Quantification simultanée de T-Cell Receptor Cercles excision (TREC) et cercles K-Suppression recombinaison Excision (KRECs) par PCR en temps réel

Résumé

Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.

Résumé

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/10⁶ cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.

Introduction

Cercles d'excision du récepteur des cellules T (TREC) et des cercles recombinaison excision K-suppression (KRECs) sont de petits éléments d'ADN circularisées qui sont excisés dans une proportion de lymphocytes T et les cellules B, respectivement, au cours d'un processus de recombinaison d'ADN génomique, ce qui conduit à la formation d'un répertoire très diversifié de récepteurs T et cellules B. Ils ne ont aucune fonction, mais parce qu'ils sont stables et ne peuvent être reproduites, elles sont diluées après chaque division cellulaire, ainsi que la persistance dans l'une des deux cellules filles. Par conséquent, les niveaux dans le sang périphérique peuvent être considérées comme une estimation de la production de la moelle osseuse et le thymus.

Bien que le dosage TREC a été largement utilisé au cours des 15 dernières années pour évaluer l'ampleur de la production thymique, ^une KREC le dosage, qui a été initialement développé pour mesurer la prolifération des lymphocytes B et sa contribution à l'homéostasie des lymphocytes B dans la santé et la maladie, ² a été récemment proposé comme marqueur de l'os mflèche sortie. ^3,4 Ici, nous décrivons la méthode que nous avons développé pour la quantification simultanée des deux TREC et KRECs. ⁴

Avec cette méthode combinée, la variabilité associée à la quantification de l'ADN par PCR en temps réel est éliminé par l'utilisation d'une courbe standard unique, obtenue par dilution d'un plasmide à triple insert contenant des fragments de TREC, KRECs et récepteur de cellules T alpha constant (TCRAC) gène dans un rapport de 1: 1: 1. Cela permet une évaluation plus précise du nombre de copies TREC et KREC. De plus, la quantification simultanée des deux cibles dans la même réaction permet de réduire les coûts de réactifs.

Le dosage TREC / KREC proposé peut être utile de mesurer l'ampleur de T et cellules B néo-production chez les enfants ou adultes avec déficit immunitaire combiné sévère (SCID), ⁴ immunitaire commun variable, ⁵ maladies auto-immunes, ^6-8 et l'infection à VIH . ⁹ En outre, il peut être utilisé poursurveiller le rétablissement immunitaire après greffe de cellules souches hématopoïétiques, ¹⁰ le remplacement de l'enzyme, ¹¹ et antiviral ⁹ ou immunomodulateurs thérapies. ^8.6 Enfin, parce que les patients SCID sont comptabilisées en utilisant un dosage TREC malgré les défauts génétiques sous-jacentes, et une agammaglobulinémie patients peuvent être identifiés en utilisant KREC quantification , le dosage TREC / KREC peut également être utilisé pour détecter immunodéficiences dans les programmes de dépistage néonatal. ¹² Dans ce cas, le test doit être effectué sur l'ADN extrait de petites taches de sang effacé et séché sur du papier filtre, doit être hautement sensible et spécifique pour les maladies cibles, ainsi que les très reproductible et rentable.

L'introduction de KREC quantification dans le test devrait améliorer les performances de dépistage néonatal de déficits immunitaires, qui a régulièrement été effectuées dans les certaines parties des Etats-Unis (WI, MA, CA) depuis 2008 quand le Wisconsin est devenu le premier à Introduce l'analyse de TREC dans son programme de dépistage postnatal. ¹³

Protocole

déclaration d'éthique: NOTE: Ce protocole suit les lignes directrices de notre institution, le Spedali Civili di Brescia

