T-hücre reseptörleri Eksizyon Circles Eşzamanlı Niceleme (TREC) ve K-silme Rekombinasyon Eksizyon Circles (KRECs) Gerçek zamanlı PCR ile

Özet

Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.

Özet

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/10⁶ cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.

Giriş

T-hücresi reseptör eksizyon daire (TREC) ve K-silme rekombinasyon eksizyon daire (KRECs), genomik bir DNA yeniden birleştirme işlemi sırasında T ve sırasıyla A, B-hücreleri, bir oranda kesilmiş küçük daireselleşmiş DNA elemanları vardır giden Bir çok çeşitlendirilmiş T- repertuarına ve B-hücre reseptörleri oluşumu. Onlar hiçbir işlevi var, ama onlar kararlı ve taklit edilemeyen, çünkü onlar, böylece sadece iki kızı hücrelerin birinde ısrar, her hücre bölünmesinde sonra sulandırılır. Bu nedenle, periferik kandaki düzeylerinin timus, kemik iliği çıkışı bir tahmini olarak kabul edilebilir.

TREC tahlil ölçüde timik çıktı kapsamını değerlendirmek için son 15 yılda kullanılmış olsa da, başlangıçta geliştirilen ¹ Krec deneyi, B-hücresi çoğalmasını ve sağlık ve hastalık B-hücresi homeostasisin katkılarını, ² ölçmek için ancak son zamanlarda kemik m marker olarak önerilmiştirçıktı ok. ^3,4 Burada, biz TREC ve KRECs hem eşzamanlı ölçümü için geliştirilen yöntem açıklanmaktadır. ⁴

Bu kombine yöntem ile, gerçek zamanlı PCR ile DNA miktar ile ilişkili değişkenlik TREC, KRECs ve T-hücresi reseptörü alfa sabit fragmanlarını ihtiva eden bir üç-uç plazmid seyreltilmesi ile elde edilen eşsiz bir standart eğri kullanımı (TCRAC) ile ortadan kaldırılır 1: 1 oranında bir 1 geni. Bu TREC ve Krec kopya sayısında daha doğru bir değerlendirme sağlar. Ayrıca, aynı reaksiyonda iki hedef aynı anda miktar reaktif maliyet azalmasını sağlar.

Önerilen TREC / Krec tahlil Şiddetli kombine immün yetmezlik (SCID), ⁴ Ortak Değişken İmmün Yetmezlik, ⁵ otoimmün hastalıklar, ^6-8 ve HIV enfeksiyonu olan çocuklarda veya yetişkinlerde T- kapsamını ve B-hücresi neo-üretim ölçmek için yararlı olabilir . ⁹ Ayrıca, için kullanılabilirHastalar Krec kantifikasyonunu kullanılarak tespit edilebilir agamaglobülinemı SCID hastalarda altta yatan genetik bozukluklara rağmen TREC testi kullanılarak tanınan, çünkü Sonunda. ^6-8 hematopoetik kök hücre nakli, ¹⁰ enzim replasmanı, ¹¹ ve antiviral ⁹ veya bağışıklık tedaviler sonrasında bağışıklık ayilmanizi, ve , TREC / Krec deneyi de doğan tarama programlarına immün yetersizlikler tespit etmek için de kullanılabilir. Bu durumda, ^12, test kan lekelenir küçük noktalar ekstre DNA üzerinde yapıldığında ve filtre kağıdı üzerinde kurutuldu gerekir, son derece hassas ve spesifik olmalıdır Hedef hastalıklar yanı sıra, oldukça üretilebilir ve maliyet-etkin bir.

Wisconsin introduc ilk olunca test Krec miktar giriş rutin 2008 yılından bu yana ABD (WI, MA, CA) bazı bölgelerinde yapılmıştır immün için yenidoğan tarama, performanslarını artırmak gerekironun doğum tarama programında TREC e analizi. ¹³

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: Etik bildirimi: Bu protokol, bizim kurum, Spedali Civili di Brescia yönergeleri takip

