Quantificação simultânea de T-célula receptora Excisão Circles (TRECs) e K-Excluindo Recombinação Excisão Circles (KRECs) por PCR em tempo real

Resumo

Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.

Resumo

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/10⁶ cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.

Introdução

Círculos excisão do receptor de células T (TRECs) e os círculos a recombinação de excisão-exclusão K (KRECs) são pequenos elementos de ADN circularizado que são excisados, numa proporção de células T e B-, respectivamente, durante um processo de recombinação de DNA genómico, levando à formação de um repertório altamente diversificada de T e receptores de células-B. Eles não têm qualquer função, mas porque eles são estáveis ​​e não pode ser replicado, eles são diluídos após cada divisão celular, persistindo assim em apenas uma das duas células filhas. Portanto, os seus níveis no sangue periférico pode ser assumida como uma estimativa da potência do timo e da medula óssea.

Enquanto o ensaio de TREC tem sido largamente utilizado nos últimos 15 anos, para avaliar a extensão da saída do timo, a ^um ensaio de KREC, que foi inicialmente desenvolvido para medir a proliferação de células B e a sua contribuição para a homeostase da célula B na saúde e na doença, ² Só recentemente foi proposta como um marcador de osso marrow saída ^3,4. Aqui, descrevemos o método que desenvolvemos para a quantificação simultânea de ambos os TRECs e KRECs. ⁴

Com este método combinado, a variabilidade associada a quantificação de ADN por PCR em tempo real é eliminada através da utilização de uma única curva padrão obtida por diluição de um plasmídeo de inserção de triplo contendo fragmentos de TRECs, KRECs e de células T constante receptor alfa (TCRAC) gene numa proporção de 1: 1: 1. Isto permite uma avaliação mais precisa do número de exemplares TREC e KREC. Além disso, a quantificação simultânea dos dois alvos na mesma reacção permite a redução de custos de reagentes.

O ensaio de TREC / KREC proposto pode ser útil para medir o grau de T e neo-produção de células B em crianças ou adultos com Imunodeficiência Combinada Grave (SCID), ⁴ imunodeficiência comum variável, ^cinco doenças auto-imunes, ^6-8 e infecção pelo HIV ^9. Além disso, ele pode ser usado paramonitorar a recuperação imunológica após o transplante de células-tronco hematopoéticas, ¹⁰ de substituição enzimática, ¹¹ e antiviral ⁹ ou imunomoduladores terapias. ^6-8 Finalmente, porque os pacientes SCID são reconhecidos utilizando o ensaio de TREC apesar dos defeitos genéticos subjacentes, e agammaglobulinemia pacientes podem ser identificados usando KREC quantificação , o ensaio TREC / KREC pode também ser usado para detectar imunodeficiências em programas de rastreio neonatal. ¹² Neste caso, o ensaio deve ser realizado em ADN extraído de pequenas manchas de sangue apagados e secos em papel de filtro, deve ser altamente sensível e específico para as doenças-alvo, bem como altamente reprodutível e de baixo custo.

A introdução de KREC quantificação do ensaio deve melhorar performances de triagem neonatal para imunodeficiências, que tem sido realizada rotineiramente nos algumas partes dos EUA (WI, MA, CA) desde 2008, quando se tornou o primeiro Wisconsin para Introduce da análise de TRECs em seu programa de triagem pós-natal. ¹³

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Protocolo

Declaração de Ética: NOTA: Este protocolo segue as diretrizes da nossa instituição, o Spedali Civili di Brescia