1. Préparation d'un "Triple-Insertion" plasmide

1. Sélection et préparation du matériel de départ approprié:
   1. Obtenir un échantillon contenant des cellules très susceptibles d'avoir TREC et KRECs détectable par PCR, tel que le sang périphérique d'un sujet jeune en bonne santé recueillies dans des tubes EDTA.
      NOTE: A l'origine, nous avions développé la méthode utilisant thymocytes pour TREC et cellules mononucléaires à partir de fragments de l'amygdale pour KRECs, mais des sujets sains ont généralement un montant de TREC et KRECs suffisantes pour permettre leur détection par PCR. Par conséquent, le sang périphérique devrait être une alternative valable, plus facile à obtenir et à travailler avec. Considérant que TREC, en particulier, diminuer avec l'âge chez les adultes en bonne santé, le sang périphérique d'un jeune adulte, si ce ne est à partir enfants, est conseillé.
   2. Mononuc séparée de sang périphériqueLear cellules (PBMC) par un procédé de séparation par gradient de densité standard.
2. extraction de l'ADN:
   1. Extraire l'ADN à partir de PBMC en utilisant un kit commercial DNA Mini sang. Suivez les instructions du fabricant avec les quelques modifications décrites ci-dessous.
      1. Incuber les échantillons à 70 ° C (au lieu de 56 ° C) pendant 10 min en utilisant un agitateur-incubateur à 1400 tours par minute.
      2. Ajouter le tampon d'élution chauffé à 70 ° C à la colonne, incuber pendant 5 minutes à 70 ° C et éluer l'ADN par centrifugation comme selon les instructions du fabricant. Déterminer la concentration de l'ADN extrait par estimation spectrophotométrique à 260/280 nm.
3. Préparation d'un plasmide contenant les inserts de TREC et Krec joints de signal (SJ) et gène de référence de TCRAC:
   1. Amplifier l'ADN extrait de PBMC (pour obtenir le TREC-SJ, KREC-SJ, et des fragments TCRAC) avec des amorces spécifiques TREC, KRECs et TCRAC (voir le tableau 1).
      NOTE: A l'extrémité 5 ', les amorces KREC- et TCRAC spécifiques contiennent des sites de restriction HindIII et Spel (en minuscule dans les séquences présentées Tableau 1) avec un nombre approprié de flanquant nucléotides supplémentaires (indiqué en italique); les deux fonctions ne sont pas présents dans les séquences Krec et TCRAC canoniques.

TREC	avant	5'-AAA GAG GGC AGC CCT CTC CAA GGC-3 '
	inverser	5'-GGC TGA TCT TGT CTG ACA TTT GC-3 '
KRECs	avant	5'CCC aag ctt TCA GCG CCC ATT ACG TTT CT-3 '
	inverser	5'CCC aag ctt GTG AGG GAC ACG ACG CC-3 '
TCRAC	avant	5'-G ac tag LOI TAT GAG CAC GTGTGC CAG-3 '
	inverser	5'-G ac tag TGC TGT TGT TGA AGG CGT TTG C-3 '

Tableau 1. Amorces utilisées pour les procédures de clonage. A l'extrémité 5 ', en minuscules sont indiqués nucleotides correspondant à des sites d'enzymes de restriction, tandis que représenté en italique sont ajoutés flanquant nucléotides.

3. 2. Effectuer des réactions de PCR dans un volume final de 25 ul, comprenant de 1 x tampon II, 1,5 mM MgCl _2, dNTP mix (200 uM chacun), les amorces à la concentration finale de 900 nM, l'ADN polymerase AmpliTaq (2,5 U / pl 25), et 100 ng d'ADN.
   3. Utiliser les paramètres suivants: première étape de PCR à 95 ° C pendant 10 min, suivies de 40 cycles de 95 ° C pendant 30 sec; 60 ° C pendant 30 sec; 72 ° C pendant 30 sec, et enfin 1 cycle de 72 ° C pendant 10 min. Longueurs de produits PCR devraient être: 380 pb pour TREC, 166 pb pour KCER, 381 pb pour TCRAC.
   4. Insérer le produit de PCR de TREC-SJ dans le site accepteur TA de pCR2.1-TOPO vectorielle. Transformer l'ADN plasmidique dans des cellules chimiquement compétentes XL1-blue par choc thermique suivant le protocole fourni avec les cellules. Parmi les colonies qui poussent raison de la résistance à l'ampicilline, identifier ceux portant l'insert, qui apparaîtra blanc parce que de la perte de complémentation β-galactosidase, et ensemencer les dans un plat de maître. Enfin, identifier les colonies contenant le fragment TREC par PCR.
   5. Développer une des colonies identifiées et purifier l'ADN plasmidique en utilisant un kit de miniprep de plasmide et suivre les instructions du fabricant. Digérer l'ADN de plasmide et le produit amplifié de TCRAC avec l'enzyme de restriction Spel et ligaturer le fragment TCRAC dans le site de restriction Spel.
   6. Transformer l'ADN plasmidique dans des cellules XL1-blue et identifier les colonies contenant le fragment TCRAC par PCR. Développer une des colonies identifiées et purifierl'ADN plasmidique en utilisant le kit de plasmide miniprep.
   7. Digérer l'ADN de plasmide et le produit amplifié KREC avec HindIII et cloner le fragment KREC-SJ dans le site de restriction HindIII. Transformer l'ADN plasmidique dans des cellules XL1-blue et identifier les colonies contenant le troisième fragment par PCR.
   8. Vérifier, par séquençage direct, la présence des trois inserts et l'absence de mutations. La carte du plasmide à triple finale insert est représenté sur la figure 1.