Bir "Üç-Ekle" Plasmidinin 1. Hazırlık

1. Seçim ve uygun başlangıç ​​malzemesinin hazırlanması:
   1. EDTA tüpleri içine toplanan bir genç, sağlıklı konunun periferik kan gibi PCR ile saptanabilir TREC ve KRECs olması çok muhtemel hücreleri içeren bir örnek alın.
      NOT: Başlangıçta, biz KRECs için bademcik parçalardan TREC ve mononükleer hücreleri için timositleri kullanarak yöntemi geliştirmişti, ama sağlıklı denek genellikle TREC ve PCR ile kendi algılama sağlamak için yeterli KRECs bir miktar var. Bu nedenle, çevresel kan elde edilir ve daha kolay çalışmak için geçerli bir alternatif olması gerekir. Eğer TREC, özellikle bir çocuklar, genç yetişkin sağlıklı yetişkin yaş, periferik kan azaldığı göz önüne alındığında, tavsiye edilir.
   2. Ayrı periferal kan mononucStandart bir yoğunluk gradyan ayırma yöntemiyle emizle hücreleri (PBMC).
2. DNA ekstraksiyon:
   1. Ticari DNA Kan Mini Kit kullanılarak PBMC'den DNA ayıklayın. Aşağıda açıklanan birkaç değişiklik ile üreticinin talimatlarına uyun.
      1. 1400 rpm'de bir çalkalama-inkübatör kullanılarak 10 dakika boyunca 70 ° C (yerine 56 ° C) inkübe edin.
      2. 70 ° C'de 5 dakika inkübe edilir ve üreticinin talimatlarına uygun olarak santrifüj ile DNA Zehir, sütun 70 ° C sıcaklıkta ısıtıldı elüsyon tamponu ekleyin. 260/280 nm spektrofotometrik tahmin tarafından çıkarılan DNA konsantrasyonu belirleyin.
3. TREC ve Krec sinyal eklemler (SJ) ve TCRAC referans gen oranında ek içeren bir plazmidin hazırlanması:
   1. TREC, KRECs ve TCRAC için özel primerler ile (TREC-SJ, Krec-SJ ve TCRAC fragmanlarını elde etmek için) PBMC'den elde edilen DNA'yı çoğaltmak (Tablo 1 e bakınız).
      Not: 5'-sonunda KREC- ve TCRAC özgü primerler (italik olarak gösterilen) ilave yan nükleotidlerini uygun bir sayısı ile (Tablo 1 gösterilen dizilerin alt-durumunda) Hindlll ve Spel kısıtlama siteleri içeren; Her iki özellik de kanonik Krec ve TCRAC dizilerinde mevcut değildir.

TREC	ileri	5'-AAA GAG GGC AGC SKK CTC CAA GGC-3 '
	ters	5'-GGC TGA TCT TGT CTG ACA TTT GC-3 '
KRECs	ileri	5'CCC aag CTT TCA GCG CCC ATT ACG TTT CT-3 '
	ters	5'CCC aag CTT GTG AGG GAC ACG CAG CC-3 '
TCRAC	ileri	5'G ac etiketi Tat GAG ACC GTG ACTTGC CAG-3 '
	ters	5'G ac etiketi TGC TGT TGT TGA AGG CGT TTG C-3 '

Tablo 1. primerler, klonlama işlemleri için de kullanılır. 5'-sonunda daha düşük durumda restriksiyon enzim sahalarına karşılık gelen nükleotidler gösterilmiştir, italik olarak yan nükleotidlerini ilave olarak gösterilmektedir, oysa.