1. Elaboração de um "Triple-Insert" plasmídeo

1. Selecção e preparação de material de partida apropriado:
   1. Obter uma amostra contendo células muito susceptíveis de ter TRECs e KRECs detectável por PCR, tal como sangue periférico de um sujeito jovem saudável recolhido em tubos contendo EDTA.
      NOTA: Originalmente, tínhamos desenvolvido o método que utiliza para TRECs timócitos e células mononucleares de fragmentos da amígdala para KRECs, mas indivíduos saudáveis ​​costumam ter uma quantidade de TRECs e KRECs suficientes para permitir a sua detecção por PCR. Portanto, sangue periférico deve ser uma alternativa válida, mais fácil de obter e de se trabalhar. Considerando que TRECs, em particular, diminuir com a idade nos adultos saudáveis, do sangue periférico de um adulto jovem, se não a partir de uma criança, é aconselhada.
   2. Mononuc sangue periférico separadocélulas lear (PBMC) por um método padrão de separação por gradiente de densidade.
2. A extração do DNA:
   1. Extrai-se o ADN a partir de PBMC utilizando um DNA Mini Kit de sangue comercial. Siga as instruções do fabricante com as poucas modificações descritas abaixo.
      1. Incubar as amostras a 70 ° C (em vez de 56 ° C) durante 10 min utilizando um agitador-incubador a 1.400 rpm.
      2. Adicionar o tampão de eluição foi aquecida a 70 ° C para a coluna, incubar durante 5 min a 70 ° C e elui-se o ADN por centrifugação de acordo com as instruções do fabricante. Determinar a concentração de DNA extraído por estimativa espectrofotométrica a 260/280 nm.
3. Preparação de um plasmídeo contendo as inserções de TREC e KREC juntas de sinais (SJ) e do gene de referência TCRAC:
   1. Amplificar o ADN extraído a partir de PBMC (para obter o TREC-SJ, KREC-SJ, e fragmentos TCRAC) com iniciadores específicos para TRECs, KRECs e TCRAC (ver Tabela 1).
      NOTA: No 5'-end, os primers KREC- e TCRAC específicos-conter locais de restrição HindIII e Spel (em letras minúsculas nas sequências mostradas Tabela 1), com um número adequado de flanqueamento nucleótidos adicionais (indicados em itálico); ambos os recursos não estão presentes nas sequências KRec e TCRAC canônicos.

TRECs	para a frente	5'-AAA GAG GGC AGC CCT CTC CAA GGC-3 '
	reverter	5'-GGC TGA TCT TGT CTG ACA TTT GC-3 '
KRECs	para a frente	5'- CCC aag ctt TCA GCG CCC ATT ACG TTT CT-3 '
	reverter	5'- CCC aag ctt GTG AGG GAC ACG CAG CC-3 '
TCRAC	para a frente	5'G tag ac TAT GAG ACC GTG ACTTGC CAG-3 '
	reverter	5'G tag ac TGC TGT TGT TGA AGG CGT TTG C-3 '

Tabela 1. Os iniciadores utilizados para os procedimentos de clonagem. Na extremidade 5 ', em minúsculas são mostrados nucleótidos correspondente aos locais das enzimas de restrição, enquanto que em itálico são mostrados adicionado nucleótidos que flanqueia.

3. 2. Realizar as reacções de PCR num volume final de 25 ul, que consiste em 1x tampão II, _MgCl2 1,5 mM, mistura de dNTPs (200 pM cada), iniciadores na concentração final de 900 nM, ADN-polimerase AmpliTaq (2,5 U / 25 uL), e 100 ng de DNA.
   3. Use os seguintes parâmetros: primeiro passo de PCR a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 30 seg; 60 ° C durante 30 seg; 72 ° C durante 30 seg, e, finalmente, um ciclo de 72 ° C durante 10 min. Comprimentos de produtos de PCR deve ser: 380 pb para TRECs, 166 pb para KCER, 381 pb para TCRAC.
   4. Insira o produto de PCR de TREC-SJ no sítio receptor TA da Vector pCR2.1-TOPO. Transformar o plasmídeo de ADN em células quimicamente competentes XL1-azul por choque térmico, seguindo o protocolo fornecido com as células. Entre as colônias que crescem por causa da resistência à ampicilina, identificar aqueles que transportam a inserção, que aparecerá branco por causa de perder complementação β-galactosidase, e inocular-los em um prato principal. Finalmente, identificar as colónias que continham o fragmento TREC por PCR.
   5. Expandir uma das colónias identificadas e purificar o ADN do plasmídeo utilizando um kit de miniprep de plasmídeo e seguir as instruções do fabricante. Digerir o ADN do plasmídeo e o produto amplificado TCRAC com a enzima de restrição Spel e ligar o fragmento TCRAC para o sítio de restrição Spel.
   6. Transformar o plasmídeo de ADN em células XL1-azul e identificar as colónias que continham o fragmento TCRAC por PCR. Expandir uma das colónias identificadas e purificaro DNA de plasmídeo utilizando o kit de plasmídeo miniprep.
   7. Digerir o ADN do plasmídeo e o produto amplificado KREC com HindIII e clonar o fragmento KREC-SJ no local de restrição HindIII. Transformar o plasmídeo de ADN em células XL1-azul e identificar as colónias que contêm o terceiro fragmento por PCR.
   8. Verificar, através de sequenciação directa, a presença das três inserções e a ausência de mutações. O mapa do plasmídeo final tripla inserção está representado na Figura 1.

