La cuantificación simultánea de T-Cell Círculos Receptor Excision (TRECs) y Círculos K-Eliminación recombinación Excision (KRECs) por PCR en tiempo real

Resumen

Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.

Resumen

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/10⁶ cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.

Introducción

Círculos de escisión del receptor de células T (TRECs) y círculos de escisión recombinación K-borrar (KRECs) son pequeños elementos de ADN circularized que son extirpados en una proporción de las células B, respectivamente, T y durante un proceso de recombinación de ADN genómico, lo que lleva a la formación de un repertorio altamente diversificada de T y receptores de células B. No tienen ninguna función, sino porque son estables y no se pueden replicar, se diluyen después de cada división celular, que persiste por tanto, sólo en una de las dos células hijas. Por lo tanto, sus niveles en la sangre periférica se puede asumir como una estimación de la salida de la médula tímica y el hueso.

Si bien el ensayo TREC se ha utilizado ampliamente en los últimos 15 años para evaluar la magnitud de la producción del timo, ¹ ensayo FREC, que fue desarrollado inicialmente para medir la proliferación de células B y su contribución a la homeostasis de las células B en la salud y la enfermedad, ² sólo recientemente ha sido propuesto como un marcador de hueso mflecha de salida. ^3,4 A continuación, describimos el método que hemos desarrollado para la cuantificación simultánea de ambos TRECs y KRECs. ⁴

Con este método combinado, la variabilidad asociada a la cuantificación de ADN por PCR en tiempo real se elimina mediante el uso de una curva estándar único obtenido por dilución de un plásmido de triple inserto que contiene fragmentos de TRECs, KRECs y de las células T del receptor alfa constante (TCRAC) gen en una proporción de 1: 1: 1. Esto permite una evaluación más precisa del número de copias TREC y FREC. Además, la cuantificación simultánea de los dos objetivos en la misma reacción permite la reducción de costes de reactivos.

El ensayo TREC / FREC propuesto puede ser útil para medir el grado de células T y B neo-producción en niños o adultos con inmunodeficiencia combinada severa (SCID), ⁴ Inmunodeficiencia Común Variable, ⁵ enfermedades autoinmunes, ^6-8 y la infección por VIH . ⁹ Además, se puede utilizar paracontrolar la recuperación inmune después del trasplante de células madre hematopoyéticas, ¹⁰ de reemplazo enzimático, ¹¹ y ⁹ antiviral o inmunomoduladores terapias. ^6-8 Finalmente, porque los pacientes SCID se reconocen usando el ensayo de TREC a pesar de los defectos genéticos subyacentes, y agammaglobulinemia pacientes pueden identificarse utilizando la cuantificación FREC , el ensayo TREC / FREC puede también ser utilizado para detectar inmunodeficiencias en programas de cribado neonatal. ¹² En este caso, la prueba debe ser realizada en ADN extraído de pequeñas manchas de sangre borrado y se seca sobre papel de filtro, debe ser altamente sensible y específica para las enfermedades objeto, así como altamente reproducible y rentable.

La introducción de FREC cuantificación en la prueba debería mejorar el rendimiento de cribado neonatal para inmunodeficiencias, que habitualmente se ha realizado en las algunas partes de los EE.UU. (WI, MA, CA) desde 2008, cuando se convirtió en Wisconsin el primero en Introde el análisis de TRECs en su programa de detección postnatal. ¹³

Protocolo

Declaración de Ética: NOTA: Este protocolo sigue las directrices de nuestra institución, el Spedali Civili di Brescia