Figure 1. Triple-insert carte de plasmide. Triple-insert plasmide carte montrant la position des séquences TREC, Krec, TCRAC et sites d'enzymes de restriction. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

3. 9. Développer une des colonies identifiées, de purifier l'ADN plasmidique en utilisant un kit de plasmide midiprep. Déterminer la concentration d'ADN plasmidique par estimation spectrophotométrique à 260/280 nm et la qualité de l'ADN par électrophorèse sur gel. Entreposer des portions appropriées du plasmide à -80 ° C (par ex., 50 pl chacun).

2. Préparation courbe standard

NOTE: Préparer toutes les dilutions dans un tampon 0,1x TE dans un endroit spécialement conçu pour le confinement de l'ADN report.

1. Calculer la masse des nombres de copies de plasmide d'intérêt (voir le tableau 2), en tenant compte du fait que la taille de plasmide est 4846 pb et que la masse moyenne par pb est 1,096 x 10 ^-21 g / pb, et donc: m _p = ( 4846 pb) x (1,096 x 10 ^-21 g / pb) = 5,311.216 x 10 ^-21 g = 5,311 x 10 ^-18 g.

Copie #	x 5,311 x 10 -18 g	Masse d'ADN plasmidique (g)
1 x 10 6		5,311 x 10 -12
1 x 10 5		5,311 x 10 -13
1 x 10 4		5,311 x 10 -14
1 x 10 3		5,311 x 10 -15
1 x 10 2		5,311 x 10 -16

Tableau 2. Masse du plasmide nécessaire pour chaque point courbe de dilution standard.

2. Calculer les concentrations d'ADN plasmidique en divisant la masse de plasmides nécessaires par le volume (5 ul) à distribuer dans chaque réaction (voir le tableau 3).

Masse d'ADN plasmidique (g)	÷ 5 ul	La concentration finale d'ADN plasmidique (g / ul)
5,311 x 10 -12		1,062 x 10 -12
5,311 x 10 -13		1,062 x 10 -13
5,311 x 10 -14		1,062 x 10 -14
5,311 x 10 -15		1,062 x 10 -15
5,311 x 10 -16		1,062 x 10 -16

Tableau 3. Calcul des concentrations de plasmides requis pour chaque point de dilution.

3. Décongeler une aliquote du plasmide. Linéariser 2 pg de l'ADN du plasmide avec Xhol et déterminer la concentration bestimation spectrophotométrique y à 260/280 nm.
4. Préparer une dilution appropriée de l'ADN de plasmide linéarisé afin de parvenir à une solution stock de travail commode de commencer à partir de (par exemple, 100 ng / pl = 0,1 ug / ul = 1 x 10 ^-7 g / ul). Stocker le reste de l'ADN de plasmide linéarisé à -80 ° C.
5. Effectuer un nombre commode de 1:10 ou 1: 100 dilution pour amener le plasmide à une concentration plus pratique de 1 x 10 ^-10 g / ul.
6. Utiliser la formule C ₁ V ₁ = C ₂ V ₂ pour calculer le volume de dilution (V ₂ - V ₁₎ nécessaires à la préparation du premier point de la série de la courbe standard (1 x 10 ⁶ copies, correspondant à 1,062 x 10 ^-12 g / 5 pi; voir tableau 4).