Figura 1. Triple-insert plasmídeo mapa. Triple-insert mapa plasmídeo mostrando a posição de sequências de TREC, KRec, TCRAC e locais de enzimas de restrição. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. 9. Expandir uma das colónias identificadas, purificar o ADN do plasmídeo utilizando um kit de plasmídeo Midiprep. Determinar a concentração de ADN de plasmídeo por estimativa espectrofotométrica a 260/280 nm e a qualidade do DNA por electroforese em gel. Armazenar aliquotas apropriadas do plasmídeo a -80 ° C (por ex., 50 ul cada).

2. Norma Curve Preparação

NOTA: Prepare todas as diluições em tampão TE 0,1x em um lugar especialmente projetado para contenção de DNA carry-over.

1. Calcule a massa do número de cópias do plasmídeo de interesse (ver Tabela 2), tendo em conta que o tamanho do plasmídeo é 4846 pb e que a massa média por bp é 1.096 x 10 ^-21 g / bp e, portanto: m _p = ( 4846 pb) x (1,096 x 10 ^-21 g / pb) = 5,311.216 x 10 ^-21 g = 5,311 x 10 ^-18 g.

Cópia #	x 5,311 x 10 -18 g	Massa de ADN de plasmídeo (g)
1 x 10 6		5,311 x 10 -12
1 x 10 5		5,311 x 10 -13
1 x 10 4		5,311 x 10 -14
1 x 10 3		5,311 x 10 -15
1 x 10 2		5,311 x 10 -16

Tabela 2. Massa de plasmídeo necessária para cada ponto de diluição curva padrão.

2. Calcular a concentração de ADN de plasmídeo dividindo as massas plasmídeo necessários pelo volume (5 ul) para ser pipetado para cada reacção (ver Tabela 3).

Massa de ADN de plasmídeo (g)	÷ 5 ul	A concentração final de ADN de plasmideo (g / l)
5,311 x 10 -12		1,062 x 10 -12
5,311 x 10 -13		1,062 x 10 -13
5,311 x 10 -14		1,062 x 10 -14
5,311 x 10 -15		1,062 x 10 -15
5,311 x 10 -16		1,062 x 10 -16

Tabela 3. Cálculo das concentrações de plasmídeos necessários para cada ponto de diluição.

3. Descongelar uma aliquota do plasmídeo. Linearizar 2 ug do ADN de plasmídeo com Xhol e determinar a sua concentração bestimativa espectrofotométrica y em 260/280 nm.
4. Prepare uma diluição adequada do ADN do plasmídeo linearizado, de modo a atingir uma solução de estoque de trabalho conveniente para iniciar a partir de (por exemplo, 100 ng / mL = 0,1 mg / mL = 1 x 10 ^-7 g / l). Armazenar o restante do DNA de plasmídeo linearizado a -80 ° C.
5. Executar um número conveniente de 1:10 ou 1: 100 diluições para trazer o plasmídeo na concentração viável mais de 1 x 10 ^-10 g / mL.
6. Utilizar a fórmula C _{1 1} V = C ₂ V ₂ para calcular o volume de diluição ₍₂ V - V ₁₎ necessária para preparar o primeiro ponto da curva padrão da série (1 x 10 ⁶ cópias, o que corresponde a 1,062 x 10 ^-12 g / 5 jul, ver Tabela 4).

