Protocollo per lo studio Extinction of Fear Condizionata in Naturalmente bicicletta ratti di sesso femminile

Riepilogo

Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.

Abstract

Estinzione della paura condizionata è stata ampiamente studiata nei roditori maschi. Recentemente, ci sono stati un numero crescente di studi che indicano che i meccanismi neurali per determinati compiti comportamentali e comportamenti di risposta sono diversi in femmine e maschi. Utilizzando femmine in studi di ricerca può rappresentare una sfida a causa della variazione di ormoni gonadici durante il loro ciclo estrale. Questo protocollo descrive le procedure consolidate che sono utili nelle indagini il ruolo degli estrogeni nella paura consolidamento della memoria estinzione nei ratti femmina. Fase del ciclo estrale e somministrazione di estrogeni esogeni prima formazione all'estinzione può influenzare richiamo estinzione 24 ore più tardi. La tecnica swabbing vaginale per l'identificazione fase estrale descritto favorisce l'esame e la manipolazione di ciclismo naturalmente ormoni gonadici. L'utilizzo di questo modello di roditore di base può ulteriormente delineare i meccanismi attraverso i quali gli estrogeni possono modulare paura memoria estinzionefemmine.

Introduzione

Differenze di sesso inerenti si osservano in vari comportamenti cognitivi e paradigmi di apprendimento in entrambi gli esseri umani e roditori. Ad esempio, è stato riportato che le donne hanno generalmente abilità verbali e orientato al dettaglio più forti, mentre gli uomini hanno migliori abilità spaziali ^1-3. Queste differenze di sesso può essere dovuto in parte l'influenza degli ormoni gonadici. Alti livelli di estradiolo migliorare le prestazioni in compiti in cui le donne sono migliori, ma peggiorano le prestazioni in compiti che gli uomini in genere fanno bene ^4-6. Anche se questa prova è convincente, la limitata capacità di controllare completamente gli ambienti sperimentali in studi sull'uomo rende difficile determinare se questi effetti sul comportamento possono essere attribuiti specificamente agli ormoni. Gli studi su animali, al contrario, permettono di circostanze completamente controllate.

Anche se i meccanismi neurali di base della paura dell'estinzione sono stati identificati e sono ben studiata nei maschi, non è chiaro sequesti sistemi sono gli stessi nelle femmine o come cambiano in tutto il ciclo estrale. La paura condizionata ed estinzione sono ampiamente utilizzati paradigmi comportamentali nei roditori e nell'uomo per condurre studi in materia di disturbi d'ansia. Dato che le donne hanno un rischio più elevato per i disturbi d'ansia e maggiore durata dei sintomi e la gravità ^7-13, è fondamentale per comprendere le femmine in questi studi. La sottorappresentazione delle donne in questa ricerca può essere attribuita alle sfide del monitoraggio fase estrale e contabile per gli effetti comportamentali degli ormoni sessuali. I laboratori che fanno esaminare le femmine a questo proposito le questioni di incontro che spesso vanno non dichiarata o non sono descritte nei metodi per i loro studi.

Emergenti prove in roditori suggeriscono che le differenze di sesso nella paura di estinzione sono modulati dagli ormoni gonadici ^14-18. In condizionamento alla paura, gli animali vengono addestrati a temere uno stimolo particolare. Dopo una serie di presentazioni di non rinforzatilo stimolo, gli animali imparano a non temere la stecca, un processo chiamato di estinzione. Quanto bene apprende l'animale e consolida il ricordo di imparare questa attività si può osservare nel corso di un test di richiamo di estinzione dato qualche tempo dopo la formazione di estinzione. Espressione paura Meno durante il richiamo estinzione dimostra buon consolidamento della memoria estinzione. Recenti scoperte dal nostro laboratorio indicano che gli estrogeni possono modulare il consolidamento della memoria paura dell'estinzione e migliorare richiamo estinzione. In particolare, i topi femmina che si estinguono proestrus, la fase del ciclo estrale durante il quale livelli circolanti di estrogeni picco, mostra una maggiore ritenzione della memoria estinzione. Al contrario, le donne che sono estinte nel basso-estrogeno visualizzazione della fase metestrus relativamente scarsa memoria di estinzione, che possono essere migliorati con la somministrazione di estradiolo esogeno prima o immediatamente dopo l'estinzione allenamento ^15,16. I meccanismi neurali di consolidamento della memoria di estinzione (inclUding il ruolo degli ormoni gonadici) nelle donne non sono chiare.