Conc initiale. (G / ul)	L'ADN plasmidique vol (ul)	Diluent vol (ul)	Vol final. (Ul)	Conc. (G / ul)	Numéro de copie finale d'ADN plasmidique / 5 pi
C 1	V 1	V 2 -V 1	V 2	C 2
1 x 10 -7	5 ul	45 ul	50 ul	1 x 10 -8	N / A
1 x 10 -8	5 ul	495 pi	500 ul	1 x 10 -10	N / A
1 x 10 -10	5 ul	465 pi	470 pi	1,062 x 10 -12	1 x 10 6
1,062 x 10 -12	50 ul	450 pi	500 ul	1.062 x 10 -13	1 x 10 5
1,062 x 10 -13	50 ul	450 pi	500 ul	1,062 x 10 -14	1 x 10 4
1,062 x 10 -14	50 ul	450 pi	500 ul	1,062 x 10 -15	1 x 10 3
1,062 x 10 -15	50 ul	450 pi	500 ul	1,062 x 10 ~ 16	1 x 10 2

Tableau 4. calculs de dilution.

7. Procéder à une série régulière de 01h10 dilutions pour obtenir les points de la courbe standards restants.
   NOTE: Ne oubliez pas de vortex chaque dilution de plasmide brièvement avant d'effectuer la prochaine.
   NOTE: La plus forte dilution de la standard courbe (10 copies / ul 5) doit être préparé juste avant l'analyse, car une telle petite quantité d'ADN plasmidique ne est pas assez stable pour être stocké pour un usage ultérieur.
8. Stocker les points de dilution triple plasmide à -80 ° C dans des tubes séparés jusqu'à l'utilisation. L'ADN plasmide à triple dilué est très stable pendant au moins 6 mois.

3. extraction d'ADN à partir d'échantillons cibles

1. Les PBMC à partir de sang périphérique séparée recueilli dans des tubes EDTA en utilisant le procédé à gradient de séparation par densité.
   NOTE: Vous pouvez également utiliser un autre matériau de départ approprié (par exemple, triés sous-populations lymphocytaires, le sang total) que l'échantillon cible.
2. Extraire l'ADN à partir d'échantillons de PBMC cibles comme indiqué dans l'étape 1.2.

4. PCR en temps réel pour la quantification des TREC et KRECs

1. la préparation de la plaque et le chargement:
   1. Disposer une plaque PCR y compris au moins deux répétitions pour chaque échantillonà analyser: courbe standard (A → F 1 → 4), le contrôle positif (CTRL ^+; G1 → 4) et sans matrice de contrôle (NTC; H 1 → 4).
      NOTE: observer un schéma typique dans le tableau 5, mais différents formats peuvent être créés. Rappelez-vous que TREC et KRECs seront amplifiés ensemble dans les mêmes puits, distincts de ceux de TCRAC.

	TREC + KRECs une		TCRAC b		TREC + KRECs		TCRAC		TREC + KRECs		TCRAC
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Un	10 6 copies	10 6 copies	10 6 copies	10 6 copies	1	1	1	1	9	9	9	9
B	10 5 copies	10 5 copies	10 5 copies	10 5 copies	2	2	2	2	10	10	10	10
C	10 4 copies	10 4 copies	10 4 copies	10 4 copies	3	3	3	3	11	11	11	11
Ré	10 3 copies	10 3 copies	10 3 copies	10 3 copies	4	4	4	4	12	12	12	12
E	10 2 copies	10 2 copies	10 2 copies	10 2 copies	5	5	5	5	13	13	13	13
Fa	10 copies	10 copies	10 copies	10 copies	6	6	6	6	14	14	14	14
Sol	CTRL +	CTRL +	CTRL +	CTRL +	7	7	7	7	15	15	15	15
H	NTC	NTC	NTC	NTC	8	8	8	8	16	16	16	16

Tableau 5. Exemple en temps réel plaque PCR.

