -21 ز / بي بي) = 5،311.216 × 10 -21 ز = 5.311 × 10 -18 ز.
>
نسخة # س 5.311 × 10 -18 ز كتلة DNA البلازميد (ز)
1 × 10 6 5.311 × 10 -12
1 × 10 5 5.311 × 10 -13
1 × 10 4 5.311 × 10 -14
1 × 10 3 5.311 × 10 -15
1 × 10 2 5.311 × 10 -16

الجدول 2. قداس البلازميد اللازمة لكل نقطة في منحنى التخفيف القياسية.

  1. حساب تركيزات DNA البلازميد من خلال تقسيم الجماهير البلازميد التي يحتاجها حجم (5 ميكرولتر) ليتم pipetted في كل رد فعل (انظر الجدول 3).
كتلة DNA البلازميد (ز) ÷ 5 ميكرولتر تركيز النهائي من DNA البلازميد (ز / ميكرولتر)
5.311 × 10 -12 1.062 × 10 -12
5.311 × 10 -13 1.062 × 10 -13
5.311 × 10 -14 1.062 × 10 -14
5.311 × 10 -15 1.062 × 10 -15
5.311 × 10 -16 1.062 × 10 -16
جي = "0" هوامش الخلية = "0">

الجدول 3. حساب تركيزات البلازميد اللازمة لكل نقطة التخفيف.

  1. ذوبان الجليد قسامة من البلازميد. خطي 2 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد مع XhoI وتحديد من تركيز بذ التقدير الطيفي في 260/280 نانومتر.
  2. إعداد تخفيف السليم للDNA البلازميد خطي من أجل تحقيق حل ملائم الأسهم العمل للبدء من (على سبيل المثال، 100 نانوغرام / ميكرولتر = 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر = 1 × 10 -7 ز / ميكرولتر). تخزين ما تبقى من DNA البلازميد خطي في -80 ° C.
  3. تنفيذ عدد مناسب 1:10 أو 1: 100 التخفيفات لجلب البلازميد في تركيز أكثر عملي لل1 × 10 -10 ز / ميكرولتر.
  4. استخدام الصيغة C 1 V 1 = C 2 V 2 لحساب حجم التخفيف (V 2 - V 1) اللازمة لإعداد أول نقطة في منحنى القياسية من سلسلة (1 × 10 6 نسخ، الموافق 1.062 × 10 -12 ز / 5 ميكرولتر؛ انظر الجدول 4).
اضرب الأولي. (ز / ميكرولتر) البلازميد DNA المجلد (ميكرولتر) Dilueالإقليم الشمالي المجلد (ميكرولتر) المجلد النهائي. (ميكرولتر) اضرب النهائي. (ز / ميكرولتر) عدد النسخ النهائية من DNA البلازميد / 5μl
C 1 V 1 V 2 -V 1 V 2 C 2
1 × 10 -7 5 ميكرولتر 45 ميكرولتر 50 ميكرولتر 1 × 10 -8 غير متوفر
1 × 10 -8 5 ميكرولتر 495 ميكرولتر 500 ميكرولتر 1 × 10 -10 غير متوفر
1 × 10 -10 5 ميكرولتر 465 ميكرولتر 470 ميكرولتر 1.062 × 10 -12 1 × 10 6
1.062 × 10 -12 50 ميكرولتر 450 ميكرولتر 500 ميكرولتر 1.062 × 10 -13 1 × 10 5
1.062 × 10 -13 50 ميكرولتر 450 ميكرولتر 500 ميكرولتر 1.062 × 10 -14 1 × 10 4
1.062 × 10 -14 50 ميكرولتر 450 ميكرولتر 500 ميكرولتر 1.062 × 10 -15 1 × 10 3
1.062 × 10 -15 50 ميكرولتر 450 ميكرولتر 500 ميكرولتر 1.062 س 10- 16 1 × 10 2

الجدول 4. حسابات التخفيف.

  1. المضي قدما في سلسلة منتظمة 1:10 التخفيفات للحصول على ما تبقى من نقاط منحنى القياسية.
    ملاحظة: لا تنسى أن دوامة كل التخفيف البلازميد لفترة وجيزة قبل تنفيذ المقبل.
    ملاحظة: أعلى تخفيف من شارعandard منحنى (10 نسخة / 5 ميكرولتر) يجب أن يكون مستعدا قبل إجراء الفحص، لأن مثل هذه كمية صغيرة من DNA البلازميد ليست مستقرة بما فيه الكفاية ليتم تخزينها لاستخدامها في المستقبل.
  2. تخزين نقاط التخفيف الثلاثي بلازميد في -80 ° C في أنابيب منفصلة حتى الاستخدام. الحمض النووي الثلاثي بلازميد المخفف هو درجة عالية من الاستقرار لمدة 6 أشهر على الأقل.