1. Elaboración de un "Triple-Insertar" plásmido

1. Selección y preparación de material de partida apropiado:
   1. Obtener una muestra que contiene células muy susceptibles de tener TRECs y KRECs detectable por PCR, tal como sangre periférica de un sujeto sano joven recogido en tubos de EDTA.
      NOTA: En un principio, se había desarrollado el método que utiliza para TRECs timocitos y células mononucleares a partir de fragmentos de amígdalas para KRECs, pero sujetos sanos por lo general tienen una cantidad de TRECs y KRECs suficientes para permitir su detección por PCR. Por lo tanto, la sangre periférica debe ser una alternativa válida, más fáciles de obtener y trabajar con ellos. Teniendo en cuenta que TRECs, en particular, disminuyen con la edad en adultos sanos, la sangre periférica de un adulto joven, si no de niños, se aconseja.
   2. Independiente mononuc sangre periféricacélulas Lear (PBMC) por un método de separación en gradiente de densidad estándar.
2. Extracción de ADN:
   1. Extraer ADN de PBMC utilizando un DNA Blood Mini Kit comercial. Siga las instrucciones del fabricante con las pocas modificaciones siguientes.
      1. Incubar las muestras a 70 ° C (en lugar de 56 ° C) durante 10 minutos usando un agitador-incubador a 1400 rpm.
      2. Añadir el tampón de elución calentado a 70 ° C a la columna, incubar durante 5 min a 70 ° C y eluir el ADN por centrifugación según las instrucciones del fabricante. Determinar la concentración de ADN extraído por la estimación espectrofotométrica a 260/280 nm.
3. Preparación de un plásmido que contiene los insertos de articulaciones TREC y Krec de señal (SJ) y gen de referencia TCRAC:
   1. Amplificar el ADN extraído de PBMC (para obtener el TREC-SJ, FREC-SJ, y fragmentos TCRAC) con cebadores específicos para TRECs, KRECs y TCRAC (ver Tabla 1).
      NOTA: En el extremo 5 ', los cebadores KREC- y TCRAC específicos contienen sitios de restricción HindIII y SpeI (en minúscula las secuencias mostradas en la Tabla 1) con un número apropiado de flanqueo nucleótidos adicionales (indicado en cursiva); ambas características no están presentes en las secuencias canónicas KRec y TCRAC.

TRECs	adelante	5'-AAA GAG GGC AGC CCT CTC CAA GGC-3 '
	marcha atrás	5'-GGC TGA TCT TGT CTG ACA TTT GC-3 '
KRECs	adelante	5'-AAG CCC ctt TCA GCG CCC ATT ACG TTT CT-3 '
	marcha atrás	5'-AAG CCC ctt GTG AGG GAC ACG CAG CC-3 '
TCRAC	adelante	5'-G etiqueta ac TAT GAG CAC GTG ACTTGC CAG-3 '
	marcha atrás	5'-G etiqueta ac TGC TGT TGT TGA AGG CGT TTG C-3 '

Tabla 1. Los cebadores utilizados para los procedimientos de clonación. En el extremo 5 ', en minúsculas se muestran los nucleótidos correspondientes a los sitios de enzimas de restricción, mientras que en itálicas se muestran añadido que flanquea nucleótidos.

3. 2. Realizar las reacciones de PCR en un volumen final de 25 l, que consta de 1x Buffer II, 1,5 mM de MgCl _2, mezcla de dNTP (200 mM cada uno), cebadores a la concentración final de 900 nM, AmpliTaq ADN polimerasa (2,5 U / 25 l), y 100 ng de ADN.
   3. Utilice los siguientes parámetros de PCR: primera etapa a 95 ° C durante 10 min, seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 30 s; 60 ° C durante 30 s; 72 ° C durante 30 segundos, y finalmente 1 ciclo de 72 ° C durante 10 min. Longitudes de productos PCR deben ser: 380 pb para TRECs, 166 pb para KCER, 381 pb para TCRAC.
   4. Inserte el producto de PCR de TREC-SJ en el sitio aceptor TA de la pCR2.1-TOPO vector. Transformar el ADN plásmido en células XL1-azul químicamente competentes por choque térmico siguiendo el protocolo proporcionado con las células. Entre las colonias que crecen debido a la resistencia a la ampicilina, identificar los portadores del inserto, que aparecerá en blanco debido a perdido complementación β-galactosidasa, e inocular ellos en un plato principal. Finalmente, identificar las colonias que contienen el fragmento TREC por PCR.
   5. Expandir una de las colonias identificadas y purificar el ADN de plásmido usando un kit miniprep de plásmido y seguir las instrucciones del fabricante. Digerir el DNA plásmido y el producto amplificado TCRAC con enzima de restricción SpeI y se liga el fragmento TCRAC en el sitio de restricción SpeI.
   6. Transformar el ADN de plásmido en células XL1-azul e identificar las colonias que contienen el fragmento TCRAC por PCR. Expandir una de las colonias identificadas y purificarel ADN del plásmido utilizando el kit de plásmido miniprep.
   7. Digerir el DNA plásmido y el producto FREC amplificado con HindIII y clonar el fragmento FREC-SJ en el sitio de restricción HindIII. Transformar el ADN de plásmido en células XL1-azul e identificar las colonias que contienen el tercer fragmento por PCR.
   8. Verificar, por secuenciación directa, la presencia de los tres insertos y la ausencia de mutaciones. El mapa del plásmido de triple inserción final se representa en la Figura 1.

