بروتوكول لدراسة الانقراض من الخوف مشروطة في ركوب الدراجات وبطبيعة الحال إناث الفئران

Summary

Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.

Abstract

انقراض الخوف مشروط تمت دراسة على نطاق واسع في القوارض الذكور. في الآونة الأخيرة، كانت هناك عدد متزايد من الدراسات تشير إلى أن الآليات العصبية لبعض المهام السلوكية والسلوكيات استجابة مختلفة في الإناث والذكور. يمكن استخدام الإناث في الدراسات البحثية تمثل تحديا بسبب اختلاف الهرمونات الغدد التناسلية أثناء الدورة الشهرية وداقية. يصف هذا البروتوكول إجراءات راسخة التي هي مفيدة في التحقيق في دور هرمون الاستروجين في خوف توطيد الذاكرة الانقراض في إناث الفئران. المرحلة من نزو جنسي والإدارة الاستروجين الخارجية قبل التدريب الانقراض يمكن أن تؤثر استدعاء الانقراض بعد 24 ساعة. تقنية ينظف المهبل لتحديد المرحلة ودقي الموصوفة هنا الإيدز الفحص والتلاعب ركوب الدراجات بشكل طبيعي هرمونات الغدد التناسلية. استخدام هذا النموذج القوارض الأساسي قد يزيد تحدد الآليات التي هرمون الاستروجين يمكن أن تعدل الذاكرة الانقراض الخوف فيالإناث.

Introduction

ويلاحظ الفروق بين الجنسين المتأصلة عبر السلوكيات المعرفية المختلفة ونماذج التعلم في كل من البشر والقوارض. على سبيل المثال، تم الإبلاغ عن أن النساء عموما القدرات اللفظية والتفصيل المنحى أقوى، في حين أن الرجال لديهم القدرات الحيزية أفضل ^1-3. قد تكون هذه الفروق بين الجنسين يرجع ذلك جزئيا إلى تأثير الهرمونات الغدد التناسلية. مستويات استراديول عالية تحسين الأداء على المهام التي تكون فيها المرأة أفضل، ولكن تسوء الأداء على المهام أن الرجال عادة صنعا ^4-6. على الرغم من أن هذه الأدلة مقنعة، وقدرة محدودة على السيطرة تماما البيئات التجريبية في الدراسات الإنسانية يجعل من الصعب تحديد ما إذا كان يمكن أن تعزى هذه التأثيرات على السلوك خصيصا لالهرمونات. الدراسات على الحيوانات، في المقابل، يسمح للظروف التي تسيطر عليها بشكل كامل.

على الرغم من أن تم تحديد الآليات العصبية الأساسية من الخوف الانقراض ومدروسة في الذكور، فإنه من غير الواضح ما إذا كانتهذه الأنظمة هي نفسها في الإناث أو كيف تتغير عبر نزو جنسي. وتستخدم تكييف الخوف والانقراض على نطاق واسع النماذج السلوكية في القوارض والبشر لإجراء الدراسات المتعلقة اضطرابات القلق. وبالنظر إلى أن النساء لديهم مخاطر أعلى للاضطرابات القلق فضلا عن ارتفاع مدة وشدة أعراض ^7-13، فمن الأهمية بمكان لتشمل الإناث في هذه الدراسات. ويمكن أن يعزى النقص في تمثيل الإناث في هذا البحث لتحديات المرحلة ودقي مراقبة والمحاسبة عن الآثار السلوكية الهرمونات الجنسية. المختبرات التي تقوم بفحص الإناث في هذا الصدد القضايا اللقاء الذي غالبا ما تذهب دون الإبلاغ عنها أو لم يتم وصفها في طرق دراستهم.