Conc inicial. (G / l)	O DNA de plasmídeo vol (mL)	Diluent vol (mL)	Vol final. (L)	Conc. (G / l)	Número de cópias do plasmídeo final de ADN / 5 ul
C 1	V 1	V 1 2 -V	V 2	C 2
1 x 10 -7	5 ul	45 ul	50 ul	1 x 10 -8	N / D
1 x 10 -8	5 ul	495 ul	500 ul	1 x 10 -10	N / D
1 x 10 -10	5 ul	465 ul	470 ul	1,062 x 10 -12	1 x 10 6
1,062 x 10 -12	50 ul	450 ul	500 ul	1.062 x 10 -13	1 x 10 5
1,062 x 10 -13	50 ul	450 ul	500 ul	1,062 x 10 -14	1 x 10 4
1,062 x 10 -14	50 ul	450 ul	500 ul	1,062 x 10 -15	1 x 10 3
1,062 x 10 -15	50 ul	450 ul	500 ul	1.062 x 10 16	1 x 10 2

Tabela 4. Os cálculos de diluição.

7. Prosseguir com uma série regular de diluições 1:10 para se obter os restantes pontos da curva padrão.
   NOTA: Não se esqueça de vortex cada diluição plasmídeo brevemente antes de realizar o próximo.
   NOTA: A diluição mais elevada do rAndard curva (10 cópias / 5 ul) deve ser preparado imediatamente antes da realização do ensaio, porque uma pequena quantidade de DNA de plasmídeo tal, não é suficientemente estável para ser armazenado para uso futuro.
8. Armazenar os pontos de diluição tripla plasmídeo a -80 ° C em tubos separados até à utilização. O ADN de tripla plasmídeo diluída é altamente estável durante pelo menos 6 meses.

3. Extração de DNA a partir de amostras-alvo

1. PBMC separado a partir de sangue periférico recolhido em tubos de EDTA, utilizando o método de separação por gradiente de densidade.
   NOTA: Como alternativa, use outro material de partida adequado (por exemplo, classificado subpopulações de linfócitos, o sangue total) como amostra-alvo.
2. Extrai-se o ADN a partir de PBMC de amostras-alvo como reportado no passo 1.2.

4. PCR em tempo real para a quantificação de TRECs e KRECs

1. Placa preparação e carregamento:
   1. Organizar uma placa de PCR, incluindo pelo menos duas repetições para cada amostrapara ser analisado: curva padrão (A → F 1 → 4), controlo positivo ⁽⁺ CTRL; G1 → 4) e não-molde de controlo (NTC; H 1 → 4).
      NOTA: Observe um esquema típico na Tabela 5, mas diferentes formatos podem ser criados. Lembre-se que TRECs e KRECs será ampliado juntos nos mesmos poços, distintos dos da TCRAC.

	TRECs + KRECs um		TCRAC b		TRECs + KRECs		TCRAC		TRECs + KRECs		TCRAC
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	10 6 cópias	10 6 cópias	10 6 cópias	10 6 cópias	1	1	1	1	9	9	9	9
B	10 5 cópias	10 5 cópias	10 5 cópias	10 5 cópias	2	2	2	2	10	10	10	10
C	10 4 cópias	10 4 cópias	10 4 cópias	10 4 cópias	3	3	3	3	11	11	11	11
D	10 3 cópias	10 3 cópias	10 3 cópias	10 3 cópias	4	4	4	4	12	12	12	12
E	10 2 cópias	10 2 cópias	10 2 cópias	10 2 cópias	5	5	5	5	13	13	13	13
F	10 cópias	10 cópias	10 cópias	10 cópias	6	6	6	6	14	14	14	14
G	CTRL +	CTRL +	CTRL +	CTRL +	7	7	7	7	15	15	15	15
H	NTC	NTC	NTC	NTC	8	8	8	8	16	16	16	16

Tabela 5. Amostra em tempo real placa PCR.