1. 2. Calculer le nombre total de puits nécessaires (y compris les 1-2 puits supplémentaires pour tenir compte des erreurs de pipetage possibles) et préparer le mélange maître pour TREC / KRECs et TCRAC dans des tubes séparés (voir tableau 6).
      NOTE:. Les amorces et sondes spécifiques de TREC, KRECs et TCRAC sont mentionnés dans le tableau 7 L'AMORCE ET SONDE concentrations finales sont 900 nM et 200 nM, respectivement.

TREC / KRECs		TCRAC
H 2 O	2 ul	H 2 O	4,75 pi
KRECs à 20 pmol / ul	1,125 ul	TCRAC 20 pmol / ul	1,125 ul
KRECs rev 20 pmol / ul	1,125 ul	TCRAC rev 20 pmol / ul	1,125 ul
Sonde KRECs 10 pmol / ul	0,5 ul	Sonde TCRAC 10 pmol / ul	0,5 ul
TREC 20 pmol / ul	1,125 ul	2x TaqMan Universal PCR Master Mix	12,5 pi
TREC rev 20 pmol / ul	1,125 ul
Sonde TREC 10 pmol / ul	0,5 ul
2x TaqMan Universal PCR Master Mix	12,5 pi

Tableau 6. Volume de réactifs nécessaires pour les puits indiqués.

TREC	avant	5'-CAC UneTC CCT TTC AAC CAT GCT-3 '
	inverser	5'-TGC AGG TGC TGC CTA ATC A-3 '
	sonde	5'-FAM-ACA CCT CTG GTT TTT GTA GTG AAG CCC ACT-TAMRA-3 '
KRECs	avant	5'-TCC CTT AGT GGC ATT ATT TGT ATC ACT-3
	inverser	5'-AGG AGC CAG CTC TTA CCC TAG AGT-3 '
	sonde	5'-HEX-TCT GCA CGG GCA GCA GGT TGG-TAMRA-3
TCRAC	avant	5'-TGG CCT AAC CCT GAT CCT CTT-3 '
	inverser	5'-GGA TTT AGA GTC TCT CAG CTG GTA CAC-3
	sonde	5'-FAM-TCC CAC AGA TAT CCA GAA CCC TGA CCC-TAMRA-3 '

Tableau 7. séquence de l'amorce et des sondes pour le temps réel PCR dosage.

