Protocolo para el Estudio de la extinción del miedo condicionado en ratas hembras Naturalmente Ciclismo

Resumen

Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.

Resumen

La extinción del miedo condicionado se ha estudiado extensamente en roedores machos. Recientemente, ha habido un creciente número de estudios que indican que los mecanismos neuronales para ciertas tareas de comportamiento y conductas de respuesta son diferentes en mujeres y hombres. Usando a las mujeres en los estudios de investigación puede representar un desafío debido a la variación de las hormonas gonadales durante su ciclo estral. Este protocolo describe procedimientos bien establecidos que son útiles en la investigación del papel de los estrógenos en el miedo consolidación de la memoria extinción en ratas hembras. Fase del ciclo estral y la administración exógena de estrógenos antes de la extinción de formación puede influir en recuerdo de la extinción 24 horas más tarde. La técnica de hisopado vaginal para la identificación de fase estral descrito aquí ayuda al examen y manipulación de ciclismo naturalmente las hormonas gonadales. El uso de este modelo básico de roedores pueden definir con mayor precisión los mecanismos por los que los estrógenos pueden modular la memoria de extinción miedo enhembras.

Introducción

Diferencias sexuales inherentes se observan a través de diversos comportamientos cognitivos y paradigmas de aprendizaje tanto en humanos y roedores. Por ejemplo, se ha informado de que las mujeres tienen en general las habilidades verbales y orientado a los detalles más fuertes, mientras que los hombres tienen mejores habilidades espaciales ^1-3. Estas diferencias sexuales pueden deberse en parte a la influencia de las hormonas gonadales. Los niveles altos de estradiol mejorar el rendimiento en las tareas en las que las mujeres son mejores, pero empeoran el rendimiento en tareas que los hombres por lo general hacen bien ^4-6. Aunque esta evidencia es convincente, la capacidad limitada para controlar completamente entornos experimentales en estudios humanos hace que sea difícil determinar si estos efectos en el comportamiento pueden ser atribuidos específicamente a las hormonas. Los estudios en animales, en cambio, permiten circunstancias totalmente controladas.

Aunque los mecanismos neurales básicos del miedo extinción han sido identificados y se ha estudiado bien en los machos, no está claro siestos sistemas son los mismos en las hembras o cómo cambian a través del ciclo estral. Condicionamiento del miedo y la extinción son ampliamente utilizados paradigmas conductuales en roedores y humanos para llevar a cabo estudios relacionados con los trastornos de ansiedad. Dado que las mujeres tienen un mayor riesgo de trastornos de ansiedad, así como una mayor duración de los síntomas y la gravedad ^7-13, es fundamental para incluir mujeres en estos estudios. La escasa representación de las mujeres en esta investigación se puede atribuir a los desafíos de monitoreo fase estral y contabilización de los efectos en el comportamiento de las hormonas sexuales. Los laboratorios que hacen examinar las hembras en este sentido cuestiones encuentro que muchas veces no se denuncian ni se describen en los métodos para sus estudios.

Nuevas pruebas en roedores sugiere que las diferencias sexuales en el miedo extinción son moduladas por las hormonas gonadales ^14-18. En el condicionamiento del miedo, los animales son entrenados para temer un estímulo particular. Después de una serie de presentaciones no reforzadas deel estímulo, los animales aprenden a no temer el momento justo, un proceso llamado extinción. ¿Qué tan bien el animal aprende y refuerza la memoria de aprendizaje de esta tarea se puede observar durante una prueba de recuerdo de la extinción dado algún tiempo después del entrenamiento de extinción. Menos expresión miedo durante la llamada de extinción demuestra una buena consolidación de la memoria extinción. Los resultados recientes de nuestro laboratorio sugieren que los estrógenos pueden modular la consolidación de la memoria de extinción miedo y mejorar recuerdo de la extinción. En concreto, las ratas hembras que se extinguen en proestro, la fase del ciclo estral durante el cual circula máximo los niveles de estrógeno, exhibir una mayor retención de la memoria de extinción. Por el contrario, las mujeres que se extinguen en la pantalla fase metaestro bajo estrógeno relativamente pobre recuerdo de la extinción, que se pueden mejorar con la administración de estradiol exógeno antes o inmediatamente después de la extinción de formación ^15,16. Los mecanismos neurales de la consolidación de la memoria de extinción (including el papel de las hormonas gonadales) en las mujeres no están claras.

En animales de laboratorio, el papel de las hormonas puede ser investigada usando procedimientos de eliminación quirúrgicos invasivos tales como la castración y la ovariectomía. Después de la recuperación de la cirugía, las hormonas gonadales a menudo son manipulados de forma exógena durante la realización de una tarea de comportamiento ^19. Este enfoque ha proporcionado información crítica acerca de las hormonas sexuales y es útil porque permite manipulaciones bien controlados de hormonas gonadales (en términos de tiempo y de la dosis) ^20-23. Este enfoque, sin embargo, no evaluar la influencia de las fluctuaciones de origen natural que se producen en todo el ciclo estral ni representan animales "normales", limitando así el potencial de traslación a los estudios humanos. Ha sido bien documentado que los niveles de hormona sexual femenina pico y el declive en fases específicas del ciclo estral, y cambios en la expresión del receptor de estrógeno dentro del ciclo,y ²⁴ después de la ovariectomía. Por lo tanto, existe la necesidad de llevar a cabo estudios sobre las hembras con gónadas intactas y perfeccionar los diseños experimentales para estudiar de forma fiable los efectos de que los estados de alta y baja de estrógeno pueden tener sobre las mujeres a lo largo de su vida útil.

Este protocolo se centra en el efecto de los estrógenos sobre los sistemas neurobiológicos implicados en el miedo extinción. En él se describe cómo: 1) controlar cuidadosamente el ciclo estral, 2) preparar las dosis efectivas de estradiol para la administración sistémica, y 3) siguen un paradigma de comportamiento que incluye el condicionamiento del miedo, la extinción, y recordar en el ciclismo de forma natural las ratas hembras. Este protocolo se puede modificar con otras manipulaciones farmacológicas y herramientas celulares y moleculares para ayudar a estudios para comprender mejor las diferencias de sexo que se observan en el comportamiento condicionado temer la extinción. Tenga en cuenta que los procedimientos descritos a continuación son los utilizados dentro de nuestro laboratorio, y existen un número de variaciones de estos procedimientos in la literatura.

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos de este protocolo han sido aprobados por el Subcomité de Investigación Animal Care, que sirve como el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) para el Hospital General de Massachusetts, y cumplen con los Institutos Nacionales de Salud.

1. Animal Vivienda y Procedimiento para el Manejo

1. A su llegada, la casa del adulto Sprague Dawley hembras de 8-10 semanas de edad (con un peso 200-225 g) en grupos de cubos de plástico 3.4 pulgadas con ropa de cama de viruta de madera. Mantenerlas en una dieta de acceso ad libitum al perro chino y el agua y un 12 horas de luz / oscuridad ciclo. Deja ratas para aclimatarse a las condiciones de vivienda y de los animales instalación por un mínimo de 1 semana.
   NOTA: Todos los procedimientos de este manuscrito se llevan a cabo durante el ciclo de luz.
2. Después de este período de aclimatación, manejar todos los animales durante 5 min cada uno durante 2-3 días. Correctamente recoger el ratas de uno en uno (apoyado por el torso y no por la cola),mantener de forma segura, y acariciarlos durante este tiempo. Manipular los animales que aparecen más estresado, nervioso o ansioso por períodos más largos de tiempo. Haga esto para minimizar el manejo de estrés, lo que podría afectar a los siguientes pasos de este protocolo.
   NOTA: El número de días y cantidad de la manipulación de los animales pueden variar entre diferentes laboratorios tiempo; sin embargo, éstas deben ser coherentes entre los experimentos dentro del mismo laboratorio.

2. Monitoreo del ciclo estral: torunda vaginal Smearing y Procedimiento de tinción

1. Hacer solución salina al 0,9% (cloruro de sodio disuelto en agua destilada). Humedezca un aplicador con punta de algodón en esta solución. Seque la punta con una toalla de papel para evitar la sobresaturación, que podría conducir a la recogida de muestras inadecuadas o pérdida de células. La celebración de la cola hacia arriba fuera de la abertura vaginal, introduzca suavemente la punta de algodón en el canal vaginal y rodar alrededor de los muros para capturar las células vaginales flojas.
2. Si el animal se orina en la camaTip Ton, sustituya por uno nuevo, ya que la contaminación de la orina será más difícil para la identificación de fase. Tenga mucho cuidado de no causar trastornos a los animales durante este procedimiento debido a la exposición al estrés interrumpirá el ciclo estral. Cuando limpiando, el objetivo de lograr una inserción rápida y retirada que no es demasiado profunda como para minimizar la estimulación extra para el cuello del útero, lo que puede inducir pseudopreñez.
   NOTA: pseudopreñez puede ser identificado como un ciclo estral acíclico que típicamente dura alrededor de 12 días, es decir, días consecutivos de ²⁵ diestro.
3. Retire con cuidado la punta del aplicador y rodar en un portaobjetos de microscopio pre-etiquetados. Evite presionarlos demasiado duro como demasiado líquido en el portaobjetos puede hacer la identificación de fase difícil una vez seco.
   NOTA: Una diapositiva puede contener varios días para cada animal, aunque esto se puede hacer de acuerdo a las preferencias individuales.
4. Asegúrese de que las transferencias de la muestra en el portaobjetos. Recoger muestras para cortarcol días consecutivos en una diapositiva para poder efectuar un mejor seguimiento e identificar diarias fases de estro cambios.
   NOTA: Si es posible, también es ideal si las personas que recolectan muestras siguen siendo los mismos para todos los animales.
5. Una vez que la diapositiva es seca, comenzar el protocolo de tinción para la identificación de fase. Usando el kit de tinción (véase la Tabla de Materiales), sumerja las diapositivas de 10 veces en el fijador (azul claro), 10 veces en solución de tinción (rosa), y 5 veces en solución de contraste (púrpura). Enjuague desliza suavemente con agua corriente. Deje que se desliza completamente seco aire antes de ver bajo el microscopio.
   NOTA: El ciclo estral largo típicamente 4-5 días consta de (en este orden): estro (E), metaestro (M), el diestro (D), y el proestro (P) ^26. El estro se caracteriza por azules, células cornificadas, metaestro por los leucocitos y una combinación de células cornificadas y nucleadas, diestro es similar a metaestro en presencia de tipos de células excepto que son muy escasos, y proestro por agregados-púrpura manchadocélulas nucleadas de (Figura 1). Hay varios procedimientos de tinción, además de los descritos anteriormente, que son igualmente eficaces para la citología de frotis vaginal.
6. Recoger muestras durante al menos dos ciclos completos (~ 8-10 días) con el fin de controlar las fases con precisión antes de la experimentación. Sea consistente con la hora del día se toman las muestras. Recoger muestras de frotis vaginales a diario durante todo y hasta el final del experimento.

3. Pre-exposición

1. Antes de la iniciación del experimento, pre-exponer a los animales a la acondicionado cámaras permiten que los animales se aclimaten al contexto (cámaras de acondicionamiento) antes de cualquier prueba de comportamiento.
   1. Pre-exponer las hembras a las cámaras de acondicionamiento (ubicados en cajas que atenúan el sonido) con las luces de la casa por 20 a 30 minutos por día durante 3 días antes de cualquier experimentación. Asignar la caja que son pre-expuesto a como su cámara para el estudio. Limpiar a fondo tél cajas (paredes y bandejas) entre las sesiones y los animales para eliminar los olores, ya que pueden afectar el comportamiento y el ciclo estral.

4. Día 1: La habituación / temor acondicionado

1. Una vez que los animales han sido verificados para estar en la fase de estro de sus ciclos de celo, comenzará la fase de habituación / acondicionado del experimento de 3 días.
   1. Tome tono previo medidas basales de congelación antes del primer tono de estímulo condicionado (EC) presentaciones en cada día del experimento. Para ello, la adquisición de calificaciones por ciento de congelación (calculados dividiendo los segundos empleados inmóvil por la duración del juicio, multiplicado por 100) durante el intervalo de tiempo de estímulo ausente al comienzo de la primera prueba CS-alone antes de la aparición CS.
      NOTA: Estas medidas pueden utilizarse para evaluar y comparar los niveles de congelación de línea de base con los que durante la habituación, condicionamiento, la extinción, y el recuerdo.
   2. Para llevar a cabo la extinción de formación durante la fase metaestro,condicionar las ratas en su último día del estro. Fase Swab e identificar estral (paso 2) todos los días antes de iniciar el protocolo experimental (acondicionado / extinción / recuperación). A medida que la fase de estro puede durar más de un día, el uso de la historia del ciclo para predecir la duración de las fases para determinar cuando los animales están listos para comenzar el entrenamiento.
2. En las cámaras de acondicionamiento, conecte el suelo de rejilla pies choque a un generador de estimulación eléctrica. Utilice un nivel de estimulación de 0.5-0.6 mA como el estímulo incondicionado (EI). Use un 4 kHz, el tono de 80 dB como el estímulo condicionado (CS).
   NOTA: Estos parámetros pueden variar a través de laboratorios y puede ser modificado para el acondicionamiento óptimo.
   1. Si el programa de análisis de congelación requiere señales visuales (en oposición a temporal), co-activar una luz LED con el tono. Coloque la luz en el exterior de la cámara operante, dentro de la trama de vídeo. Al inicio de cada ensayo, activar la luz LED y mantenerlo iluminado hasta el final del XIXjuicio e.
      NOTA: Esta luz no es visible por el animal y sólo sirve como un marcador para el inicio y final de la prueba dentro de los archivos de vídeo grabados (para ser usado para medir el comportamiento de congelación).
3. Coloque los animales en las cámaras de acondicionamiento para 5 ensayos CS-alone de habituación. Inmediatamente después de la sesión de habituación, realizar 7 pares de ensayos CS-estadounidenses de condicionamiento del miedo. Asegúrese de que el tono de CS tiene una duración de 30 segundos y coterminates con el 0,5 seg choque de Estados Unidos. Efectuar ensayos clínicos en todas las sesiones (habituación, condicionamiento, la extinción, y recuperación) con un intervalo entre ensayos variable de una mediana de 3 minutos.
4. Al final de la sesión de acondicionamiento, devolver los animales a sus jaulas y para la instalación de los animales hasta el día siguiente.

5. Día 2: Preparación Estradiol

1. Swab e identificar la fase de estro de todos los animales que se sometieron a día 1 de este protocolo. Preparar estradiol (también conocida como E2, 17beta-estradiol, obeta-estradiol) para una dosis de 15 mg / kg inyección subcutánea utilizando aceite de sésamo o 0,9% de solución salina como vehículo.
2. Para calcular la cantidad de estradiol para prepararse para las inyecciones, utilice los pesos corporales de todos los animales, los cuales fueron medidos y registrados cuando se acondicionaron en el día 1 de este protocolo.
3. Realizar cálculos para estandarizar el volumen administrado de estradiol (es decir, 0,2 ml) por rata. Dado que el estradiol es difícil de disolver debido a su insolubilidad en agua y requiere un gran volumen de disolvente para la dosis pequeña, preparar una solución de stock de mezcla de estradiol en aceite de sésamo a fuego hasta que se disuelva. La solución puede entonces hacerse pasar a través de un filtro de 0,22 micras para eliminar los contaminantes. Por ejemplo, añadir un volumen calculado de a / 1 ml solución de aceite de sésamo stock 3,000 g estradiol total el volumen necesario de aceite de sésamo con el fin de lograr un / kg dosis 15 mg en un volumen de 0,2 ml por inyección por animal.
   NOTA: Como alternativa, utilice otras formas de Tha estrógeno t son solubles en agua y más fácil de disolver.

6. Día 2: Administración Estradiol / Formación Extinción

1. Administrar la vía subcutánea estradiol. Levante la piel suelta entre la escápula por el cuello en un sujetador suave e inserte la aguja de la jeringa en el triángulo que se forma por los pliegues de la piel.
2. 30 minutos después de las inyecciones subcutáneas de estradiol, colocan a los animales en las cámaras de acondicionamiento de nuevo y comienzan entrenamiento de extinción. En esta sesión de extinción, realizar 20 ensayos CS-solamente, con cada ensayo que consiste en un 30 seg, 4 kHz, el tono de 80 dB, presentado en un intervalo entre la variable promedio de 3 min.
   NOTA: El efecto de estradiol en el recuerdo se produce cuando estradiol se administra antes de la extinción de formación o inmediatamente después de la extinción. El efecto no se observa 4 horas después de la extinción, por lo que se recomienda inyectar cerca en el tiempo al principio o al final de la sesión de entrenamiento de ^15.

. le "> 7 Día 3: Extinction Recall

1. 24 horas después de la extinción de formación, talle los animales que completaron el día 1 y 2 de este protocolo.
2. Coloque los animales en sus cámaras de acondicionamiento asignados (igual que el día 1 y 2). Comienza la sesión de recuerdo de la extinción mediante la presentación de 3 ensayos CS-solos (los tres ensayos de recuerdo de la extinción), que consta de sólo 3,80 dB ensayos CS-solas con intervalos entre ensayos similares a los 20 ensayos administrados para entrenamiento de extinción como se describe en el paso 6.2.
3. Al término de la sesión de recuperación, devolver los animales a sus jaulas.

Análisis 8. Datos

1. Adquirir datos de comportamiento a través de video y analizarlos utilizando los programas informáticos.
   NOTA: Congelación puntuaciones también pueden ser contados manualmente por un experimentador que está ciego para el tratamiento de drogas cronometrando episodios de congelación durante la presentación CS de cada ensayo, expresada como porcentaje del tiempo dedicado a la congelación durante el tono. La congelación esdefinido por completo la falta de movimiento con la excepción de la respiración durante los 30 ensayos seg CS-estadounidenses. Calcular ciento congelación dividiendo los segundos empleados congelación (inmóvil) por 30 segundos (la duración de la prueba), multiplicado por 100.

Resultados

En este protocolo de recordatorio miedo extinción, por ciento de congelación se midió como un indicador de miedo. Los animales que se extinguen bien y conservan el recuerdo de la extinción de formación exhibieron bajo el miedo en el último día de la prueba de comportamiento durante la llamada de extinción. Las ratas macho y hembra no difieren significativamente en la expresión condicionada miedo durante el condicionamiento, la extinción, y recuerdan fases (Figura 2). Sin embargo, una diferenci...

Discusión

Extinción miedo ha sido ampliamente estudiado en ratas macho con los mecanismos neurales que median condicionado extinción miedo identificado y evaluado bajo diversas manipulaciones. Relativamente pocos estudios han examinado las ratas hembras o el papel de las hormonas gonadales en el miedo extinción. Para estudiar específicamente los efectos del estrógeno en el miedo extinción, que completan un ciclo natural ratas hembras son sometidos a un paradigma de comportamiento de tres días. Este procedimiento consiste e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fear conditioning chamber	Coulbourn Instruments
Graphic State	Coulbourn Instruments
Sound-attenuating box	Med Associates, Inc.	NIR-022MD
Estradiol	Sigma-Aldrich	E1024	In sesame oil for subcutaneous injection
Sesame oil	Sigma-Aldrich	S3547-250ML
Freezescan	Cleversys, Inc.
Dip quick stain	Jorgensen Laboratories, Inc.	J0322A1, J0322A2, J0322A3
Cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-114	6-inch, sterile
0.9% saline	LabChem, Inc.	LC23460-2	Sodium chloride w/v
Selectfrost microscope slides	Fisher Scientific	12-550-003
Virex II 256	Diversey, Inc.	5019317	Dilute 1:256 with water
Luer-Lok Tip 1ml Syringes	Becton Dickinson	309628
Hypodermic disposable needles	Exelint International, Co.	26402	26-gauge