1. 2. Calcule o número total de poços necessários (incluem 1-2 poços adicionais para considerar possíveis erros de pipetagem) e preparar a mistura principal para TRECs / KRECs e TCRAC em tubos separados (ver Tabela 6).
      NOTA:. Os primers e sondas específicas para TRECs, KRECs e TCRAC são mencionados na Tabela 7 O Iniciador e Sonda concentrações finais são 900 nm e 200 nm, respectivamente.

TRECs / KRECs		TCRAC
H2O	2 ul	H2O	4,75 mL
KRECs para 20 pmol / ul	1.125 ul	TCRAC para 20 pmol / ul	1.125 l
KRECs rev 20 pmol / l	1.125 ul	TCRAC rev 20 pmol / l	1.125 ul
Sonda KRECs 10 pmol / l	0,5 ul	Sonda TCRAC 10 pmol / l	0,5 ul
TRECs para 20 pmol / ul	1.125 ul	2x TaqMan Universal PCR Master Mix	12,5 ul
TRECs rev 20 pmol / l	1.125 ul
Sonda TRECs 10 pmol / l	0,5 ul
2x TaqMan Universal PCR Master Mix	12,5 ul

Tabela 6. O volume de reagentes necessários para os poços indicados.

TRECs	para a frente	5'-CAC UmTC CCT TTC AAC CAT GCT-3 '
	reverter	5'-TGC AGG TGC CTA ATC TGC A-3 '
	sonda	5'-FAM-ACA CCT CTG GTT TTT GTA AAG GTG CCC ACT-TAMRA-3 '
KRECs	para a frente	5'-TCC CTT AGT GGC ATT ATT TGT ATC ACT-3
	reverter	5'-AGG AGC CAG CTC TTA CCC TAG AGT-3 '
	sonda	5'-HEX-TCT GCA CGG GCA GCA GGT TGG-TAMRA-3
TCRAC	para a frente	5'-TGG CCT AAC CCT GAT CCT CTT-3 '
	reverter	5'-GGA TTT AGA GTC TCT CAG CTG GTA CAC-3
	sonda	5'-FAM-TCC CAC AGA TAT CCA GAA CCC TGA CCC-TAMRA-3 '

Tabela 7. Sequência de iniciadores e sondas para o PC em tempo realR ensaio.