3. 2. 1x Tampon II, aşağıdakilerden oluşan, 25 ul'lik bir nihai hacim içinde, PCR reaksiyonları gerçekleştirmek 1.5 mM _MgCl2, (200 uM her biri), astar 900 nM, AmpliTaq DNA Polymerase (2.5 U / 25 ul) nihai konsantrasyonda dNTP karışımı, DNA 100 ng.
   3. Aşağıdaki PCR parametreleri kullanın: 10 dakika boyunca 95 ° C de ilk adım, 30 saniye için 95 ° C 40 döngü, ardından; 30 saniye için 60 ° C; 30 saniye için 72 ° C ve 10 dakika için 72 ° C ve son olarak 1 döngü. PCR ürünü, uzunlukları olmalıdır: TREC için 380 bp, K 166 bp'likRECs, TCRAC 381 bp'lik.
   4. PCR2.1-TOPO Vektör TA alıcı sitesinde TREC-SJ PCR ürünü yerleştirin. Hücreler birlikte verilen protokol takip edilerek ısı şoku ile XL1-mavi kimyasal yetkili hücreleri plazmid DNA dönüşümü. Çünkü ampisilin direnç büyür koloniler arasında, çünkü kaybedilen β-galaktosidaz tamamlama beyaz görünmesini ve bir ana yemek onları aşılamak olacak eki taşıyan kişileri belirlemek. Son olarak, PCR ile, TREC fragmanını içeren koloni belirler.
   5. Belirlenen kolonilerin birini genişletin ve bir plazmid miniprep kiti kullanılarak plazmid DNA arındırmak ve üreticinin talimatlarına uyun. Plazmid DNA ve Spel kısıtlama enzimi ile TCRAC büyütülmüş ürün Digest ve Spel kısıtlama sitesine TCRAC fragmanını ligate.
   6. XL1-Blue hücrelerinin plazmid DNA Dönüşümü ve PCR ile TCRAC fragmanını içeren koloni belirler. Belirlenen kolonilerin birini genişletin ve arındırmakplazmid miniprep kiti kullanılarak plazma DNA.
   7. Plazmid DNA ve HindIII ile Krec büyütülmüş ürün Digest ve Hind III kısıtlama sitesine Krec-SJ parçacığın klonlanması. XL1-Blue hücrelerinin plazmid DNA Dönüşümü ve PCR ile, üçüncü fragmanını içeren koloni belirler.
   8. Doğrudan dizileme ile, doğrulayın, üç ekler varlığı ve mutasyonların olmaması. Son üç-insert plazmid haritası Şekil 1'de temsil edilir.

Şekil 1. Üç-insert plazmid haritası. TREC, Krec, TCRAC dizileri ve sınırlama enzimi siteleri konumunu gösteren Triple-insert plazmid haritası. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

3. 9. Tespit kolonilerin birini aç bir plazmid midiprep kiti kullanılarak plazmid DNA arındırmak. 260/280 nm'de spektrofotometrik tahmin plazmid DNA konsantrasyonu ve jel elektroforezi ile DNA kalitesini belirler. -80 ° C de plazmidin uygun alikotları saklayın (örn., 50 ul) ekstrakte edildi.

2. Standart Eğri Hazırlık

NOT: Özel olarak DNA taşıma-over altına için tasarlanmış bir yerde 0.1x TE tamponunda tüm dilüsyonları hazırlayın.

1. (M _p =: ilgi plazmid kopya sayılarının kütlesini hesaplayın plazmid boyutu 4846 bp olduğunu dikkate alarak, (Tablo 2) ve bp başına ortalama kütle 1,096 x 10 ^-21 gr / bp ve bu nedenle bu 4846 bp), X (1,096 x 10 ^-21 gr / bp) = 5,311.216 x 10 ^-21 gr = 5,311 x 10 ^-18 gr.

Kopya #	X 5,311 x 10 -18 gr	Plazmid DNA kütlesi (g)
1 x 10 6		5,311 x 10 -12
1 x 10 5		5,311 x 10 -13
1 x 10 4		5,311 x 10 -14
1 x 10 3		5,311 x 10 -15
1 x 10 2		5,311 x 10 -16

Her bir standart eğri dilüzyon noktası için gereken plazmid Tablo 2. Mass.

2. Her reaksiyon pipetle gereken hacmi (5 ul) ile gerekli olan plazma kitleleri bölünmesiyle plazmid DNA konsantrasyonları hesaplayın (bakınız Tablo 3).

Plazmid DNA kütlesi (g)	÷ 5 ul	Plazmid DNA 'nın nihai konsantrasyonu (g / ml)
5,311 x 10 -12		1,062 x 10 -12
5,311 x 10 -13		1.062 x 10 -13
5,311 x 10 -14		1.062 x 10 -14
5,311 x 10 -15		1,062 x 10 -15
5,311 x 10 -16		1.062 x 10 -16

Her seyreltme noktası için gerekli plazmid konsantrasyonları Tablo 3. Hesaplama.

3. Plazmidin bir kısım çözülme. Xhol ile plazmid DNA 2 ug linearize ve konsantrasyonu b belirlemek260/280 nm y spektrofotometrik tahmin.
4. (Örneğin, 100 ng / ml = 0.1 ug / ml = 1 x 10 ^-7 g / ul) başlatmak için uygun bir çalışma stok solüsyonu elde etmek için linearize plazmid DNA uygun bir seyreltme hazırlayın. -80 ° C'de linearize plazmid DNA kalan saklayın.
5. 1 x 10 ^{~ 10} g / ul daha uygulanabilir konsantrasyonda plazmid getirmek için 100 dilüsyon: 1:10 veya 1 'uygun bir sayıda yapın.
6. Serinin ilk standart eğri noktasını hazırlamak için gerekli (1 x 10 ⁶ kopya, ilgili 1.062 x 10 ^-12 gr - formül C ₁ V ₁ = seyreltme hacmini hesaplamak C ₂ V ₂ (V ₁ V ₂₎ kullanın / 5 ul; bakınız Tablo 4).