الأدلة الناشئة في القوارض يشير إلى أن يتم ضبط الفروق بين الجنسين في خوف الانقراض عن طريق الهرمونات الغدد التناسلية ^14-18. في تكييف الخوف، ويتم تدريب الحيوانات للخوف من التحفيز معين. بعد عدد من العروض غير المدعومة منالتحفيز، والحيوانات لا تعلم للخوف من جديلة، وهي عملية تسمى الانقراض. جيدا كيف يتعلم الحيوان ويعزز الذاكرة التعلم يمكن ملاحظتها خلال اختبار استدعاء الانقراض نظرا لبعض الوقت بعد التدريب انقراض هذه المهمة. أقل التعبير الخوف أثناء استدعاء الانقراض يوضح جيد توطيد الذاكرة الانقراض. وتشير النتائج الأخيرة من مختبرنا أن هرمون الاستروجين يمكن أن تعدل توطيد الذاكرة الانقراض الخوف وتحسين استدعاء الانقراض. على وجه التحديد، إناث الفئران التي انطفأت في مقدمات الوداق، ومرحلة من مراحل نزو جنسي خلالها تعميم مستويات هرمون الاستروجين الذروة، المعرض تعزيز الاحتفاظ الذاكرة الانقراض. في المقابل، الإناث التي انطفأت في انخفاض الاستروجين عرض المرحلة تلية الوداق فقيرة نسبيا استدعاء الانقراض، والتي يمكن أن تحسن مع إدارة استراديول خارجي قبل أو مباشرة بعد التدريب الانقراض ^15،16. الآليات العصبية للذاكرة الانقراض التوحيد (بما فيuding دور هرمونات الغدد التناسلية) في الإناث ليست واضحة.

في حيوانات المختبر، ويمكن التحقيق في دور الهرمونات باستخدام الغازية إجراءات الاستئصال الجراحي مثل الإخصاء واستئصال المبيض. وبعد التعافي من عملية جراحية، وغالبا ما هرمونات الغدد التناسلية التلاعب خارجيا أثناء أداء مهمة السلوكية ^19. وقد قدم هذا النهج المعلومات الهامة حول الهرمونات الجنسية ومفيد لأنه يسمح للتلاعب تسيطر عليها بشكل جيد للهرمونات الغدد التناسلية (من حيث التوقيت وجرعة) ^20-23. هذا النهج، ومع ذلك، لا تقييم تأثير التقلبات التي تحدث بشكل طبيعي أن تحدث في شتى أرجاء نزو جنسي كما أنها لا تمثل الحيوانات "طبيعية"، وبالتالي الحد من احتمال متعدية للدراسات الإنسانية. تم موثقة جيدا أن مستويات هرمون الجنس الأنثوي الذروة والانخفاض في مراحل محددة من نزو جنسي، والتغيرات مستقبلات هرمون الاستروجين التعبير ضمن دورة،وبعد استئصال المبيض ^24. وبالتالي، هناك حاجة لإجراء دراسات على الإناث مع الغدد التناسلية سليمة وصقل تصاميم تجريبية لدراسة موثوق الآثار أن الدول عالية ومنخفضة الاستروجين قد يكون على الإناث طيلة حياتها.

يركز هذا البروتوكول على تأثير الاستروجين على أنظمة العصبية الحيوية تشارك في خوف الانقراض. فهو يصف كيفية: 1) ترصد بدقة نزو جنسي، 2) إعداد جرعات فعالة من استراديول لإدارة النظامية، و3) اتباع النموذج السلوكي الذي يتضمن تكييف الخوف والانقراض، وأذكر في ركوب الدراجات بشكل طبيعي إناث الفئران. يمكن تعديل هذا البروتوكول مع التلاعب الدوائية وأدوات أخرى الخلوية والجزيئية للمساعدة من الدراسات لفهم أفضل الفروق بين الجنسين التي لوحظت في مشروط يخشون السلوك الانقراض. لاحظ أن الإجراءات الموضحة أدناه هي تلك المستخدمة داخل المختبر لدينا، وهناك وجود عدد من الاختلافات من هذه الإجراءات طن الأدب.

Protocol

ملاحظة: وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات الواردة في هذا البروتوكول من قبل اللجنة الفرعية للبحوث رعاية الحيوان، والتي هي بمثابة لجنة رعاية واستخدام المؤسسية الحيوان (IACUC) لمستشفى ماساتشوستس العام، وتكون في الامتثال مع المعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية.