1. 3. Adicionar 20 mL de cada mix (TRECs / KRECs e TCRAC). Antes de deixar a sala de preparação do reagente, selar a placa de reacção com uma cobertura adesiva óptica.
   4. Em um quarto de extracção de ácido nucleico, levantar a tampa do adesivo e adicionam-se 5 ul de amostra de DNA genómico (400-500 ng) para os poços. Adiciona-se 5 ul de ADN genómico (ou seja, preparado a partir de PBMC obtidas a partir de sangue do cordão umbilical) para os poços de CTRL ^+.
      NOTA: Como uma alternativa para o sangue do cordão umbilical, utilizar ADN a partir da mesma conhecida, amostra de sangue periférico positivo ou piscina de amostras, ou preparar um padrão positivo "artificial" por mistura de uma determinada quantidade de triplo-inserção do plasmídeo com DNA genómico de TREC- e linhas de células KREC-negativas.
   5. Adiciona-se 5 mL de água para os poços NTC. Selar a placa de reacção novamente com a tampa adesivo óptico.
   6. Mover-se para um lugar garantindo a contenção do plasmídeo de DNA carry-over; descongelar cada poin diluiçãot da curva padrão de ADN plasmídeo só antes da utilização e preparar a diluição mais elevada (10 cópias / 5 ul). Levante a tampa do adesivo somente de um → H 1 → 4 poços e adicionar 5 mL de cada diluição do ponto de curva padrão DNA plasmídeo. Selar a tampa adesivo novamente.
   7. Determinar a ausência de bolhas no fundo dos poços, garantindo assim que os reagentes são posicionados na parte inferior.
   8. Executar o ensaio sobre um sistema de PCR em tempo real. O protocolo padrão consiste de primeiro passo, a 50 ° C durante 2 min, um aquecimento inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido por 45 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 15 seg, e um iniciador / sonda combinada e recozimento alongamento à 60 ° C durante 1 min.
   9. Guardar os dados no fim do programa de PCR.
      NOTA: Para evitar a contaminação cruzada DNA, lembre-se: para seguir as recomendações de boas práticas de laboratório para PCR quantitativa, ao estabelecer o tempo real PCR: usar áreas / salas separadas para extração de ácidos nucléicos,preparação de reagentes, manipulação plasmídeo, reacção de amplificação; usar conjuntos de pipeta separadas; mudar luvas / casacos, conforme apropriado.
2. Resultados e cálculo:
   NOTA: As etapas a seguir são baseadas em nossa experiência com o software fornecido com o real-time PCR instrumento mencionado na Tabela Materials, mas, em geral, devem aplicar-se a outras plataformas e softwares de análise de PCR em tempo real. Tenha em mente que, mesmo usando o mesmo software, geralmente há mais de uma maneira de executar os comandos necessários (por exemplo, ícones, atalhos).
   1. Abra o arquivo de resultado salvo no software e clique na aba "Resultados". No topo da janela, clique no menu "Análise" e selecione "Configurações de análise". Deixe o software determinar o limiar automaticamente, selecionando "Todos os" detectores e "Auto Ct" (Ct ciclo = limite. Deixe o conjunto de software "Linha de Base Automatic"; para o fundo eliminação por padrão.
   2. Clique na aba com o nome "Plot Amplification" e, na parte direita da janela, selecione um dos três "detectores" no menu drop-down correspondente (por exemplo, começar com TRECs). Logo abaixo, selecione "Ct Manual" para definir manualmente um limite; ir para a parte inferior da janela e seleccionar os poços correspondentes aos pontos de diluição curva padrão do detector escolhido para mostrar as parcelas de amplificação. Para isso basta clicar e arrastar o mouse sobre as células correspondentes da tabela.
      1. Para ajustar o limite manualmente, arraste a linha limite vermelho para cima e para baixo, e, em seguida, clique em "Analisar" para re-analisar resultados. Para verificar como a definição do limite afeta os resultados, selecione a guia "Relatório", e ver o Ct resultante dos respectivos pontos de diluição curva padrão. Ao mover o limite, para tentar cumprir as seguintes recomendações para obter um melhor posicionamento.
      2. Volte para a aba "Amplification Plot" e verifique se o limite está em uma região de amplificação exponencial suficientemente acima do ruído de fundo, mas abaixo da fase de platô. Se o enredo de amplificação não é mostrado em escala logarítmica, clique com o botão direito sobre o enredo de recordar as "Configurações de Gráfico" e defina cenário pós-run-eixo Y como "log", defina a meio caminho limite na parte linear da da trama, e observar as curvas de amplificação aproximadamente paralelos um ao outro.
      3. Clique na guia "Relatório" para ver os resultados do CT. Certifique-se de que a colocação limiar produziu resultados que maximizam a precisão das duas repetições de cada Padrão pontos de diluição curva.
      4. Verificar que o limiar é colocado no ponto que melhor reflecte as ordens de magnitude extremos dos pontos de diluição padrão (curva de sensibilidade óptima). Repita o passo 4.2.2 e sub-etapas restantes para os restantes dois detectores (KRECs e TCRAC).
      5. Vá até a aba Report, arraste o mouse novamente na tabela na parte inferior da janela para selecionar as células correspondentes aos poços da curva padrão para todos os detectores (TRECs, KRECs, TCRAC). Verifique se o Ct resultante das três metas é muito semelhante nos mesmos pontos de diluição (por exemplo, diferença não superior a 0,5 Ct). Reajuste limiares se necessário e verifique novamente.
         Observação: Uma vez que o plasmídeo de inserção de triplo contém uma única cópia de cada alvo e, portanto, a razão de amplificação, teoricamente, deveria ser perto de 1: 1: 1. Em alguns casos, pode ser necessário ajustar manualmente também a linha de base para um ou mais dos detectores para obter melhores resultados. Basta recordar a janela "Configurações de análise", selecione o detector para o qual é necessário o ajuste, em seguida, defina "Linha de Base Manual", e inserir valores personalizados para o Início e Fim Cycles (geralmente de 3 a 15). Em seguida, clique em "OK & Reanalisar" e volte a verificar os pontos anteriores.
   3. Aceitar a sessão experimental só depois de verificar o seguinte:
      1. Clique na guia "Relatório", vá para a parte inferior da janela, selecione poços NTC e verifique se o Ct correspondente é "undet" (ou seja, nenhuma amplificação está presente em poços NTC).
      2. Selecione a aba "Curva Standard" e olhar para a direita da janela do enredo; selecione detectores a partir do menu drop-down e veja se a inclinação da curva padrão relatado varia entre -3,55 e -3,32 (correspondente à PCR eficiências de 91 - 100%)
      3. Certifique-se que o coeficiente de determinação (R ²⁾ é maior do que 0,998 (Figura 2), pela leitura de seu valor logo abaixo da encosta e de interceptação (na mesma aba "Curva Standard", após a seleção de cada detector).
         NOTA: Preste atenção aos pontos de diluição extremas porque o seu desalinhamento pode afetar a inclinação mais facilmente (eles têm uma leve alta "raiva efeito "na linha de regressão). Em particular, tenha em mente que a maior diluição plasmídeo pode degradar mais cedo do que o esperado. No entanto, sempre que possível, é útil não descartá-los, porque uma abordagem racional podem ser de considerar 100 como o limite de detecção quantitativa: por outras palavras, para as amostras entre 10 e 100, o resultado pode ser classificado como <100 ou "positiva , mas não quantificável ", enquanto que, se fora da faixa de curva (<10), pode ser relatado como 0 ou" indetectável ".
         NOTA: Pode ser útil para manter um arquivo dos valores Ct de diluições da curva padrão anteriores, a fim de calcular um valor médio para cada ponto de diluição de ser mantido como uma espécie de ideal "de referência" intervalo ou verificação interna de qualidade para futuros experimentos (por exemplo, calcular média e SD para construir gráficos de controle de Shewhart). Analogamente, pode ser útil para manter um arquivo de passado o Ct do controlo positivo.