İlk kons. (G / ml)	Plazmid DNA, hacim (ul)	Diluent hacim (ul)	Nihai Vol. (Ul)	Nihai kons. (G / ml)	Plazmid DNA Final kopya sayısı / 5ul
C1-	V1	V 2 -V 1	V 2	C2-
1 x 10 -7	5 ul	45 ul	50 ul	1 x 10 -8	Kullanılamaz
1 x 10 -8	5 ul	495 ul	500 ul	1 x 10 -10	Kullanılamaz
1 x 10 -10	5 ul	465 ul	470 ul	1,062 x 10 -12	1 x 10 6
1,062 x 10 -12	50 ul	450 ul	500 ul	1.062 x 10 -13	1 x 10 5
1.062 x 10 -13	50 ul	450 ul	500 ul	1.062 x 10 -14	1 x 10 4
1.062 x 10 -14	50 ul	450 ul	500 ul	1,062 x 10 -15	1 x 10 3
1,062 x 10 -15	50 ul	450 ul	500 ul	1,062 x 10- 16	1 x 10 2

Tablo 4. Sulandırma hesapları.

7. Kalan standart eğri puan elde etmek 01:10 dilüsyonlarının düzenli bir dizi ile devam edin.
   NOT: Bir sonraki yapmadan önce kısaca her plazmid seyreltme vorteks unutmayın.
   NOT: st en yüksek seyreltmePlazmid DNA 'nın bu gibi küçük bir miktar kadar stabil ileride kullanım için saklanabilir olmadığından, andard eğrisi (10 kopya / 5 ul), hemen tahlil yapmak önce hazırlanmalıdır.
8. Kullanım kadar bir diğerinden ayrı tüplerde -80 ° C 'de üç-plazmid seyreltme kredi saklayın. seyreltilmiş üç plazmid DNA, en az 6 ay için son derece stabildir.

Hedef Örneklerden 3. DNA Ekstraksiyon

1. Periferik kandan ayrı PBMC yoğunluk gradyan ayırma yöntemi kullanılarak, EDTA tüpleri içine toplandı.
   NOT: Alternatif olarak, diğer uygun başlangıç ​​malzemesi kullanın (örneğin, lenfosit subpopülasyonunun, tam kan sıralı) hedef numune olarak.
2. Adım 1.2'de belirtildiği gibi hedef numune PBMC'den DNA ekstrakte edin.

TREC ve KRECs Miktarlarının 4. Real-time PCR

1. Plaka hazırlama ve yükleme:
   1. Her bir numune için en az iki kez tekrarlanmış içeren bir PCR plakası düzenlemekanaliz edilecek: standart eğri (A → F 1 → 4), pozitif kontrol (CTRL ^+; G1 → 4) ve hiçbir şablon kontrolü (NTC H 1 → 4).
      NOT: Tablo 5 tipik bir düzeni gözlemleyin, ancak farklı biçimleri oluşturulabilir. TREC ve KRECs TCRAC olanlardan farklı, aynı kuyulardan, birlikte amplifiye edilecek unutmayın.

	TREC + KRECs bir		TCRAC b		TREC + KRECs		TCRAC		TREC + KRECs		TCRAC
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Bir	10 6 kopya	10 6 kopya	10 6 kopya	10 6 kopya	1	1	1	1	9	9	9	9
B	10 5 kopya	10 5 kopya	10 5 kopya	10 5 kopya	2	2	2	2	10	10	10	10
C	10 4 kopya	10 4 nüsha	10 4 kopya	10 4 kopya	3	3	3	3	11	11	11	11
D	10 3 kopya	10 3 kopya	10 3 kopya	10 3 kopya	4	4	4	4	12	12	12	12
E	10 2 nüsha	10 2 nüsha	10 2 nüsha	10 2 nüsha	5	5	5	5	13	13	13	13
F	10 kopya	10 kopya	10 kopya	10 kopya	6	6	6	6	14	14	14	14
G	CTRL +	CTRL +	CTRL +	CTRL +	7	7	7	7	15	15	15	15
H	NTC	NTC	NTC	NTC	8	8	8	8	16	16	16	16

Tablo 5. Numune real-time PCR plaka.