3. استخراج الحمض النووي من العينات المستهدفة

  1. PBMC منفصل من الدم المحيطي التي تم جمعها في أنابيب EDTA باستخدام طريقة الفصل المتدرج الكثافة.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم غيرها من المواد انطلاق ملائمة (على سبيل المثال، مرتبة القطعان الخلايا اللمفاوية والدم كله) كما عينة المستهدفة.
  2. استخراج الحمض النووي من PBMC العينات الهدف كما ذكرت في الخطوة 1.2.

4. في الوقت الحقيقي PCR لالكمي لTRECs وKRECs

  1. إعداد لوحة والتحميل:
    1. ترتيب لوحة PCR بينهم اثنان على الأقل مكررات لكل العيناتليتم تحليلها: المنحنى القياسي (A → F 1 → 4)، مراقبة إيجابية (CTRL +، G1 → 4) وعدم السيطرة القالب (NTC، H 1 → 4).
      ملاحظة: لاحظ مخطط نموذجي في الجدول 5، ولكن يمكن إنشاء أشكال مختلفة. تذكر أن TRECs وKRECs سوف تتضخم معا في نفس الآبار، متميزة عن تلك التي TCRAC.
TRECs + KRECs ل TCRAC ب TRECs + KRECs TCRAC TRECs + KRECs TCRAC
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 10 6 نسخ 10 6 نسخ 10 6 نسخ 10 6 نسخ 1 1 1 1 9 9 9 9
B 10 5 نسخ 10 5 نسخ 10 5 نسخ 10 5 نسخ 2 2 2 2 10 10 10 10
C 10 4 نسخ 10 <سوب> 4 نسخ 10 4 نسخ 10 4 نسخ 3 3 3 3 11 11 11 11
D 10 3 نسخ 10 3 نسخ 10 3 نسخ 10 3 نسخ 4 4 4 4 12 12 12 12
E 10 2 نسخ 10 2 نسخ 10 2 نسخ 10 2 نسخ 5 5 5 5 13 13 13 13
F 10 نسخ 10 نسخ 10 نسخ 10 نسخ 6 6 6 6 14 14 14 14
G CTRL + CTRL + CTRL + CTRL + 7 7 7 7 15 15 15 15
H NTC NTC NTC NTC 8 8 8 8 16 16 16 16

الجدول 5. عينة في الوقت الحقيقي PCR لوحة.

    1. حساب إجمالي عدد الآبار اللازمة (بما في ذلك 1 - 2 آبار اضافية لحساب الأخطاء pipetting لالممكنة) وإعداد مزيج الرئيسي لTRECs / KRECs وTCRAC في أنابيب منفصلة (انظر الجدول 6).
      ملاحظة: يتم ذكر الاشعال وتحقيقات محددة لTRECs، KRECs وTCRAC في الجدول 7 التمهيدي وتحقيق تركيزات النهائية هي 900 نانومتر و 200 نانومتر، على التوالي.
TRECs / KRECs TCRAC
H 2 O 2 ميكرولتر H 2 O 4.75 ميكرولتر
KRECs لمدة 20 بمول / ميكرولتر 1.125 ميكرولتر TCRAC لمدة 20 بمول / ميكرولتر 1.125 ميكرولتر
تزيد السرعة KRECs 20 بمول / ميكرولتر 1.125 ميكرولتر تزيد السرعة TCRAC 20 بمول / ميكرولتر 1.125 ميكرولتر
KRECs التحقيق 10 بمول / ميكرولتر 0.5 ميكرولتر TCRAC التحقيق 10 بمول / ميكرولتر 0.5 ميكرولتر
TRECs لمدة 20 بمول / ميكرولتر 1.125 ميكرولتر 2X TAQMAN العالمي PCR ميكس ماجستير 12.5 ميكرولتر
TRECs تزيد السرعة 20 بمول / ميكرولتر 1.125 ميكرولتر
TRECs التحقيق 10 بمول / ميكرولتر 0.5 ميكرولتر
2X TAQMAN العالمي PCR ميكس ماجستير 12.5 ميكرولتر

الجدول 6. حجم الكواشف اللازمة لآبار المشار إليها.