Figura 1. Triple-inserto plásmido mapa. Triple-insert mapa del plásmido que muestra la posición de las secuencias de TREC, KRec, TCRAC y sitios de enzimas de restricción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. 9. Expandir una de las colonias identificadas, purificar el ADN de plásmido usando un kit de plásmido midiprep. Determinar la concentración de ADN plásmido por estimación espectrofotométrica a 260/280 nm y la calidad del ADN por electroforesis en gel. Almacenar alícuotas apropiadas del plásmido a -80 ° C (por ejemplo., 50 l cada uno).

2. Preparación de la curva estándar

NOTA: Prepare todas las diluciones en tampón TE 0,1x en un lugar especialmente diseñado para la contención de ADN arrastre.

1. Calcula la masa de los números de copias del plásmido de interés (ver Tabla 2), teniendo en cuenta que el tamaño del plásmido es 4846 pb y que la masa media por pb es 1.096 x 10 ^-21 g / pb, y por lo tanto: m _p = ( 4846 bp) x (1,096 x 10 ^-21 g / bp) = 5,311.216 x 10 ^-21 g = 5,311 x 10 ^-18 g.

Copia #	x 5.311 x 10 -18 g	Masa de ADN plásmido (g)
1 x 10 6		5.311 x 10 -12
1 x 10 5		5.311 x 10 -13
1 x 10 4		5.311 x 10 -14
1 x 10 3		5.311 x 10 -15
1 x 10 2		5.311 x 10 -16

Tabla 2. Masa de plásmido necesario para cada punto de dilución curva estándar.

2. Calcular las concentraciones de ADN de plásmido dividiendo las masas de plásmidos necesarios por el volumen (5 l) se debe verter en cada reacción (véase la Tabla 3).

Masa de ADN plásmido (g)	÷ 5 l	La concentración final de ADN plásmido (g / l)
5.311 x 10 -12		1,062 x 10 -12
5.311 x 10 -13		1.062 x 10 -13
5.311 x 10 -14		1.062 x 10 -14
5.311 x 10 -15		1.062 x 10 -15
5.311 x 10 -16		1.062 x 10 -16

Tabla 3. Cálculo de las concentraciones de plásmidos necesarios para cada punto de dilución.

3. Descongelar una alícuota del plásmido. Linealizar 2 g de ADN plásmido con XhoI y determinar la concentración bestimación espectrofotométrica y a 260/280 nm.
4. Preparar una dilución apropiada del ADN plásmido linealizado con el fin de lograr una conveniente solución madre de trabajo para comenzar a partir de (por ejemplo, 100 ng / l = 0,1 g / l = 1 x 10 ^-7 g / l). Almacenar el resto del ADN de plásmido linealizado a -80 ° C.
5. Realizar un número conveniente de 1:10 o 1: 100 diluciones para llevar el plásmido a la concentración más viable de 1 x 10 ^-10 g / l.
6. Usa la fórmula C ₁ V ₁ = C _{2 2} V para calcular el volumen de dilución (V ₂ - V ₁₎ necesaria para preparar el primer punto de la serie curva estándar (1 x 10 ⁶ copias, correspondiente a 1,062 x 10 ^-12 g / 5 l; ver Tabla 4).