1. 2. Ve ayrı tüplerde TREC / KRECs ve TCRAC (Tablo 6) için ana karışımı hazırlamak - gerekli kuyuların toplam sayısını hesaplayın (olası pipetleme hataları hesaba 2 ekstra kuyu 1 dahil).
      Not:. TREC, KRECs ve TCRAC özgü primerleri ve probları, Tablo 7'de belirtilen astar ve sonda son konsantrasyonlar sırasıyla 900 nM ve 200 nM.

TREC / KRECs		TCRAC
H2O	2 ul	H2O	4.75 ul
20 pmol / ul için KRECs	1.125 ul	20 pmol / ul için TCRAC	1.125 ul
KRECs 20 pmol / ul devir	1.125 ul	TCRAC 20 pmol / ul devir	1.125 ul
KRECs probu 10 pmol / ul	0.5 ul	TCRAC probu 10 pmol / ul	0.5 ul
20 pmol / ul için TREC	1.125 ul	2x TaqMan Evrensel PCR Master Mix	12.5 ul
TREC 20 pmol / ul devir	1.125 ul
TREC probu 10 pmol / ul	0.5 ul
2x TaqMan Evrensel PCR Master Mix	12.5 ul

Belirtilen Kuyular için gerekli reaktiflerin Tablo 6. Cilt.

TREC	ileri	5'-CAC ATC SKK TTC AAC CAT GCT-3 '
	ters	5'-TGC AGG TGC CTA TGC ATC-3 '
	sonda	5'-FAM-ACA SKK CTG GTT TTT GTA AAG GTG CCC ACT-TAMRA-3 '
KRECs	ileri	5'-TCC CTT AGT GGC ATT ATT TGT ATC ACT-3
	ters	5'-AGG AGC CAG CTC TTA CCC TAG AGT-3 '
	sonda	5'-HEX-TCT GCA CGG GCA GCA GGT TGG-TAMRA-3
TCRAC	ileri	5'-TGG SKK AAC SKK GAT SKK CTT-3 '
	ters	5'-GGA TTT AGA GTC TCT CAG CTG GTA CAC-3
	sonda	5'-FAM-TTK CAC AGA TAT CCA GAA CCC TGA CCC-TAMRA-3 '

Gerçek zamanlı PC için astar ve sondalar Tablo 7. SıraR, deneyi.