1. السكن الحيوانية والإجراءات المناولة

1. ولدى وصوله، والكبار منزل سبراغ داولي الفئران الإناث حوالي 8-10 أسابيع من العمر (وزنها 200-225 ز) في مجموعات من 3-4 بوصة صناديق بلاستيكية مع أغطية فراش رقائق الخشب. المحافظة عليها على نظام غذائي من الوصول بالمال وبالشهرة أيضا الإعلان إلى تشاو والمياه و12 ساعة ضوء / دورة الظلام. ترك الفئران ليتأقلم مع ظروف السكن والحيوان منشأة مدة لا تقل عن 1 في الاسبوع.
   ملاحظة: تتم جميع الإجراءات في هذه المخطوطة خلال دورة الضوء.
2. وبعد هذه الفترة التأقلم، والتعامل مع جميع الحيوانات لمدة 5 دقائق كل لمدة 2-3 أيام. اختيار بشكل صحيح حتى الفئران في وقت واحد (بدعم من الجذع وليس من ذيله)،عقد لهم بشكل آمن، والحيوانات الأليفة لهم خلال هذا الوقت. التعامل مع الحيوانات التي تظهر أكثر أكد ثاب، أو القلق لفترات أطول من الوقت. هل هذا لتقليل التعامل مع الإجهاد، والتي يمكن أن تؤثر على الخطوات التالية في هذا البروتوكول.
   ملاحظة: عدد الأيام وكمية من التعامل مع الحيوانات يمكن أن تختلف بين المختبرات المختلفة الزمن؛ ومع ذلك، ينبغي أن تكون هذه متسقة بين التجارب داخل نفس المختبر.

2. رصد نزو جنسي: المهبلية المسحة رتوش وتلطيخ الداخلي

1. جعل 0.9٪ محلول ملحي (كلوريد الصوديوم الذائب في الماء المقطر). بلل قضيب من القطن ذات الرؤوس في هذا الحل. صمة عار طرف باستخدام منشفة ورقية لتجنب oversaturation، مما قد يؤدي إلى عدم كفاية جمع أو فقدان الخلايا العينة. عقد الذيل إلى أعلى بعيدا عن فتحة المهبل، إدراج بلطف غيض القطن في القناة المهبلية ولفة حول الجدران لالتقاط خلايا المهبل فضفاضة.
2. إذا يبول الحيوان على السريرطن طرف، مع استبدال واحدة جديدة، وتلوث البول سيجعل من الصعب على تحديد المرحلة. كن حذرا للغاية حتى لا تسبب الضيق للحيوان أثناء هذا الإجراء بسبب التعرض للإجهاد سوف يعطل نزو جنسي. عندما ينظف، نهدف إلى تحقيق الإدراج السريع والانسحاب ليست عميقة جدا لتقليل تحفيز اضافي لعنق الرحم، والتي يمكن أن تحدث حمل كاذب.
   يمكن التعرف على حمل كاذب باعتبارها دورة اللاحلقية داقية الذي يستمر عادة لمدة 12 يوما، أي أيام متتالية من هجوع الودق ^25: ملاحظة.
3. إزالة بعناية طرف قضيب ولفة على شريحة المجهر وصفت مسبقا. تجنب الضغط على أسفل من الصعب جدا كما الكثير من السوائل على الشريحة يمكن أن تجعل من الصعب تحديد المرحلة مرة واحدة جافة.
   ملاحظة: واحد الشريحة يمكن أن تحتوي عدة أيام لكل حيوان، على الرغم من أن هذا يمكن أن يتم وفقا لتفضيلات الفردية.
4. تأكد من نقل العينة على الشريحة. جمع عينات لسيفرآل أيام متتالية على شريحة واحدة لتكون قادرة على أفضل مسار وتحديد اليومية مراحل داقية التغييرات.
   ملاحظة: إذا كان ذلك ممكنا، كما أنها مثالية إذا الشعب جمع عينات لا تزال هي نفسها لجميع الحيوانات.
5. مرة واحدة الشريحة جافة، تبدأ بروتوكول تلطيخ لتحديد المرحلة. استخدام عدة تلطيخ (انظر جدول المواد)، تزج الشرائح 10 مرات في تثبيتي (الضوء الأزرق)، 10 مرات في حل وصمة عار (الوردي)، و 5 مرات في حل مباين (اللون الأرجواني). شطف الشرائح بلطف تحت الماء الجاري. السماح الشرائح تماما الهواء الجاف قبل عرض تحت المجهر.
   ملاحظة: تتكون دورة طويلة وداقية عادة 4-5 يوم (بهذا الترتيب): شبق (E)، تلية الوداق (M)، هجوع الودق (D)، ومقدمات الوداق (P) ^26. يتميز شبق من قبل، وخلايا متقرن الزرقاء، تلية الوداق من قبل الكريات البيض ومزيج من خلايا متقرن والأنوية، هجوع الودق هو مماثل لتلية الوداق في وجود أنواع الخلايا باستثناء أنهم متفرق جدا، ومقدمات الوداق من قبل المجاميع الأرجواني الملطخةخلايا الأنوية (الشكل 1). هناك إجراءات تلطيخ المختلفة، بالإضافة إلى تلك المذكورة أعلاه، التي هي نفس القدر من الفعالية لالمهبلية علم الخلايا تشويه.
6. جمع العينات لمدة سنتين على الأقل دورات كاملة (~ 8-10 أيام) من أجل رصد المراحل بدقة قبل التجريب. أن تكون متسقة مع الوقت من اليوم وتؤخذ العينات. جمع عينات مسحة المهبل يوميا في جميع أنحاء وحتى نهاية التجربة.