Conc inicial. (G / l)	Vol ADN plásmido (l)	Diluent vol (l)	Vol Final. (L)	Conc. (G / l)	Número de copias final de ADN de plásmido / 5μl
C 1	V 1	V 2 -V 1	V 2	C 2
1 x 10 -7	5 l	45 l	50 l	1 x 10 -8	N / A
1 x 10 -8	5 l	495 l	500 l	1 x 10 -10	N / A
1 x 10 -10	5 l	465 l	470 l	1,062 x 10 -12	1 x 10 6
1,062 x 10 -12	50 l	450 l	500 l	1.062 x 10 -13	1 x 10 5
1.062 x 10 -13	50 l	450 l	500 l	1.062 x 10 -14	1 x 10 4
1.062 x 10 -14	50 l	450 l	500 l	1.062 x 10 -15	1 x 10 3
1.062 x 10 -15	50 l	450 l	500 l	1,062 x 10- 16	1 x 10 2

Tabla 4. cálculos de dilución.

7. Proceda con una serie regular de diluciones 1:10 de obtener los puntos de la curva estándar restantes.
   NOTA: No se olvide de vórtice cada dilución plásmido brevemente antes de realizar la siguiente.
   NOTA: La mayor dilución del standard curva (10 copias / 5 l) debe prepararse justo antes de realizar el ensayo, ya que una pequeña cantidad de ADN plásmido tal no es lo suficientemente estable para ser almacenado para un uso futuro.
8. Almacenar los puntos de dilución triple de plásmido a -80 ° C en tubos separados hasta su uso. El ADN de triple plásmido diluido es altamente estable durante al menos 6 meses.

3. Extracción de ADN a partir de muestras objetivo

1. Independiente PBMC de la sangre periférica se recogió en tubos de EDTA utilizando el método de separación en gradiente de densidad.
   NOTA: También puede utilizar otro material de partida apropiado (por ejemplo, ordenados subpoblaciones de linfocitos, sangre entera) como muestra objetivo.
2. Extraer el ADN de PBMC de muestras objetivo como se informó en el paso 1.2.

4. PCR en tiempo real para la cuantificación de TRECs y KRECs

1. Preparación de la placa y de carga:
   1. Organizar una placa de PCR incluyendo al menos dos réplicas para cada muestrasa analizar: curva estándar (A → F 1 → 4), control positivo ⁽⁺ CTRL; G1 → 4) y no-plantilla de control (NTC; H 1 → 4).
      NOTA: Observar un esquema típico en la Tabla 5, pero diferentes formatos se pueden crear. Recuerde que TRECs y KRECs se amplificarán juntos en los mismos pozos y distintos de los de TCRAC.

	TRECs + KRECs un		TCRAC b		TRECs + KRECs		TCRAC		TRECs + KRECs		TCRAC
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
La	10 6 copias	10 6 copias	10 6 copias	10 6 copias	1	1	1	1	9	9	9	9
B	10 5 copias	10 5 copias	10 5 copias	10 5 copias	2	2	2	2	10	10	10	10
C	10 4 copias	10 4 copias	10 4 copias	10 4 copias	3	3	3	3	11	11	11	11
D	10 3 copias	10 3 copias	10 3 copias	10 3 copias	4	4	4	4	12	12	12	12
E	10 2 copias	10 2 copias	10 2 copias	10 2 copias	5	5	5	5	13	13	13	13
F	10 copias	10 copias	10 copias	10 copias	6	6	6	6	14	14	14	14
G	CTRL +	CTRL +	CTRL +	CTRL +	7	7	7	7	15	15	15	15
H	NTC	NTC	NTC	NTC	8	8	8	8	16	16	16	16

Tabla 5. Muestra en tiempo real placa de PCR.