1. 3. Ajouter 20 ul de chaque mélange (TREC / KRECs et TCRAC). Avant de quitter la salle de préparation de réactif, sceller la plaque de réaction avec un couvercle adhésif optique.
   4. Dans une salle d'extraction d'acide nucléique, soulevez le couvercle adhésif et ajouter 5 ul d'échantillon d'ADN génomique (400-500 ng) dans les puits. Ajouter 5 ul de l'ADN génomique (par exemple, préparée à partir des PBMC obtenues à partir de sang de cordon ombilical) aux puits CTRL ^+.
      NOTE: Comme alternative à sang de cordon ombilical, utiliser l'ADN de la même connue, échantillon de sang périphérique positive ou mélange d'échantillons, ou préparer un critère positif "artificielle" en mélangeant une quantité déterminée de triple-insert plasmide avec l'ADN génomique de TREC- et les lignes cellulaires KREC négatif.
   5. Ajouter 5 ul d'eau dans les puits NTC. Sceller à nouveau le plateau de réaction avec le couvercle de la colle optique.
   6. Déplacer vers un endroit assurant le confinement de l'ADN plasmidique report; dégeler chaque poin de dilutiont de la courbe plasmide standard d'ADN seulement avant utilisation et préparer la dilution la plus élevée (10 copies / 5 pi). Soulevez le couvercle adhésif seulement d'un → H 1 → 4 puits et ajouter 5 ul de chaque dilution de point de courbe plasmide standard d'ADN. Sceller le couvercle de la colle.
   7. Vérifier l'absence de bulles sur le fond des puits, assurant ainsi que les réactifs sont placés au fond.
   8. Exécutez le test sur un système PCR en temps réel. Le protocole standard est constitué de première étape à 50 ° C pendant 2 minutes, un chauffage initial à 95 ° C pendant 10 min, suivie de 45 cycles de dénaturation à 95 ° C pendant 15 s, et une amorce / sonde combiné recuit et allongement à 60 ° C pendant 1 min.
   9. Sauvegardez les données à la fin du programme de PCR.
      REMARQUE: Pour éviter la contamination croisée de l'ADN, ne oubliez pas: à suivre les recommandations de bonnes pratiques de laboratoire habituelles pour la PCR quantitative lors de la création de la PCR en temps réel: utilisez les zones / chambres séparées pour l'extraction de l'acide nucléique,la préparation des réactifs, la manipulation plasmide, la réaction d'amplification; utiliser des ensembles de pipettes séparées; Changer de gants / manteaux, le cas échéant.
2. Résultats et calcul:
   REMARQUE: Les étapes suivantes sont basées sur notre expérience en utilisant le logiciel fourni avec l'instrument PCR en temps réel mentionné dans le tableau des matériaux, mais, en général, ils devraient se appliquer à d'autres plates-formes en temps réel d'analyse PCR et logiciels. Gardez à l'esprit que, même si vous utilisez le même logiciel, il ya généralement plus d'une façon d'exécuter les commandes requises (par exemple, icônes, raccourcis).
   1. Ouvrez le fichier résultat enregistré dans le logiciel et cliquez sur l'onglet "Résultats". Le haut de la fenêtre, cliquez sur le menu "Analyse" et sélectionnez "Paramètres d'analyse". Laissez le logiciel détermine automatiquement le seuil en sélectionnant "Tous" et détecteurs (le cycle de seuil Ct = "Auto Ct". Soit l'ensemble de logiciels "automatique de base"; pour le fond élimination par défaut.
   2. Cliquez sur l'onglet nommé "Amplification Plot» et, à la partie la plus à droite de la fenêtre, sélectionnez l'une des trois «détecteurs» dans le menu déroulant correspondant (par exemple, commencer par TREC). Juste en dessous, sélectionnez "Manuel Ct" pour régler manuellement un seuil; aller à la partie inférieure de la fenêtre et sélectionnez les puits correspondant aux points du détecteur choisi courbe de dilution standard pour montrer les parcelles d'amplification. Pour ce faire il suffit de cliquer et faire glisser la souris sur les cellules correspondantes de la table.
      1. Pour régler le seuil manuellement, faites glisser la ligne de seuil rouge de haut en bas, puis cliquez sur "Analyser" pour réanalyser les résultats. Pour vérifier le réglage du seuil affecte les résultats, sélectionnez l'onglet «Rapport», et voir le Ct résultant des points courbe de dilution standards respectifs. Lors du déplacement du seuil, essayer de se conformer aux recommandations suivantes pour obtenir un placement optimal.
      2. Retour à l'onglet «Amplification Plot» et vérifiez que le seuil est dans une région d'amplification exponentielle suffisamment au-dessus du bruit de fond, mais en dessous de la phase de plateau. Si la courbe d'amplification ne est pas représenté en échelle logarithmique, cliquez-droit sur la parcelle de rappeler les "Paramètres Graphique" et mis en valeur Y-axe après la course que "log", de fixer le seuil à mi-chemin dans la partie linéaire de la intrigue, et observer les courbes d'amplification sensiblement parallèles les uns aux autres.
      3. Cliquez sur l'onglet «Rapport» pour voir les résultats Ct. Assurez-vous que le placement de seuil a produit des résultats qui optimisent la précision des deux répétitions de chacun des points courbe de dilution standard.
      4. Vérifiez que le seuil est placé à l'endroit qui reflète le mieux les ordres de grandeur extrêmes des points courbe de dilution standard (de sensibilité optimal). Répétez l'étape 4.2.2 et sous-étapes restantes pour les deux détecteurs restants (KRECs et TCRAC).
      5. Allez à l'onglet Rapport, faites glisser la souris à nouveau dans le tableau à la partie inférieure de la fenêtre pour sélectionner les cellules correspondant aux puits de la courbe standard pour tous les détecteurs (TREC, KRECs, TCRAC). Vérifiez que le Ct résultant des trois cibles est très similaire aux mêmes points de dilution (par exemple, différence non supérieure à 0,5 Ct). Réajuster seuils si nécessaire et re-vérifier.
         Remarque: étant donné le plasmide à triple insert contient une copie unique de chaque cible et par conséquent le rapport d'amplification doit théoriquement être proche de 1: 1: 1. Dans certains cas, il peut être nécessaire d'ajuster manuellement la valeur de référence également pour une ou plusieurs des détecteurs d'obtenir de meilleurs résultats. Juste rappeler la fenêtre «Paramètres d'analyse", sélectionnez le détecteur pour lequel le réglage est nécessaire, puis régler "Manuel de référence", et insérez des valeurs personnalisées pour le début et Cycles finaux (généralement de 3 à 15). Puis cliquez sur "OK ​​& Reanalyze" et revérifier points précédents.
   3. Accepter la session expérimentale qu'après avoir vérifié ce qui suit:
      1. Cliquez sur l'onglet «Rapport», passez à la partie inférieure de la fenêtre, sélectionnez puits NTC et vérifier que le Ct correspondant est "Undet" (ce est à dire, pas d'amplification est présent dans les puits NTC).
      2. Sélectionnez l'onglet "Courbe Standard" et regarder à droite de la fenêtre de tracé; sélectionnez détecteurs dans le menu déroulant et de voir si la pente de courbe standard rapporté varie entre -3,55 et -3,32 (correspondant à la PCR efficacité de 91 à 100%)
      3. Assurez-vous que le coefficient de détermination (R ²⁾ est supérieur à 0,998 (Figure 2), en lisant sa juste valeur en dessous de la pente et l'ordonnée (dans le même onglet "Courbe Standard", après avoir sélectionné chaque détecteur).
         NOTE: Faites attention aux points de dilution extrêmes parce que leur alignement peut affecter la pente plus facilement (ils ont un "leve hauteeffet de rage "sur la ligne de régression). En particulier, gardez à l'esprit que la dilution de plasmide peut se dégrader plus tôt que prévu. Cependant, chaque fois que possible, il est utile de ne pas les jeter, car une approche rationnelle peut être à envisager 100 comme la limite de détection quantitative: en d'autres termes, pour les échantillons entre 10 et 100, le résultat peut être signalé comme <100 ou «positive , mais pas quantifiable ", tandis que si dehors de la plage de la courbe (<10), il peut être signalé comme 0 ou« indétectable ».
         REMARQUE: Il peut être utile de conserver une archive des valeurs de Ct de précédentes dilutions de la courbe standard afin de calculer une valeur moyenne pour chaque point de dilution pour être conservé comme une sorte de optimale "référence" plage ou contrôle de qualité interne pour des expériences futures (par exemple, calculer la moyenne et SD pour construire des cartes de contrôle de Shewhart). De façon analogue, il peut être utile de garder une archive du passé Ct du contrôle positif.