1. 3. Her bir karışımı (TREC / KRECs ve TCRAC) 20 ul ekle. Reaktif hazırlama odası ayrılmadan önce, bir optik yapıştırıcı kapağı ile reaksiyon plaka mühür.
   4. Bir nükleik asit ekstraksiyon odasında, yapışkan kapağını kaldırın ve genomik DNA örneği 5 ul ekleyin - kuyulara (400 500 ng). CTRL ⁺ oyuklara (göbek bağı kanından elde edilen PBMC den hazırlandı, yani,), genomik DNA 5 ul ekle.
      Not: göbek kordonu kanı bir alternatif olarak, numunelerin aynı bilinen, pozitif çevresel kan numunesi ya da havuz DNA kullanmak veya TREC- genomik DNA ile üç uç plazmid önceden saptanmış bir miktarının karıştırılması ile, bir "yapay" pozitif standardı hazırlamak ve Krec-negatif hücre çizgileri dahildir.
   5. NTC oyuklara suyun 5 ul ekleyin. Optik yapıştırıcı kapağı ile tekrar reaksiyon plaka Seal.
   6. Plazmid DNA taşıma-over içte sağlayan bir yere taşıyın; Her seyreltme poin çözülmeSadece Kullanmadan önce plazmid DNA standart eğri t ve yüksek seyreltme hazırlamak (10 kopya / 5 ul). Sadece bir → H 1 → 4 kuyudan yapışkan kapağını yukarı kaldırın ve plazmid DNA standart eğrinin her noktası seyreltme 5 ul ekleyin. Tekrar yapışkan kapağını Seal.
   7. Böylece reaktifler altta konumlandırılmış sağlanması, kuyu dibinde kabarcıkların yokluğunu doğrulayın.
   8. Gerçek-zamanlı PCR sistemi üzerinde tahlil çalıştırın. Standart Protokol 2 15 saniye boyunca 95 ° C 'de denatürasyon, 45 döngü, ardından dakikada, 10 dakika boyunca 95 ° C'de bir ilk ısıtma, ve bir araya getirilen primer / prob tavlama ve uzama için 50 ° C' de, ilk aşamada elde edilen oluşmaktadır 1 dakika için 60 ° C.
   9. PCR programın sonunda verileri kaydetmek.
      NOT: nükleik asit ekstraksiyon için ayrı alanlar / odaları kullanın: DNA çapraz bulaşmayı önlemek hatırlamak için: kantitatif PCR için her zamanki gibi iyi laboratuar uygulamaları öneriler takip PCR testi gerçek zamanlı kurarkenreaktif hazırlama, plazmid manipülasyon, amplifikasyon reaksiyonu; Ayrı pipet setleri kullanmak; uygun eldiven / kat değiştirin.
2. Bulgular ve hesaplama:
   Not: Aşağıdaki adımlar genel olarak gerçek-zamanlı PCR Malzemeler Tablo belirtilen alet, ancak, birlikte verilen yazılımı kullanarak deneyime dayalı, diğer gerçek zamanlı PCR analizi platformları ve yazılımlar için de geçerli olmalıdır. Aynı yazılımı kullanarak bile, genellikle gerekli komutları (örneğin, simgeler, kısayollar) yürütmek için birden fazla yolu var, unutmayın.
   1. Yazılım kaydedilen sonuç dosyasını açın ve "Sonuçlar" sekmesine tıklayın. Pencerenin üst kısmında, "Analiz" menüsüne tıklayın ve "Analiz ayarları" seçeneğini seçin. Yazılım "Tümü" dedektörleri ve "Otomatik Ct" (Ct = eşik döngüsünü seçerek eşiği otomatik tespit edelim. Edelim yazılım seti "Otomatik Baseline"; Varsayılan olarak arka ortadan kaldırılması için.
   2. Ilgili açılan menüde üç "dedektörlerin" birini seçin, pencerenin en sağdaki kısmında, "Abartma Plot" adlı sekmesine tıklayın ve (TREC ile başlayan örn). Sadece aşağıdaki el bir eşiği ayarlamak için "Manuel Ct" seçin; Pencerenin alt kısmına gidin ve büyütme araziler göstermek için seçilen dedektör standart eğri seyreltme noktalarına gelen kuyu seçin. Bunu yapmak için sadece tıklayın ve tablonun ilgili hücreler üzerinde fareyi sürükleyin.
      1. Tıklatın, elle eşiği ayarlamak yukarı ve aşağı kırmızı eşik çizgisini sürükleyin ve sonuçları yeniden analiz için "Analiz". Eşiği ayarı sonuçlarını nasıl etkilediğini kontrol etmek için, "Rapor" sekmesini seçin ve ilgili standart eğri seyreltme noktaları ortaya çıkan Ct bkz. Eşiği taşırken, optimal sıralarda yer almak için aşağıdaki önerilere uymak için deneyin.