1. 2. Calcular el número total de pozos necesarios (incluya 1-2 pozos adicionales para tener en cuenta los posibles errores de pipeteo) y preparar la mezcla maestra para TRECs / KRECs y TCRAC en tubos separados (ver Tabla 6).
      NOTA:. Los cebadores y sondas específicas para TRECs, KRECs y TCRAC se mencionan en la Tabla 7 El cebador y la sonda concentraciones finales son 900 nm y 200 nm, respectivamente.

TRECs / KRECs		TCRAC
H 2 O	2 l	H 2 O	4,75 l
KRECs de 20 pmol / l	1.125 l	TCRAC de 20 pmol / l	1.125 l
KRECs rev 20 pmol / l	1.125 l	TCRAC rev 20 pmol / l	1.125 l
Sonda KRECs 10 pmol / l	0,5 l	Sonda TCRAC 10 pmol / l	0,5 l
TRECs de 20 pmol / l	1.125 l	2x TaqMan PCR Universal Master Mix	12,5 l
TRECs rev 20 pmol / l	1.125 l
Sonda TRECs 10 pmol / l	0,5 l
2x TaqMan PCR Universal Master Mix	12,5 l

Tabla 6. Volumen de reactivos necesarios para los pocillos indicadas.

TRECs	adelante	5'-CAC ATC CCT TTC AAC CAT GCT-3 '
	marcha atrás	5'-TGC AGG TGC CTA TGC ATC A-3 '
	sonda	5'-FAM-ACA AAC CTG GTT TTT GTA AAG GTG CCC ACT-TAMRA-3 '
KRECs	adelante	5'-CTT TCC AGT GGC ATT ATT TGT ATC ACT-3
	marcha atrás	5'-AGG AGC CAG CTC TTA CCC TAG AGT-3 '
	sonda	5'-HEX-TCT GCA CGG GCA GCA GGT TGG-TAMRA-3
TCRAC	adelante	5'-TGG AAC AAC AAC GAT CCT CTT-3 '
	marcha atrás	5'-GGA TTT AGA GTC TCT CAG CTG GTA CAC-3
	sonda	5'-FAM-TCC CAC AGA TAT CCA GAA CCC TGA CCC-TAMRA-3 '

Tabla 7. Secuencia de imprimación y sondas para la PC en tiempo realR ensayo.