3. قبل التعرض

1. قبل بدء التجربة، قبل فضح الحيوانات إلى تكييف غرف تسمح للحيوانات حتى يتأقلم مع السياق (غرف تكييف) قبل أي اختبار السلوكي.
   1. قبل فضح الإناث إلى غرف تكييف (الموجود في مربعات تخفيف الصوت) مع أضواء المنزل لمدة 20-30 دقيقة يوميا لمدة 3 أيام قبل أي التجريب. تعيين مربع أنهم باسم الغرفة الخاصة لدراسة تتعرض مسبقا. ر نظيفة تماماانه صناديق (الجدران وصواني) بين الدورات، والحيوانات لإزالة الروائح لأنها يمكن أن تؤثر على السلوك ونزو جنسي.

4. يوم 1: التعويد / تكييف الخوف

1. مرة واحدة وقد تم التحقق من الحيوانات ليكون في مرحلة الشياع من دوراتها داقية، وتبدأ مرحلة التعود / تكييف التجربة لمدة 3 أيام.
   1. خذ ما قبل هجة تدابير أساسية من التجمد (CS) العروض السابقة لهجة الأولى مكيفة التحفيز على كل يوم من التجربة. القيام بذلك عن طريق الحصول على عشرات المئة تجميد (بقسمة ثواني قضى متحرك قبل مدة من المحاكمة، مضروبا 100) أثناء الفاصل الزمني التحفيز غائبا الوقت في بداية أول CS-حدها المحاكمة قبل بداية CS.
      ملاحظة: يمكن استخدام هذه التدابير لتقييم ومقارنة مستويات تجميد أساسية مع تلك خلال التعود، تكييف، الانقراض، والتذكير.
   2. لإجراء تدريب الانقراض خلال المرحلة تلية الوداق،شرط الفئران في اليوم الأخير من للشبق. مسحة وتحديد المرحلة داقية (الخطوة 2) كل يوم قبل بدء بروتوكول تجريبي (تكييف / الانقراض / استدعاء). وبما أن المرحلة شبق قد تستمر لفترة أطول من يوم واحد، واستخدام دورة التاريخ للتنبؤ طول مراحل لتحديد متى الحيوانات جاهزة لبدء التدريب.
2. في غرف تكييف، قم بتوصيل القدم صدمة الطابق الشبكة لمولد التحفيز الكهربائي. استخدام مستوى التحفيز من 0،5-0،6 مللي أمبير كما التحفيز دون شروط (US). استخدام كيلوهرتز 4، 80 ديسيبل لهجة كما المثير الشرطي (CS).
   ملاحظة: قد تختلف هذه المعلمات عبر المختبرات ويجوز تعديلها للتكييف الأمثل.
   1. إذا تطلب البرنامج تحليل تجميد الإشارات البصرية (على العكس من الزمانية)، وشارك في تفعيل ضوء LED مع لهجة. وضع ضوء على السطح الخارجي للغرفة استثابي، في إطار الفيديو. في بداية كل محاكمة، وتفعيل ضوء LED والحفاظ عليه مضاءة حتى نهاية تشرينالبريد المحاكمة.