Negli animali da laboratorio, il ruolo degli ormoni può essere indagato utilizzando invasive procedure di rimozione chirurgiche come la castrazione e ovariectomia. Dopo il recupero da un intervento chirurgico, ormoni gonadici sono spesso esogena manipolati durante l'esecuzione di un compito comportamentale ^19. Questo approccio ha fornito informazioni critiche su ormoni sessuali ed è utile perché permette di manipolazioni ben controllati di ormoni gonadici (in termini di tempi e di dose) ^20-23. Questo approccio, tuttavia, non valutare l'influenza delle fluttuazioni naturali che si verificano nel corso del ciclo estrale non rappresentano animali "normali", limitando così il potenziale traslazionale per studi sull'uomo. E 'stato ben documentato che i livelli di ormone sessuale femminile picco e il declino a specifiche fasi del ciclo estrale, e cambiamenti di espressione dei recettori degli estrogeni all'interno del ciclo,e dopo ovariectomia ^24. Quindi, vi è la necessità di condurre studi su femmine con gonadi intatti e perfezionare progetti sperimentali per studiare in modo affidabile gli effetti che gli stati alti e bassi di estrogeni possono avere su donne in tutta la loro durata di vita.

Questo protocollo concentra sull'effetto degli estrogeni sui sistemi neurobiologici coinvolti nella paura estinzione. Si descrive come: 1) monitorare attentamente il ciclo estrale, 2) preparare le dosi efficaci di estradiolo per somministrazione sistemica, e 3) seguire un paradigma comportamentale che include condizionamento alla paura, l'estinzione, e richiamare in modo naturale in bicicletta ratti femmina. Questo protocollo può essere modificato con altre manipolazioni farmacologiche e strumenti molecolari e cellulari per aiutare gli studi per capire meglio le differenze di sesso che si osservano in condizionato temere comportamento estinzione. Si noti che le procedure descritte qui sotto sono quelli utilizzati nel nostro laboratorio, ed esistono un certo numero di varianti di queste procedure in letteratura.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure di questo protocollo sono stati approvati dalla sottocommissione per la ricerca cura degli animali, che serve come la cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) per il Massachusetts General Hospital, e sono in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute.

1. Animal Housing e procedura Handling

1. All'arrivo, casa adulti Sprague Dawley femmine circa 8-10 settimane di età (del peso di 200-225 g) in gruppi di bidoni di plastica 3-4 pollici con biancheria da letto di cippato. A mantenere una dieta ad libitum accesso a Chow e acqua e un 12 hr luce / buio ciclo. Lasciare ratti per ambientarsi alla condizioni abitative e animali struttura per un minimo di 1 settimana.
   NOTA: Tutte le procedure di questo manoscritto sono condotti durante il ciclo di luce.
2. In seguito a questo periodo di acclimatazione, di gestire tutti gli animali per 5 minuti ciascuno per 2-3 giorni. Correttamente prendere i topi uno alla volta (sostenuto dal torso e non per la coda),tenerli saldamente, e li animali durante questo tempo. Maneggiare animali che appaiono più stressati, nervosi, ansiosi o per periodi di tempo più lunghi. Fate questo per ridurre al minimo la manipolazione dello stress, che possono incidere sui seguenti operazioni in questo protocollo.
   NOTA: Il numero di giorni e la quantità di gestire gli animali può variare tra i diversi laboratori di tempo; tuttavia, questi dovrebbero essere coerenti tra esperimenti all'interno dello stesso laboratorio.

2. Monitoraggio del ciclo estrale: tamponi vaginali sbavature e Procedura di colorazione

1. Preparare la soluzione salina allo 0,9% (cloruro di sodio sciolto in acqua distillata). Inumidire un cotton fioc in questa soluzione. Asciugare la punta con un tovagliolo di carta per evitare di sovrasaturazione, che potrebbe portare il campionario inadeguata o la perdita di cellule. Tenendo la coda verso l'alto dalla apertura vaginale, inserire delicatamente la punta di cotone nel canale vaginale e tirare intorno alle mura di catturare le cellule vaginali sciolti.
2. Se l'animale urina sul lettinoTip Ton, sostituirlo con uno nuovo, come la contaminazione delle urine sarà difficile per l'identificazione di fase. Fare molta attenzione per non causare disagi all'animale durante questa procedura, perché l'esposizione allo stress sarà interrompere il ciclo estrale. Quando tampone, mirare a raggiungere un inserimento rapido e il ritiro che non sia troppo profonda da ridurre al minimo stimolo in più per la cervice, che può indurre pseudogravidanza.
   NOTA: Pseudopregnancy può essere identificato come un ciclo estrale aciclico che in genere dura per circa 12 giorni, cioè giorni consecutivi di diestrus ^25.
3. Rimuovere con attenzione la punta dell'applicatore e rotolare su un vetrino da microscopio pre-etichettati. Evitare premendo troppo duro come troppo liquido sul vetrino può rendere l'identificazione fase difficile, una volta asciutta.
   NOTA: Una diapositiva può contenere più giorni per ogni animale, anche se questo può essere fatto in base alle preferenze individuali.
4. Assicurarsi che i trasferimenti del campione sul vetrino. Raccogliere campioni per severAL giorni consecutivi in ​​una diapositiva per poter meglio traccia e identificare quotidiane fasi estro modifiche.
   NOTA: Se possibile, è ideale anche se le persone che raccolgono campioni rimangono le stesse per tutti gli animali.
5. Una volta che la slitta è asciutto, iniziare il protocollo di colorazione per l'identificazione di fase. Utilizzando il kit di colorazione (vedi Tabella dei Materiali), immergere i vetrini 10 volte in fissativo (azzurro), 10 volte in soluzione colorante (rosa), e 5 volte in soluzione di contrasto (viola). Sciacquare scivola delicatamente con acqua corrente. Lasciate asciugare completamente le diapositive prima visione al microscopio.
   NOTA: Il lungo ciclo estrale tipicamente 4-5 giorni è composto da (in questo ordine): estro (E), metestrus (M), diestrus (D), e proestrus (P) ^26. Estrus è caratterizzata da blu, cellule corneo, metestrus dai leucociti e una combinazione di cellule nucleate e cornified, diestrus è simile a metestrus in presenza di tipi cellulari eccetto quando sono molto scarse, e proestrus da aggregati viola tintocellule nucleate di (figura 1). Ci sono varie procedure di colorazione, oltre a quelli sopra descritti, che sono ugualmente efficaci per striscio vaginale citologia.
6. Raccogliere i campioni per almeno due cicli completi (~ 8-10 giorni) al fine di monitorare le fasi accuratamente prima sperimentazione. Essere coerente con l'ora del giorno del prelievo del campione. Raccogliere campioni striscio vaginale giornaliero durante e fino alla fine dell'esperimento.

3. Pre-esposizione

1. Prima dell'inizio dell'esperimento, pre-esporre gli animali al condizionamento camere consentono agli animali di acclimatarsi al contesto (camere di condizionamento) prima di ogni prova comportamentale.
   1. Pre-esporre le femmine alle camere di condizionamento (che si trova in scatole-attenuazione del suono) con le luci di casa avanti per 20-30 minuti al giorno per 3 giorni prima di ogni sperimentazione. Assegnare scatola sono pre-esposta come loro camera per lo studio. Pulire accuratamente tlui scatole (pareti e vassoi) tra le sessioni e gli animali per eliminare gli odori in quanto possono influenzare il comportamento e ciclo estrale.

4. Giorno 1: assuefazione / Paura condizionata

1. Una volta che gli animali sono stati verificati per essere nella fase estro dei cicli di estro, inizia la fase di assuefazione / condizionamento dell'esperimento 3 giorni.
   1. Prendere pre-tone misure basali di congelamento precedenti allo stimolo primo tono condizionata (CS) presentazioni ogni giorno dell'esperimento. A tale scopo, l'acquisizione di punteggi per cento di congelamento (calcolato dividendo i secondi trascorsi immobile per la durata della prova, moltiplicato per 100) durante l'intervallo di tempo stimolo assente all'inizio della prima prova CS-alone prima dell'inizio CS.
      NOTA: Queste misure possono essere utilizzati per valutare e confrontare i livelli di congelamento basali con quelli durante assuefazione, condizionata, l'estinzione, e richiamo.
   2. Per condurre la formazione di estinzione durante la fase metestrus,condizionare i topi nel loro ultimo giorno di estro. Tampone e identificare fase estrale (step 2) ogni giorno prima di iniziare il protocollo sperimentale (condizionata / estinzione / richiamo). Poiché la fase di estro può durare più a lungo di un giorno, la storia del ciclo uso per predire la lunghezza delle fasi per determinare quando gli animali sono pronti per iniziare l'allenamento.
2. Nelle camere di condizionamento, collegare il piano rete foot-shock per un generatore di stimolazione elettrica. Usare un livello di stimolazione di 0,5-0,6 mA come stimolo incondizionato (US). Utilizzare un 4 kHz, 80 dB tono come stimolo condizionato (CS).
   NOTA: Questi parametri possono variare tra i laboratori e possono essere modificati per il condizionamento ottimale.
   1. Se il programma di analisi congelamento richiede segnali visivi (a differenza temporale), co-attivare una luce LED con il tono. Posizionare la luce all'esterno della camera operante, all'interno del fotogramma video. All'inizio di ogni prova, attivare la luce LED e tenerlo accesa finché l'estremità di The di prova.
      NOTA: Questa luce non è visibile da animali e serve solo come marcatore per l'inizio e la fine del processo entro i file video registrati (da utilizzare per misurare il comportamento di congelamento).
3. Mettere gli animali nelle camere di condizionamento per 5 studi CS-alone di assuefazione. Subito dopo la sessione di assuefazione, eseguire 7 coppie prove CS-USA del condizionamento alla paura. Assicurarsi che il tono CS dura 30 secondi e coterminates con il 0,5 sec Uniti shock. Eseguire le prove in tutte le sessioni (assuefazione, condizionata, l'estinzione, e richiamo) con un intervallo tra le prove variabile in media 3 minuti.
4. Alla fine della sessione di condizionamento, rispedire gli animali loro gabbie a casa e al stabulario fino al giorno successivo.

5. Giorno 2: Estradiolo Preparazione

1. Tampone e identificare la fase estrale per tutti gli animali sottoposti Day 1 di questo protocollo. Preparare estradiolo (noto anche come E2, 17-beta-estradiolo, obeta-estradiolo) per una dose di 15 mcg kg / iniezione sottocutanea con olio di sesamo o 0,9% soluzione salina come veicolo.
2. Per calcolare la quantità di estradiolo per prepararsi per le iniezioni, usare i pesi del corpo di tutti gli animali, che sono stati misurati e registrati quando sono stati condizionati al Day 1 del presente protocollo.
3. Fare i calcoli di standardizzare il volume somministrato di estradiolo (cioè 0,2 ml) per ratto. Poiché estradiolo è difficile da sciogliere per la sua insolubilità in acqua e richiede un grande volume di solvente per la piccola dose, preparare una soluzione madre mescolando estradiolo in olio di sesamo a fuoco fino a dissoluzione. La soluzione può quindi essere fatto passare attraverso un filtro di 0,22 micron per rimuovere i contaminanti. Ad esempio, aggiungere un volume calcolato di un / 1 ml di soluzione di olio di sesamo magazzino 3.000 mg estradiolo al volume totale di olio di sesamo necessaria per ottenere una dose di 15 mg / kg in un volume di 0,2 ml di iniezione per animale.
   NOTA: In alternativa, utilizzare altre forme di estrogeni tha t è solubile in acqua e più facile da dissolvere.

6. Giorno 2: Estradiolo Amministrazione / Estinzione Training

1. Amministrare il sottocutanea estradiolo. Sollevare la pelle flaccida tra la scapola per il collo in una presa dolce e inserire l'ago della siringa nel triangolo che si forma dalle pieghe cutanee.
2. 30 minuti dopo iniezioni sottocutanee di estradiolo, mettono gli animali nelle camere di condizionamento di nuovo e iniziano la formazione di estinzione. In questa sessione di estinzione, effettuare 20 prove CS-alone, con ogni prova consistente in un 30 secondi, 4 kHz, 80 dB tono, presentato in un intervallo tra le prove variabile in media 3 min.
   NOTA: L'effetto dell'estradiolo sul richiamo si verifica quando l'estradiolo viene somministrato prima formazione estinzione o immediatamente dopo l'estinzione. L'effetto non è stato osservato 4 ore post-estinzione, per cui si consiglia di iniettare vicino in tempo per l'inizio o alla fine della sessione di allenamento ^15.

. Le "> 7 Giorno 3: Extinction Recall

1. 24 ore dopo l'allenamento di estinzione, tampone gli animali che hanno completato giorno 1 e 2 del presente protocollo.
2. Mettere gli animali nelle loro camere di condizionamento assegnati (stessi come giorno 1 e 2). Iniziare la sessione di richiamo di estinzione con la presentazione di 3 studi CS-alone (le tre prove di richiamo di estinzione), che consiste di soli 3,80 dB prove CS-alone con intervalli tra le prove simili a 20 prove somministrate per la formazione di estinzione come descritto al punto 6.2.
3. Al termine della sessione di richiamo, rispedire gli animali loro gabbie a casa.

Analisi 8. Dati

1. Acquisire dati comportamentali attraverso il video e analizzarli utilizzando il software del computer.
   NOTA: Congelamento punteggi possono anche essere contati manualmente uno sperimentatore che è cieco al trattamento farmacologico cronometrando attacchi congelamento durante la presentazione CS di ogni prova, espresso come percentuale del tempo speso congelamento durante il tono. Congelamento èdefinita dalla completa mancanza di movimento con l'eccezione di respirazione durante le prove 30 sec CS-USA. Calcolare cento congelamento dividendo i secondi trascorsi congelamento (immobile) per 30 secondi (durata della prova) moltiplicato per 100.

Risultati

In questo protocollo richiamo paura dell'estinzione, per cento di congelamento è stata misurata come indicatore della paura. Gli animali che estinte bene e conservate la memoria della formazione dell'estinzione esposte basso paura l'ultimo giorno di test comportamentali durante il richiamo di estinzione. Ratti maschi e femmine non presentano differenze significative nell'espressione paura condizionata durante il condizionamento, l'estinzione, e ricordano le fasi (Figura 2). Tuttavia...

Discussione

La paura di estinzione è stata ampiamente studiata in ratti maschi con i meccanismi neurali che mediano condizionato estinzione paura individuati e valutati in diverse manipolazioni. Relativamente pochi studi hanno esaminato topi di sesso femminile o il ruolo degli ormoni gonadici nella paura di estinzione. Per studiare specificamente gli effetti degli estrogeni sulla paura estinzione, naturalmente ciclismo ratti femmine sono sottoposti ad un paradigma comportamentale di tre giorni. Questa procedura si compone di fasi ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fear conditioning chamber	Coulbourn Instruments
Graphic State	Coulbourn Instruments
Sound-attenuating box	Med Associates, Inc.	NIR-022MD
Estradiol	Sigma-Aldrich	E1024	In sesame oil for subcutaneous injection
Sesame oil	Sigma-Aldrich	S3547-250ML
Freezescan	Cleversys, Inc.
Dip quick stain	Jorgensen Laboratories, Inc.	J0322A1, J0322A2, J0322A3
Cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-114	6-inch, sterile
0.9% saline	LabChem, Inc.	LC23460-2	Sodium chloride w/v
Selectfrost microscope slides	Fisher Scientific	12-550-003
Virex II 256	Diversey, Inc.	5019317	Dilute 1:256 with water
Luer-Lok Tip 1ml Syringes	Becton Dickinson	309628
Hypodermic disposable needles	Exelint International, Co.	26402	26-gauge