1. 3. Añadir 20 l de cada mezcla (TRECs / KRECs y TCRAC). Antes de salir de la sala de preparación de reactivos, sellar la placa de reacción con una cubierta adhesiva óptica.
   4. En una sala de extracción de ácido nucleico, levantar la cubierta del adhesivo y añadir 5 l de muestra de ADN genómico (400 a 500 ng) a los pocillos. Añadir 5 l de ADN genómico (es decir, preparado a partir de PBMC obtenida a partir de la sangre del cordón umbilical) a los pocillos CTRL ^+.
      NOTA: Como alternativa a la sangre del cordón umbilical, usar el ADN de la misma, muestra conocida positiva de sangre periférica o en la piscina de muestras, o preparar un estándar positivo "artificial" mediante la mezcla de una cantidad determinada de plásmido de triple inserto con el ADN genómico de TREC- y líneas celulares FREC-negativos.
   5. Añadir 5 l de agua a los pocillos NTC. Sellar la placa de reacción de nuevo con la cubierta adhesiva óptica.
   6. Mover a un lugar asegurar la contención de ADN plásmido arrastre; descongelar cada poin diluciónt de la curva estándar de ADN plásmido sólo antes de su uso y preparar la dilución más alta (10 copias / 5 l). Levante la cubierta adhesiva sólo de A → H 1 → 4 pozos y añadir 5 l de cada dilución punto de curva estándar de ADN plásmido. Selle la cubierta adhesiva de nuevo.
   7. Verificar la ausencia de burbujas en el fondo de los pozos, lo que garantiza que los reactivos se colocan en la parte inferior.
   8. Ejecutar el ensayo en un sistema de PCR en tiempo real. El protocolo estándar consta de primera etapa a 50 ° C durante 2 min, un calentamiento inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido por 45 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 15 seg, y un cebador / sonda combinada de recocido y alargamiento a la 60 ° C durante 1 min.
   9. Guarde los datos al final del programa de PCR.
      NOTA: Para evitar la contaminación cruzada de ADN, recuerde: a seguir las recomendaciones buenas prácticas de laboratorio habituales para PCR cuantitativa al configurar el tiempo real el ensayo de PCR: utilizar zonas / habitaciones separadas para la extracción de ácidos nucleicos,la preparación de reactivo, manipulación plásmido, reacción de amplificación; utilizar conjuntos de pipeta distintas; cambiar guantes / abrigos según corresponda.
2. Resultados y cálculo:
   NOTA: Los siguientes pasos se basan en nuestra experiencia en el uso del software suministrado con el instrumento de PCR en tiempo real se menciona en la Tabla de materiales, pero, en general, deben aplicarse a otros en tiempo real plataformas de análisis de PCR y softwares. Tenga en cuenta que, incluso si se utiliza el mismo software, por lo general hay más de una manera de ejecutar los comandos necesarios (por ejemplo, iconos, accesos directos).
   1. Abra el archivo resultado guardado en el software y haga clic en la pestaña "Resultados". En la parte superior de la ventana, haga clic en el menú "Análisis" y seleccione "Configuración de análisis". Deje que el software determine el umbral de manera automática al seleccionar "Todos" los detectores y (Ct = ciclo umbral "Auto Ct". Deje que el software "Línea base automática"; para el fondo eliminación por defecto.
   2. Haga clic en la pestaña llamada "Amplificación Plot" y, en la parte derecha de la ventana, seleccione una de las tres "detectores" en el menú desplegable correspondiente (por ejemplo, comenzar con TRECs). Justo debajo, seleccione "Manual Ct" para configurar manualmente un umbral; ir a la parte inferior de la ventana y seleccione los pocillos correspondientes a los puntos de dilución curva estándar del detector elegido para mostrar las gráficas de amplificación. Para ello basta con hacer clic y arrastrar el ratón sobre las celdas correspondientes de la tabla.
      1. Para ajustar el umbral manualmente, arrastre la línea umbral rojo arriba y abajo, y luego haga clic en "Analizar" para volver a analizar los resultados. Para comprobar cómo se fija el umbral afecta a los resultados, seleccione la ficha "Informe", y ver la Ct resultante de los respectivos puntos de dilución curva estándar. Al mover el umbral, tratar de cumplir con las siguientes recomendaciones para conseguir una colocación óptima.
      2. Volver a la ficha "Gráfico de amplificación" y verifique que el umbral está en una región de amplificación exponencial suficientemente por encima del ruido de fondo, pero por debajo de la fase de meseta. Si el gráfico de amplificación no se muestra en escala logarítmica, haga clic en el complot para recordar la "Configuración de gráficos" y establecer configuración post correr del eje Y como "log", establezca la mitad del camino umbral en la parte lineal de la la trama, y ​​observar las curvas de amplificación aproximadamente paralelas entre sí.
      3. Haga clic en la ficha "Informe" para ver los resultados de Ct. Asegúrese de que la colocación umbral produjo resultados que maximizan la precisión de las dos repeticiones de cada punto de la curva de dilución estándar.
      4. Compruebe que el umbral se sitúa en el punto que mejor refleja las órdenes extremas de magnitud de los puntos de dilución curva estándar (sensibilidad óptima). Repita el paso 4.2.2 y restantes pasos secundarios para los dos detectores restantes (KRECs y TCRAC).
      5. Ir a la ficha Informe, arrastre el ratón de nuevo en la mesa en la parte inferior de la ventana para seleccionar las casillas correspondientes a los pocillos de la curva estándar para todos los detectores (TRECs, KRECs, TCRAC). Verifique que el Ct resultante de los tres objetivos es muy similar en los mismos puntos de dilución (por ejemplo, la diferencia de no más de 0,5 Ct). Vuelva a ajustar los umbrales si es necesario y volver a comprobar.
         NOTA: Debido a que el plásmido de triple inserción contiene una sola copia de cada objetivo y, por tanto, la relación de amplificación teóricamente debería estar cerca de 1: 1: 1. En algunos casos, puede ser necesario ajustar manualmente también la línea de base para uno o más de los detectores para obtener mejores resultados. Sólo recordar la ventana "Configuración de análisis", seleccione el detector para el que se necesita el ajuste, a continuación, "Manual de línea de base", e introduzca valores personalizados para el Inicio y Ciclos finales (generalmente de 3 a 15). Luego haga clic en "OK y Volver a analizar" y vuelva a comprobar los puntos anteriores.
   3. Acepte la sesión experimental sin haber comprobado lo siguiente:
      1. Haga clic en la ficha "Informe", vaya a la parte inferior de la ventana, seleccione pozos NTC y compruebe que el Ct correspondiente es "UNDET" (es decir, no hay amplificación está presente en pozos NTC).
      2. Seleccione la pestaña "curva estándar" y mirar a la derecha de la ventana de dibujo; seleccione los detectores en el menú desplegable y ver si la pendiente de la curva estándar reportado oscila entre -3,55 y -3,32 (correspondiente a la PCR eficiencia de 91 - 100%)
      3. Asegúrese de que el coeficiente de determinación ^(R2) es superior a 0,998 (Figura 2), mediante la lectura de su valor justo por debajo de la pendiente y la intersección (en la misma pestaña "curva estándar", después de seleccionar cada detector).
         NOTA: Preste atención a los puntos de dilución extremas porque su desalineación puede afectar a la pendiente con mayor facilidad (tienen una alta leve "efecto rabia "en la línea de regresión). En particular, tenga en cuenta que la mayor dilución plásmido puede degradarse antes de lo esperado. Sin embargo, siempre que sea posible, es útil para no desprenderse de ellos, debido a que un enfoque racional puede ser considerar 100 como el límite de detección cuantitativa: en otras palabras, para muestras de entre 10 y 100, el resultado puede ser reportado como <100 o "positivo , pero no cuantificable ", mientras que si fuera del rango de la curva (<10) puede ser reportado como 0 o" indetectable ".
         NOTA: Puede ser útil para mantener un archivo de los valores de Ct de diluciones curva estándar anteriores, a fin de calcular un valor medio para cada punto de dilución para mantenerse como una especie de rango óptimo "de referencia" o verificación de calidad interno para futuros experimentos (por ejemplo, el cálculo de la media y SD para gráficos de control Shewhart construir). Análogamente, puede ser útil para mantener un archivo del pasado Ct del control positivo.