      2. "Amplifikasyon Plot" sekmesine geri dönün ve eşik yeterince arka plan gürültü üzerinde ama plato fazı altında üstel amplifikasyon bir bölgede olduğunu doğrulayın. Amplifikasyon arsa logaritmik ölçekte gösterilir değilse, "Grafik Ayarları" ve "log" lineer bölümünde eşik yarım set gibi post-run Y ekseni ayarlarının çağırmak için arsa üzerinde sağ tıklayın arsa ve gözlemlemek amplifikasyon eğrileri yaklaşık birbirine paralel.
      3. Ct sonuçlarını görmek için "Raporu" sekmesine tıklayın. Eşik yerleştirme her bir standart eğri seyreltme noktalarının iki çoğaltır hassasiyeti en üst düzeye sonuçlar emin olun.
      4. Eşik en iyi standart eğri seyreltme noktaları (optimum hassasiyet) büyüklüğü aşırı siparişleri yansıtan noktada yer olup olmadığını kontrol edin. Kalan iki dedektör (KRECs ve T adımı yineleyin 4.2.2 ve kalan alt basamaklarıKerek).
      5. Rapor sekmesine gidin tüm dedektörleri (TREC, KRECs, TCRAC) için standart eğrinin kuyulara gelen hücreleri seçmek için pencerenin alt kısmındaki tabloda tekrar fareyi sürükleyin. Üç hedeflerin elde edilen Ct aynı seyreltme noktalarda çok benzer olduğundan emin olun (örneğin, fark en fazla 0,5 Ct). Gerekirse eşikleri yeniden ayarlayın ve tekrar kontrol edin.
         NOT: Üç eklemek plazmid her hedef ve bu nedenle bir tek kopyasını içerdiğinden büyütme oranı teorik olarak 1'e yakın olmalıdır: 1: 1. Bazı durumlarda, el ile daha iyi sonuçlar elde etmek için detektör bir ya da daha fazla, aynı zamanda taban çizgisi ayarlamak gerekli olabilir. Sadece o "Manuel Baseline" ayarlamak, ayar gerekli olduğu dedektör seçin ve Başlangıç ​​ve Bitiş Cycles (genellikle 3 ila 15) için özel değerler eklemek, "Analiz ayarları" penceresini çağırmak. Ardından "Tamam & yeniden Çözümle yi" linkine tıklayın ve önceki noktaları tekrar kontrol edin.
   3. Sadece aşağıdaki doğruladıktan sonra deneysel oturumu Kabul:
      1. "Rapor" sekmesine tıklayın pencerenin alt kısmına gidin, NTC kuyu seçin ve ilgili Ct "Undet" olduğunu kontrol edin (yani, hiçbir amplifikasyon NTC kuyularda mevcut).
      2. "Standart Eğrisi" sekmesini seçin ve arsa penceresinin sağa bak; Açılan menüden seçin dedektörleri ve rapor standart eğrisi eğimi -3,55 -3,32 ile arasında değişmektedir olsun (91 verimlilik PCR tekabül - 100%) bkz
      3. Belirlenmesi (R ²⁾ katsayısı (her dedektör seçtikten sonra, aynı "Standart Eğrisi" sekmesinde) sağ yamacında ve kesişim altına değerini okuyarak, 0.998 (Şekil 2) daha yüksek olduğundan emin olun.
         Onlar bir yüksek "leve sahip (onların hiza eğimi etkileyebilir, çünkü daha kolay aşırı seyreltme noktalara dikkat edin: NOTregresyon hattı üzerinde öfke "etkisi). Özellikle, yüksek plazmid seyreltme beklenenden daha erken düşebilir unutmayın. Ancak, mümkün bir akılcı bir yaklaşım kantitatif tespit limiti olarak 100 düşünün olabilir, çünkü onları atmak değil yararlıdır: 10 ile 100 arasında örnekler için diğer bir deyişle, sonuç <100 veya "pozitif olarak rapor edilebilir ama ölçülebilir değil "saptanamaz", eğri aralığında (<10) dışında 0 olarak bildirilen veya eğer ise ".
         NOT: Her seyreltme noktası için ortalama bir değer hesaplamak için, önceki standart eğri seyreltmelerinden Ct değerleri bir arşiv tutmak yararlı olabilir gelecekte deneyler için en uygun "referans" aralık veya iç kalite kontrol bir tür olarak tutulması (örneğin, Shewhart kontrol grafikleri oluşturmak için ortalama ve SD hesaplamak). Benzer şekilde, pozitif kontrol geçmiş Ct bir arşiv tutmak yararlı olabilir.