Figure 2. courbes d'étalonnage pour TREC, KRECs et TCRAC. Parcelles de points de la courbe standard et la ligne log-régression estimations pour TREC (A), KRECs (B), et TCRAC (C) sont conçus pour vérifier la conformité avec l'exponentielle idéale taux d'amplification (pente = 3,32) qui correspond à un rendement de 100%. Ct: cycle de seuil; R ^2:. Coefficient de régression de la détermination Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. 3. 4. Cliquez sur l'onglet «Rapport» et vérifiez que le Ct du contrôle positif (qui se trouve dans les cellules correspondantes de la table sous le tableau) est compatible avec les résultats des tests précédents sur la SAme connais contrôle positif.
         REMARQUE: L'onglet «Rapport» indique la quantité de TREC, KRECs et TCRAC des échantillons testés que le logiciel a calculé par interpolation à partir de la courbe standard respective, en utilisant les valeurs Ct obtenues après le seuil et de base ont été correctement réglé (un nouvelle analyse avec un nouveau seuil / base allait changer ces résultats). Pour voir où l'interpolation a lieu sur la courbe standard, sélectionnez l'onglet "courbe standard", puis sélectionner les puits souhaités, et de regarder pour le noir "X" figurant sur la droite de régression. Leur valeur de l'axe y est la quantité interpolés. Si vous utilisez toujours le même contrôle positif, les gammes de référence appropriés et / ou cartes de contrôle de la qualité peuvent être construits, fondée sur des valeurs précédentes déterminés sur le contrôle positif.
   4. Cliquez sur menu "Fichier", "Enregistrer", puis "Exporter" pour un fichier .csv pour exporter les quantités de tous les puits dans un text fichier contenant des valeurs séparées par des virgules.
   5. Importer the.csv fichier dans un tableur et de calculer le nombre de TREC ou KRECs par 10 ⁶ PBMC en définissant la formule suivante appropriée: [(quantité de TREC ou KRECs moyenne) / (quantité de TCRAC / 2 signifie)] x 10 ⁶
      REMARQUE: La quantité moyenne de TCRAC est divisé par deux dans chaque cellule, car il existe deux copies du gène de TCRAC, par exemple une pour chaque chromosome.
      NOTE: La consistance du nombre final de TREC et KRECs de contrôle positif peut être considéré, mais gardez à l'esprit que les valeurs ne correspondent pas parfaitement à cause de la variabilité ajoutée des points courbe de dilution standard. En cas de divergence brute, l'expérience peut être répétée. Encore une fois, les cartes de contrôle peuvent être construits pour définir une gamme de référence approprié.
   6. (Facultatif, mais recommandé) Si les résultats de la numération globulaire complète sont disponibles, de calculer les TREC ou KRECs par ml de sang à l'aide de la formule suivante:
      TREC KRECs ou par 1 x 10 ⁶⁾ x (monocytes + lymphocytes comptent dans 1 ml de sang) / ⁶ = 10 copies / ml.