Figura 2. Las curvas de calibración para TRECs, KRECs y TCRAC. Parcelas de los puntos de la curva estándar y la línea de regresión log-estima para TRECs (A), KRECs (B), y TCRAC (C) se construyen para verificar el cumplimiento de la exponencial ideales tasa de amplificación (pendiente = 3,32) que correspondería a una eficiencia del 100%. Ct: ciclo umbral; ^R2:. Coeficiente de regresión de la determinación Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. 3. 4. Haga clic en la ficha "Informe" y verifique que el Ct del control positivo (que se encuentra en las celdas correspondientes de la tabla bajo el diagrama) es consistente con los resultados de los ensayos anteriores sobre la same conozcan control positivo.
         NOTA: La ficha "Informe" muestra la cantidad de TRECs, KRECs y TCRAC de las muestras está probando que el software ha calculado por interpolación de la curva estándar respectivo, utilizando los valores de Ct obtenidos tras el umbral de la línea de base y se han establecido correctamente (un nuevo análisis con un nuevo umbral / línea de base cambiaría estos resultados). Para ver dónde la interpolación se lleva a cabo en la curva estándar, seleccione la pestaña "curva estándar", a continuación, seleccione los pozos deseados, y buscar el negro "X" que aparece en la línea de regresión. Su valor eje y es la cantidad interpolado. Si se utiliza siempre el mismo control positivo, los valores de referencia apropiados y / o gráficos de control de calidad se pueden construir, en base a los valores previos determinados en el control positivo.
   4. Haga clic en el menú "Archivo", "Guardar", y luego "Exportar" para un archivo .csv para exportar las cantidades de todos los pozos en una text archivo que contiene valores separados por comas.
   5. Importar the.csv archivo en un software de hoja de cálculo y calcular el número de TRECs o KRECs por 10 ⁶ PBMC estableciendo la siguiente fórmula adecuada: [(cantidad de TRECs o KRECs media) / (cantidad de TCRAC / 2 significa)] x 10 ⁶
      NOTA: La cantidad media de TCRAC se divide por 2, porque en cada celda hay dos copias de genes TCRAC, por ejemplo, uno para cada cromosoma.
      NOTA: La consistencia del número final de TRECs y KRECs de control positivo puede ser considerado, pero tenga en cuenta que los valores no serán perfectamente coincidir debido a la variabilidad añadido de los puntos de dilución curva estándar. En caso de divergencia grave, puede ser necesario repetir el experimento. Una vez más, los gráficos de control pueden ser construidos para establecer un rango de referencia apropiado.
   6. (Opcional, pero recomendado) Si los resultados del hemograma completo están disponibles, calcular los TRECs o KRECs por ml de sangre utilizando la siguiente fórmula:
      TRECs o KRECs por 1 x 10 ⁶⁾ x (linfocitos + monocitos cuentan en 1 ml de sangre) / 10 = ⁶ copias / ml.