TRECs إلى الأمام 5'-CAC ATC CCT TTC AAC CAT GCT-3 "
عكس 5'-TGC AGG TGC CTA TGC ATC A-3 "
مسبار 5'-FAM-ACA CCT CTG GTT TTT GTA AAG GTG CCC ACT-طمرة-3 "
KRECs إلى الأمام 5'-TCC CTT AGT GGC ATT ATT TGT ATC ACT-3
عكس 5'-AGC AGG CAG CTC TTA CCC TAG AGT-3 "
مسبار 5'-HEX-TCT GCA CGG GCA GCA GGT TGG-طمرة-3
TCRAC إلى الأمام 5'-TGG CCT AAC CCT GAT CCT CTT-3 "
عكس 5'-GGA TTT AGA GTC TCT CAG CTG GTA CAC-3
مسبار 5'-FAM-TCC CAC AGA TAT CCA غا CCC TGA CCC-طمرة-3 "

الجدول 7. تسلسل التمهيدي وتحقيقات للكمبيوتر في الوقت الحقيقيR الفحص.

    1. إضافة 20 ميكرولتر من كل مزيج (TRECs / KRECs وTCRAC). قبل مغادرة غرفة تحضير كاشف، وختم لوحة رد فعل مع غطاء لاصقة البصرية.
    2. في حمض غرفة استخراج النووية، ورفع غطاء لاصقة وإضافة 5 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الجيني (400-500 نانوغرام) إلى الآبار. إضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني (أي أعدت من PBMC تم الحصول عليها من دم الحبل السري) إلى الآبار CTRL +.
      ملاحظة: وكبديل للدم الحبل السري، واستخدام DNA من نفس المعروفة، إيجابية عينة من الدم الطرفية أو مجموعة من العينات، أو إعداد "مصطنعة" معيار ايجابي عن طريق خلط كمية العزم من الثلاثي إدراج بلازميد مع الحمض النووي الجيني من TREC- وخطوط الخلايا KREC سلبية.
    3. إضافة 5 ميكرولتر من المياه إلى الآبار المجلس الوطني الانتقالي. ختم لوحة رد فعل مرة أخرى مع غطاء لاصقة البصرية.
    4. الانتقال إلى مكان ضمان احتواء البلازميد DNA المرحل. ذوبان الجليد كل بوين التخفيفطن من منحنى بلازميد مستوى DNA فقط قبل الاستخدام وإعداد أعلى تخفيف (10 نسخة / 5 ميكرولتر). ارفع غطاء لاصقة فقط من الألف → H 1 → 4 آبار وإضافة 5 ميكرولتر من كل تخفيف نقطة منحنى بلازميد مستوى DNA. ختم غطاء لاصق مرة أخرى.
    5. التحقق من عدم وجود فقاعات على الجزء السفلي من الآبار، وبالتالي ضمان أن يتم وضع الكواشف في الأسفل.
    6. تشغيل فحص على نظام في الوقت الحقيقي PCR. ويتكون بروتوكول قياسي من الخطوة الأولى عند 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، وهي التسخين الأولي في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، تليها 45 دورات تمسخ في 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، وجنبا إلى جنب التمهيدي / مسبار الصلب واستطالة في 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
    7. حفظ البيانات في نهاية البرنامج PCR.
      ملاحظة: لتجنب DNA عبر التلوث، وتذكر: لمتابعة توصيات الممارسة المخبرية الجيدة المعتادة لالكمي PCR عند إعداد الوقت الحقيقي PCR مقايسة: استخدام مناطق / غرف منفصلة لاستخراج الحمض النووي،إعداد كاشف، والتلاعب البلازميد، رد فعل التضخيم. استخدام مجموعات ماصة منفصلة. تغيير القفازات / المعاطف حسب مقتضى الحال.
  2. النتائج وحساب:
    ملاحظة: تستند الخطوات التالية على تجربتنا باستخدام البرامج المقدمة مع الوقت الحقيقي PCR أداة المذكورة في الجدول المواد، ولكن، بشكل عام، ينبغي أن تنطبق على غيرها في الوقت الحقيقي منصات تحليل PCR والبرمجيات. نضع في اعتبارنا أن، حتى لو باستخدام نفس البرمجيات، وعادة ما يكون هناك أكثر من طريقة واحدة لتنفيذ الأوامر المطلوبة (على سبيل المثال، والرموز والاختصارات).
    1. فتح الملف نتيجة حفظها في البرنامج وانقر على "نتائج" علامة التبويب. على رأس من النافذة، انقر على القائمة "تحليل" وحدد "إعدادات تحليل". السماح للبرنامج تحديد عتبة تلقائيا عن طريق اختيار "الكل" للكشف عن و"السيارات ط م" (ط = عتبة دورة. دع مجموعة البرمجيات "خط الأساس تلقائي". لإزالة الخلفية بشكل افتراضي.
    2. انقر فوق علامة التبويب المسمى "التضخيم مؤامرة"، وفي أقصى اليمين جزء من النافذة، حدد واحدا من "كشف" ثلاثة في القائمة المنسدلة المقابلة (على سبيل المثال، مع بدء TRECs). أقل بقليل، حدد "ط يدوي" لتحديد العتبة يدويا. اذهب إلى الجزء السفلي من النافذة وحدد الآبار المقابلة لنقطة منحنى التخفيف القياسية للكشف عن اختيارك لعرض المؤامرات التضخيم. للقيام بذلك فقط انقر واسحب الماوس فوق الخلايا المقابلة من الجدول.