      ملاحظة: هذا الضوء هو غير مرئي من قبل الحيوان ويخدم فقط كعلامة لبدء ونهاية المحاكمة داخل ملفات الفيديو المسجلة (لاستخدامها لقياس السلوك التجميد).
3. وضع الحيوانات في غرف تكييف لمدة 5 محاكمات CS-حدها من التعود. عقب الجلسة التعود على الفور، نفذ 7 محاكمات CS-الولايات المتحدة تقرن تكييف الخوف. تأكد من أن لهجة CS يستمر لمدة 30 ثانية وcoterminates مع صدمة 0.5 ثانية في الولايات المتحدة. تجارب تشغيل في جميع الدورات (التعود، تكييف، الانقراض، وأذكر) مع فاصل زمني intertrial متغير في المتوسط ​​3 دقائق.
4. في نهاية الدورة تكييف، والعودة إلى أقفاص الحيوانات وطنهم وإلى مرفق الحيوان حتى اليوم التالي.

5. يوم 2: إعداد استراديول

1. مسحة وتحديد المرحلة داقية لجميع الحيوانات التي خضعت ليوم 1 من هذا البروتوكول. إعداد استراديول (المعروف أيضا باسم E2، 17beta استراديول، أوبيتا استراديول) لمدة 15 ميكروغرام / كغ جرعة الحقن تحت الجلد باستخدام زيت السمسم أو 0.9٪ المالحة كما السيارة.
2. لحساب كمية استراديول للتحضير للحقن، استخدم وزن الجسم من جميع الحيوانات، والتي تم قياسها وتسجيلها عندما كانوا مكيفة في يوم 1 من هذا البروتوكول.
3. إجراء حسابات لتوحيد حجم تدار من استراديول (أي 0.2 مل) في الفئران. منذ استراديول من الصعب حل بسبب الصلابة المياه، ويتطلب كمية كبيرة من المذيبات لجرعة صغيرة، وإعداد محلول المخزون عن طريق خلط استراديول في زيت السمسم على نار حتى يذوب. ومن ثم يمكن تمرير حل من خلال مرشح 0.22 ميكرون لإزالة الملوثات. على سبيل المثال، إضافة حجم المحسوب ل/ 1 مل من محلول الأسهم زيت السمسم 3،000 ميكروغرام استراديول لإجمالي كمية المطلوبة من زيت السمسم من أجل تحقيق 15 ميكروغرام / كغ جرعة في حجم 0.2 مل حقن لكل حيوان.
   ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم أشكال أخرى من هرمون الاستروجين ثا ر هي المياه القابلة للذوبان وأسهل حل.