Résultats

L'analyse a été effectuée sur un échantillon représentatif de 87 témoins sains: 42 enfants âgés de 0 à 17 (mâles / femelles: 25/17) et 45 adultes âgés de 24 à 60 (hommes / femmes: 29/16). Les résultats ont été obtenus sous forme de TREC et KRECs 10 ⁶ par les PBMC, puis les TREC et KRECs par ml de sang ont été calculés.

Le nombre de TREC diminue avec l'âge en raison de l'involution thymique ^4, en particulier d'une manière très forte ...

Discussion

TREC and KREC quantification can be considered a good estimate of recent thymic and bone marrow output provided that some caveats are taken into account. Even though an absolute quantification method employing standard curve requires more reagents and more space on the real-time PCR reaction plate, it ensures highly accurate quantitative results because unknown sample quantities are interpolated from standard curves built upon known amounts of starting material. Moreover this method is better fitted to detect low amount ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Histopaque-1077	Sigma Aldrich SRL	10771-500 ML	density gradient separation method
QIAamp DNA Blood Mini Kit (250)	QIAGEN	51106	DNA extraction
Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol	Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l		Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl
AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25mM MgCl2	Applied Biosystems/Life-Technologies	N8080156
GeneAmp dNTP Blend (100 mM)	Applied Biosystems/Life-Technologies	N8080261
TOPO TA Cloning Kit for Subcloning	Invitrogen/Life-Technologies	K4500-01
XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells	Stratagene	200130
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1223
SpeI 500U	New England Biolabs	R0133S
HindIII-HF 10,000 U	New England Biolabs	R3104S
PureYield Plasmid Midiprep System	Promega	A2492
XhoI 5,000 U	New England Biolabs	R0146S
TRIS Utrapure	Sigma Aldrich SRL	T1503
EDTA	Sigma Aldrich SRL	E5134
TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA)
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems/Life-Technologies	4364338
Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol	Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l		Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl
NanoDrop 2000c spectrophotometer	ThermoFisher
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler	Applied Biosystems/Life-Technologies	4359659
Fast 7500 Real-Time PCR system	Applied Biosystems/Life-Technologies
SDS Sequence Detection Software 1.4	Applied Biosystems/Life-Technologies