      1. لضبط عتبة يدويا، اسحب خط العتبة الحمراء صعودا وهبوطا، ومن ثم انقر فوق "تحليل" لreanalyze النتائج. للتحقق من مدى تحديد عتبة يؤثر على النتائج، حدد "تقرير" علامة التبويب، ونرى الناتجة ط م من نقطة منحنى التخفيف القياسية المعنية. عندما تتحرك عتبة، في محاولة ليتوافق مع التوصيات التالية للحصول على موضع الأمثل.
      2. نعود إلى "التضخيم مؤامرة" علامة التبويب، والتحقق من أن عتبة في المنطقة من التضخيم الهائل بما فيه الكفاية فوق ضجيج الخلفية ولكن دون مرحلة الهضبة. إذا لم يظهر مؤامرة التضخيم في مقياس لوغاريتمي، انقر بزر الماوس الأيمن على مؤامرة أن نذكر "إعدادات الرسم البياني" وتعيين إعداد Y-محور تشغيل ما بعد باسم "تسجيل"، تعيين عتبة منتصف الطريق في الجزء الخطي لل مؤامرة، ومراقبة منحنيات التضخيم موازية تقريبا لبعضها البعض.
      3. انقر على "تقرير" علامة التبويب لرؤية النتائج ط. تأكد من أن وضع عتبة تنتج النتائج أن زيادة دقة اثنين من مكررات كل نقاط منحنى التخفيف القياسية.
      4. تأكد من أن يتم وضع عتبة عند نقطة الذي يعكس على أفضل وجه أوامر القصوى من ضخامة نقاط منحنى التخفيف القياسية (حساسية المثلى). كرر الخطوة 4.2.2 وsubsteps المتبقية للكشف عن الباقيين (KRECs وTCRAC).
      5. انتقل إلى علامة التبويب تقرير، اسحب الماوس مرة أخرى في الجدول في الجزء السفلي من النافذة لتحديد الخلايا المقابلة للآبار من المنحنى القياسي لجميع أجهزة كشف (TRECs، KRECs، TCRAC). تحقق من أن ط الناتجة من الأهداف الثلاثة هي مشابهة جدا عند نقاط التخفيف نفسها (على سبيل المثال، الفرق لا يزيد عن 0.5 قيراط). تعدل العتبات إذا لزم الأمر وإعادة التحقق.
        ملاحظة: لأن البلازميد الثلاثي إدراج يحتوي على نسخة واحدة من كل-المستهدفة وبالتالي فإن نسبة التضخيم ينبغي أن تكون من الناحية النظرية قريبة من 1: 1: 1. في بعض الحالات قد يكون من الضروري تعديل يدويا أيضا الأساس لواحد أو أكثر من أجهزة كشف للحصول على نتائج أفضل. فقط تذكر "إعدادات تحليل" النافذة، حدد كاشف التي هناك حاجة للتعديل، ثم تعيين "خط الأساس يدوي"، وإدراج القيم المخصصة لبداية ونهاية دورات (عادة 3 إلى 15). ثم انقر فوق "موافق وReanalyze" وإعادة فحص النقاط السابقة.
    3. استعرض الدورة التجريبية إلا بعد التحقق مما يلي:
      1. انقر على "تقرير" علامة التبويب، انتقل إلى الجزء السفلي من النافذة، حدد الآبار المجلس الوطني الانتقالي وتحقق من أن ط م الموافق هو "Undet" (أي، لا التضخيم موجود في الآبار NTC).
      2. حدد "منحنى قياسي" علامة التبويب، ونتطلع إلى الحق من النافذة مؤامرة. اختر كشف من القائمة المنسدلة ومعرفة ما إذا كان منحنى ذكرت المنحدر القياسية يتراوح ما بين -3.55 -3.32 و(الموافق PCR الكفاءة من 91 - 100٪)
      3. تأكد من أن معامل التحديد (R 2) أعلى من 0.998 (الشكل 2)، من خلال قراءة قيمته الحق دون المنحدر واعتراض (في نفس "منحنى قياسي" علامة التبويب، بعد اختيار كل كاشف).
        ملاحظة: انتبه إلى النقاط التخفيف المتطرفة بسبب اختلال بهم قد تؤثر على منحدر أكثر سهولة (لديهم عالية "LEVEالغضب "تأثير على خط الانحدار). على وجه الخصوص، أن نضع في الاعتبار أن أعلى بلازميد التخفيف قد تتحلل في وقت أقرب مما كان متوقعا. ومع ذلك، كلما أمكن ذلك فإنه من المفيد عدم التخلص منها، لأن نهج عقلاني قد يكون للنظر في 100 مثل الحد من الكشف الكمي: وبعبارة أخرى، لعينات ما بين 10 و 100، قد يتم الإعلام عن نتيجة ك <100 أو "إيجابية ، ولكن لا يمكن قياسها "، في حين إذا خارج نطاق منحنى (<10) قد يتم الإبلاغ ك 0 أو" غير قابلة للكشف ".
        ملاحظة: قد يكون من المفيد للحفاظ على أرشيف من القيم ط من التخفيفات منحنى القياسية السابقة، وذلك لحساب متوسط ​​قيمة لكل نقطة التخفيف إلى أن تبقى كنوع من الأمثل "المرجعية" مجموعة أو فحص الجودة الداخلي للتجارب المستقبلية (على سبيل المثال، وحساب متوسط ​​وSD لبناء مخططات السيطرة شيوارت). بالقياس، قد يكون من المفيد للحفاظ على أرشيف من ط م الماضي من السيطرة الإيجابية.