TREC, KRECs ve TCRAC Şekil 2. Standart eğriler. Standart eğri noktalarının Arsalar ve log-regresyon hattı TREC (A) tahminleri, KRECs (B), ve TCRAC (C) İdeal üstel uyumu doğrulamak için inşa edilmiştir % 100 bir verim tekabül edecektir amplifikasyon oranı (eğim = 3.32). Ct: Eşik döngüsü; ^R2:. Determinasyon regresyon katsayısı bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

2. 3. 4. "Rapor" sekmesine tıklayın ve (grafik altında tablonun ilgili hücrelerde bulunan) pozitif kontrol Ct sa önceki analizlerin sonuçları ile tutarlı olduğunu doğrulamakBeni pozitif kontrol bilinen.
         NOT: "Rapor" sekmesine TREC, KRECs ve örneklerin TCRAC miktarını gösteren yazılım düzgün ayarlanmış eşik ve başlangıç ​​sonra elde edilen Ct değerleri kullanılarak, ilgili standart eğriden interpolasyonla hesaplanan olduğu test edilen (bir Yeni bir eşik / başlangıca yeni analiz) bu sonuçları değiştirmek istiyorum. Interpolasyon standart eğri üzerinde yer alır nerede görmek için, ardından istediğiniz kuyu seçin, "Standart Eğrisi" sekmesini seçin ve regresyon hattı üzerinde görünen siyah "X" için bak. Onların y ekseni değeri interpolasyon miktarıdır. Hep aynı pozitif kontrol kullanıyorsanız, uygun referans aralıkları ve / veya kalite kontrol grafikleri pozitif kontrol belirlenir önceki değerlere dayalı, inşa edilebilir.
   4. "Dosya" menüsünden tıklayın "Kaydet", ve sonra bir .csv dosyasına "İhracat" bir te tüm kuyuların miktarlarda ihracatvirgülle ayrılmış değerler içeren xt dosyası.
   5. Bir elektronik tablo yazılımı the.csv dosyayı içe ve uygun aşağıdaki formül ayarlayarak 10 ⁶ PBMC başına TREC sayısını veya KRECs hesaplamak: [(TREC veya KRECs miktarı ortalama) / (TCRAC / 2 miktarı ortalama)] 10 ⁶ x
      NOT: Her hücrede örneğin iki TCRAC gen kopyaları, her kromozom için bir olduğundan TCRAC ortalama miktarı 2 ile bölünür.
      NOT: TREC ve pozitif kontrol KRECs son sayısının tutarlılık kabul, ama değerler mükemmel çünkü standart eğri seyreltme puan ilave değişkenlik maç olmayacak akılda tutmak olabilir. Brüt sapma durumunda, deney tekrar edilmesi gerekebilir. Yine, kontrol grafikleri uygun bir referans aralığı ayarlamak için inşa edilebilir.
   6. Tam kan sayımı sonuçları varsa, aşağıdaki formül kullanılarak kan ml başına TREC veya KRECs hesaplamak (isteğe bağlı, ancak önerilir):
      TREC veya 1 x 10 ⁶⁾ X (lenfosit + monosit başına KRECs kan, 1 ml) / 10 ⁶ = kopya / ml sayılır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Tahlil 87 sağlıklı kontrol temsili örneklemde gerçekleştirilmiştir: 42 çocuk 0 yaş - 17 (erkek / kadın: 25/17) ve 24 yaş 45 yetişkin - 60 (erkek / kadın: 29/16). Sonuçlar hesaplandı TREC 10 ⁶ PBMC başına KRECs ve daha sonra kan ml'si başına TREC ve KRECs olarak elde edildi.

- 4 yıl TREC sayısı nedeniyle 0-3 çok keskin bir şekilde, özellikle de timus involüsyon, ⁴ yaşla birlikte azalmaktadır. Kadınlarda erkeklere göre daha hızla azalır...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

TREC and KREC quantification can be considered a good estimate of recent thymic and bone marrow output provided that some caveats are taken into account. Even though an absolute quantification method employing standard curve requires more reagents and more space on the real-time PCR reaction plate, it ensures highly accurate quantitative results because unknown sample quantities are interpolated from standard curves built upon known amounts of starting material. Moreover this method is better fitted to detect low amount ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Histopaque-1077	Sigma Aldrich SRL	10771-500 ML	density gradient separation method
QIAamp DNA Blood Mini Kit (250)	QIAGEN	51106	DNA extraction
Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol	Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l		Resuspend the lyophilized product to 100 pmol/µl
AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25 mM MgCl2	Applied Biosystems/Life-Technologies	N8080156
GeneAmp dNTP Blend (100 mM)	Applied Biosystems/Life-Technologies	N8080261
TOPO TA Cloning Kit for Subcloning	Invitrogen/Life-Technologies	K4500-01
XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells	Stratagene	200130
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1223
SpeI 500U	New England Biolabs	R0133S
HindIII-HF 10,000 U	New England Biolabs	R3104S
PureYield Plasmid Midiprep System	Promega	A2492
XhoI 5,000 U	New England Biolabs	R0146S
TRIS Utrapure	Sigma Aldrich SRL	T1503
EDTA	Sigma Aldrich SRL	E5134
TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA)
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems/Life-Technologies	4364338
Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol	Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l		Resuspend the lyophilized product to 100 pmol/µl
NanoDrop 2000c spectrophotometer	ThermoFisher
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler	Applied Biosystems/Life-Technologies	4359659
Fast 7500 Real-Time PCR system	Applied Biosystems/Life-Technologies
SDS Sequence Detection Software 1.4	Applied Biosystems/Life-Technologies