Resultados

El ensayo se realizó en una muestra representativa de 87 controles sanos: 42 niños de entre 0 a 17 (hombres / mujeres: 25/17) y 45 adultos de 24 años - 60 (machos / hembras: 29/16). Los resultados fueron obtenidos como TRECs y KRECs por 10 ⁶ PBMC, y luego los TRECs y KRECs por ml de sangre fueron calculados.

El número de TRECs disminuye con la edad debido a la involución tímica, ^4, en particular, de una manera muy aguda de 0 a 3 - 4 años. En los adultos, el núme...

Discusión

TREC and KREC quantification can be considered a good estimate of recent thymic and bone marrow output provided that some caveats are taken into account. Even though an absolute quantification method employing standard curve requires more reagents and more space on the real-time PCR reaction plate, it ensures highly accurate quantitative results because unknown sample quantities are interpolated from standard curves built upon known amounts of starting material. Moreover this method is better fitted to detect low amount ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Histopaque-1077	Sigma Aldrich SRL	10771-500 ML	density gradient separation method
QIAamp DNA Blood Mini Kit (250)	QIAGEN	51106	DNA extraction
Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol	Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l		Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl
AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25mM MgCl2	Applied Biosystems/Life-Technologies	N8080156
GeneAmp dNTP Blend (100 mM)	Applied Biosystems/Life-Technologies	N8080261
TOPO TA Cloning Kit for Subcloning	Invitrogen/Life-Technologies	K4500-01
XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells	Stratagene	200130
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1223
SpeI 500U	New England Biolabs	R0133S
HindIII-HF 10,000 U	New England Biolabs	R3104S
PureYield Plasmid Midiprep System	Promega	A2492
XhoI 5,000 U	New England Biolabs	R0146S
TRIS Utrapure	Sigma Aldrich SRL	T1503
EDTA	Sigma Aldrich SRL	E5134
TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA)
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems/Life-Technologies	4364338
Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol	Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l		Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl
NanoDrop 2000c spectrophotometer	ThermoFisher
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler	Applied Biosystems/Life-Technologies	4359659
Fast 7500 Real-Time PCR system	Applied Biosystems/Life-Technologies
SDS Sequence Detection Software 1.4	Applied Biosystems/Life-Technologies