figure-protocol-28716
الشكل 2. منحنيات القياسية لTRECs، KRECs، وTCRAC. المؤامرات من نقاط منحنى القياسية وتسجيل خط الانحدار وتقدر لTRECs (A)، يتم بناؤها KRECs (B)، وTCRAC (C) للتحقق من الامتثال مثالية الأسي معدل التضخيم (المنحدر = 3.32) التي من شأنها أن تتوافق مع كفاءة 100٪. ط: دورة عتبة. R 2: معامل الانحدار تقرير الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

      1. انقر على "تقرير" علامة التبويب، والتحقق من أن ط م من السيطرة الايجابية (وجدت في الخلايا المناظرة من الجدول تحت الرسم البياني) ويتسق ذلك مع نتائج فحوصات سابقة على سالي معروف مراقبة إيجابية.
        ملاحظة: "التقرير" علامة التبويب يظهر مبلغ TRECs، KRECs وTCRAC من العينات التي يجري اختبارها أن البرنامج قد تحسب على الاستيفاء من المنحنى القياسي منهما، وذلك باستخدام القيم ط الحصول عليها بعد العتبة وخط الأساس تم تعيين بشكل صحيح (أ أن تحليلا جديدا مع عتبة جديدة / خط الأساس تغيير هذه النتائج). لنرى أين يأخذ الاستيفاء مكان على المنحنى القياسي، حدد "المنحنى القياسي" علامة التبويب، ثم حدد الآبار المطلوب، والبحث عن الأسود "X" التي تظهر على خط الانحدار. قيمتها المحور ص هو كمية محرف. اذا كنت تستخدم دائما نفس مراقبة إيجابية، ويتراوح المرجعية المناسبة و / أو الرسوم البيانية مراقبة الجودة يمكن أن يبنى على أساس القيم السابقة تحدد على مراقبة إيجابية.
    2. انقر على القائمة "ملف"، "حفظ"، ثم "التصدير" إلى ملف .csv لتصدير كميات من جميع الآبار في الشركة المصرية للاتصالاتملف XT التي تحتوي على قيم مفصولة بفواصل.
    3. استيراد the.csv الملف في برنامج جداول البيانات وحساب عدد TRECs أو KRECs في 10 6 PBMC من خلال وضع الصيغة التالية بشكل مناسب: [(يعني كمية من TRECs أو KRECs) / (يعني كمية من TCRAC / 2)] × 10 6
      ملاحظة: كمية متوسطة من TCRAC ومقسوما على 2 لأنه في كل خلية هناك نسختين TCRAC الجينات، على سبيل المثال، واحد لكل كروموسوم.
      ملاحظة: اتساق العدد النهائي للTRECs وKRECs السيطرة الإيجابية قد اعتبار، ولكن نأخذ في الاعتبار أن القيم لا تتطابق تماما بسبب تقلب المضافة للنقاط منحنى التخفيف القياسية. في حال الاختلاف الإجمالي، قد تحتاج التجربة أن تتكرر. مرة أخرى، قد تكون مبنية مخططات السيطرة على وضع مجموعة مرجعية المناسب.
    4. (اختياري، لكن موصى به) إذا هي نتائج تعداد الدم الكامل المتاحة، وحساب TRECs أو KRECs لكل مل من الدم باستخدام الصيغة التالية:
      TRECs أو KRECs لكل 1 × 10 6) س (الخلايا اللمفاوية + الوحيدات الاعتماد في 1 مل من الدم) / 10 = 6 نسخة / مل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم إجراء الفحص في عينة تمثيلية من 87 الاصحاء: 42 طفلا تتراوح أعمارهم بين 0-17 (ذكور / إناث: 25/17) و 45 البالغين الذين تتراوح أعمارهم بين 24-60 (ذكور / إناث: 29/16). وقد تم الحصول على نتائج TRECs وKRECs في 10 6 PBMC، ثم TRECs وKRECs لكل مل من الدم وحسبت.