6. يوم 2: إدارة استراديول / الانقراض التدريب

1. إدارة تحت الجلد استراديول. رفع الجلد فضفاض بين لوح الكتف من الرقبة في السؤال لطيف وإدراج إبرة حقنة في المثلث الذي يتكون من طيات الجلد.
2. 30 من زمن المباراة بعد الحقن تحت الجلد من استراديول، ووضع الحيوانات في غرف تكييف مرة أخرى ويبدأ التدريب الانقراض. في هذه الدورة الانقراض، تنفيذ 20 تجربة CS-حدها، مع كل محاكمة يتكون من 30 ثانية، و 4 كيلو هرتز، 80 ديسيبل لهجة، وقدمت في فترة intertrial متغير في المتوسط ​​3 دقائق.
   ملاحظة: تأثير استراديول على استدعاء يحدث عندما تدار استراديول قبل التدريب الانقراض أو مباشرة بعد انقراض. ولم يلاحظ تأثير 4 ساعات بعد الانقراض، لذلك فمن المستحسن لحقن قريبة في الوقت المناسب لبداية أو نهاية الدورة التدريبية ^15.

. لو "> 7 يوم 3: الانقراض إستدعاء

1. 24 ساعة بعد التدريب الانقراض، مسحة الحيوانات التي أنجزت يوم 1 و 2 من هذا البروتوكول.
2. وضع الحيوانات في غرف تكييف المسندة إليها (نفس يوم 1 و 2). بدء جلسة استدعاء الانقراض من خلال تقديم 3 محاكمات CS-حدها (المحاكمات الثلاث من استدعاء الانقراض)، الذي يتكون من فقط 3.80 ديسيبل محاكمات CS-حدها مع فترات intertrial مماثلة ل20 محاكمات تدار للتدريب الانقراض كما هو موضح في الخطوة 6.2.
3. عند الانتهاء من الدورة استدعاء، والعودة إلى أقفاص الحيوانات وطنهم.

8. تحليل البيانات

1. الحصول على البيانات السلوكية من خلال الفيديو وتحليلها باستخدام برامج الكمبيوتر.
   ملاحظة: يمكن أيضا تجميد عشرات تحسب من قبل المجرب الذي هو أعمى إلى العلاج من تعاطي المخدرات عن طريق توقيت نوبات تجميد أثناء العرض CS كل محاكمة يدويا، معبرا عنه كنسبة مئوية من الوقت الذي يقضيه تجميد خلال لهجة. تجميد هوالتي يحددها انعدام تام للحركة باستثناء التنفس أثناء المحاكمات 30 ثانية CS-الولايات المتحدة. حساب في المئة تجميد بقسمة ثواني قضى التجمد (متحرك) من خلال 30 ثانية (مدة المحاكمة) مضروبا في 100.

النتائج

في هذا الخوف الانقراض بروتوكول التذكير، وقد تم قياس المئة تجميد كمؤشر على الخوف. أظهرت الحيوانات التي انطفأت بشكل جيد واحتفظت الذاكرة من التدريب الانقراض الخوف منخفض في اليوم الأخير من الاختبارات السلوكية خلال استدعاء الانقراض. الفئران الذكور والإناث لا تختلف كثير...

Discussion

وقد تمت دراسة الخوف الانقراض على نطاق واسع في ذكور الفئران مع الآليات العصبية التوسط مشروط الانقراض الخوف تحديدها وتقييمها في إطار مختلف التلاعب. وقد درست عدد قليل نسبيا من الدراسات إناث الفئران أو دور هرمونات الغدد التناسلية في خوف الانقراض. لدراسة تحديدا آثار هرم?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fear conditioning chamber	Coulbourn Instruments
Graphic State	Coulbourn Instruments
Sound-attenuating box	Med Associates, Inc.	NIR-022MD
Estradiol	Sigma-Aldrich	E1024	In sesame oil for subcutaneous injection
Sesame oil	Sigma-Aldrich	S3547-250ML
Freezescan	Cleversys, Inc.
Dip quick stain	Jorgensen Laboratories, Inc.	J0322A1, J0322A2, J0322A3
Cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-114	6-inch, sterile
0.9% saline	LabChem, Inc.	LC23460-2	Sodium chloride w/v
Selectfrost microscope slides	Fisher Scientific	12-550-003
Virex II 256	Diversey, Inc.	5019317	Dilute 1:256 with water
Luer-Lok Tip 1ml Syringes	Becton Dickinson	309628
Hypodermic disposable needles	Exelint International, Co.	26402	26-gauge