Figura 2. As curvas padrão para TRECs, KRECs e TCRAC. Gráficos dos pontos da curva padrão e linha de regressão log-estima para TRECs (A), KRECs (B), e TCRAC (C) são construídos para verificar a conformidade com a exponencial ideal taxa de amplificação (declive = 3,32), que corresponde a uma eficiência de 100%. Ct: ciclo limiar; R ^2:. Coeficiente de regressão de determinação por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. 3. 4. Clique na guia "Relatório" e verifique se o Ct do controlo positivo (encontrado nas células correspondentes da tabela sob o gráfico) é consistente com os resultados dos ensaios anteriores sobre a same conhecido controlo positivo.
         NOTA: A guia "Relatório" mostra a quantidade de TRECs, KRECs e TCRAC das amostras sendo testadas que o software foi calculada por interpolação a partir da curva padrão respectiva, usando os valores Ct obtidos após o limite da linha de base e foram devidamente ajustado (a nova análise com um novo limiar / baseline mudaria esses resultados). Para ver onde a interpolação ocorre na curva padrão, selecione a guia "Curva Standard", em seguida, selecione os poços desejados, e olhar para o "X" preto que aparece na linha de regressão. Seu valor eixo y é a quantidade interpolados. Se usar sempre o mesmo controle positivo, intervalos adequados de referência e / ou gráficos de controle de qualidade pode ser construída, com base em valores anteriores determinados com controlo positivo.
   4. Clique no menu "Arquivo", "Salvar", e depois "Export" para um arquivo .csv para exportar as quantidades de todos os poços em um tearquivo xt contendo valores separados por vírgulas.
   5. Importe the.csv arquivo em um software de planilha e calcular o número de TRECs ou KRECs por 10 ⁶ PBMC, definindo a seguinte fórmula adequada: [(quantidade de TRECs ou KRECs média) / (quantidade de TCRAC / 2 média)] x 10 ⁶
      NOTA: A quantidade média de TCRAC é dividido por 2 em cada célula porque existem duas cópias do gene TCRAC, por exemplo, um para cada cromossoma.
      NOTA: A consistência do número final de TRECs e KRECs de controlo positivo pode ser considerada, mas tenha em mente que os valores não irá combinar perfeitamente com por causa da variabilidade acrescentado dos pontos de diluição curva padrão. Em caso de divergência bruto, a experiência pode ter de ser repetido. Mais uma vez, os gráficos de controle podem ser construídos para definir um intervalo de referência apropriado.
   6. (Opcional, mas recomendado) Se os resultados da contagem de sangue completo estão disponíveis, calcular os TRECs ou KRECs por ml de sangue, utilizando a seguinte fórmula:
      TRECs ou KRECs por 1 x 10 ⁶⁾ x (linfócitos + monócitos em 1 ml de sangue) / 10 = ⁶ cópias / ml.

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Resultados

O ensaio foi realizado em uma amostra representativa de 87 controles saudáveis: 42 crianças com idades entre 0-17 (masculino / feminino: 25/17) e 45 adultos com idades entre 24-60 (homens / mulheres: 29/16). Os resultados foram obtidos como TRECs e KRECs por 10 ⁶ PBMC, e, em seguida, os TRECs e KRECs por ml de sangue foram calculados.

O número de TRECs diminui com a idade, devido a involução do timo, ^4, em especial de uma forma muito acentuada de 0 a 3 - 4 anos. Em...

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Discussão

TREC and KREC quantification can be considered a good estimate of recent thymic and bone marrow output provided that some caveats are taken into account. Even though an absolute quantification method employing standard curve requires more reagents and more space on the real-time PCR reaction plate, it ensures highly accurate quantitative results because unknown sample quantities are interpolated from standard curves built upon known amounts of starting material. Moreover this method is better fitted to detect low amount ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Histopaque-1077	Sigma Aldrich SRL	10771-500 ML	density gradient separation method
QIAamp DNA Blood Mini Kit (250)	QIAGEN	51106	DNA extraction
Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol	Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l		Resuspend the lyophilized product to 100 pmol/µl
AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25 mM MgCl2	Applied Biosystems/Life-Technologies	N8080156
GeneAmp dNTP Blend (100 mM)	Applied Biosystems/Life-Technologies	N8080261
TOPO TA Cloning Kit for Subcloning	Invitrogen/Life-Technologies	K4500-01
XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells	Stratagene	200130
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1223
SpeI 500U	New England Biolabs	R0133S
HindIII-HF 10,000 U	New England Biolabs	R3104S
PureYield Plasmid Midiprep System	Promega	A2492
XhoI 5,000 U	New England Biolabs	R0146S
TRIS Utrapure	Sigma Aldrich SRL	T1503
EDTA	Sigma Aldrich SRL	E5134
TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA)
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems/Life-Technologies	4364338
Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol	Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l		Resuspend the lyophilized product to 100 pmol/µl
NanoDrop 2000c spectrophotometer	ThermoFisher
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler	Applied Biosystems/Life-Technologies	4359659
Fast 7500 Real-Time PCR system	Applied Biosystems/Life-Technologies
SDS Sequence Detection Software 1.4	Applied Biosystems/Life-Technologies