عدد T...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

TREC and KREC quantification can be considered a good estimate of recent thymic and bone marrow output provided that some caveats are taken into account. Even though an absolute quantification method employing standard curve requires more reagents and more space on the real-time PCR reaction plate, it ensures highly accurate quantitative results because unknown sample quantities are interpolated from standard curves built upon known amounts of starting material. Moreover this method is better fitted to detect low amount ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors have no acknowledgements.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Histopaque-1077Sigma Aldrich SRL10771-500 MLdensity gradient separation method
QIAamp DNA Blood Mini Kit (250)QIAGEN51106DNA extraction
Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmolEurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l Resuspend the lyophilized product to 100 pmol/µl
AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25 mM MgCl2Applied Biosystems/Life-TechnologiesN8080156
GeneAmp dNTP Blend (100 mM)Applied Biosystems/Life-TechnologiesN8080261
TOPO TA Cloning Kit for SubcloningInvitrogen/Life-TechnologiesK4500-01
XL1-Blue Subcloning Grade Competent CellsStratagene200130
PureYield Plasmid Miniprep SystemPromegaA1223
SpeI 500UNew England BiolabsR0133S
HindIII-HF 10,000 UNew England BiolabsR3104S
PureYield Plasmid Midiprep SystemPromegaA2492
XhoI 5,000 UNew England BiolabsR0146S
TRIS UtrapureSigma Aldrich SRLT1503
EDTASigma Aldrich SRLE5134
TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA)
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems/Life-Technologies4364338
Dual labeled probes HPLC 0.01 mmolEurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l Resuspend the lyophilized product to 100 pmol/µl
NanoDrop 2000c spectrophotometerThermoFisher
Applied Biosystems 2720 Thermal CyclerApplied Biosystems/Life-Technologies4359659
Fast 7500 Real-Time PCR systemApplied Biosystems/Life-Technologies
SDS Sequence Detection Software 1.4Applied Biosystems/Life-Technologies

References

  1. Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
  2. Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).
  3. Fronkova, E., et al. B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL. Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).
  4. Sottini, A., et al. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation. Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).
  5. Serana, F., et al. Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency. J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).
  6. Zanotti, C., et al. Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis. J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).
  7. Zanotti, C., et al. Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients. Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).
  8. Sottini, A., et al. Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient. PLoS One. 7, e34493(2012).
  9. Quiros-Roldan, E., et al. Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients. J. Transl. Med. 10, 94(2012).
  10. Mensen, A., et al. Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J. Transl. Med. 11, 188(2013).
  11. Serana, F., et al. The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency. J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).
  12. Borte, S., et al. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).
  13. Baker, M. W., et al. Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin's newborn screening program. Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).
  14. Lorenzi, A. R., et al. Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method. J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).
  15. De Boer, R. J., Perelson, A. S. Quantifying T lymphocyte turnover. J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

94 B PCR T

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved