Протокол для изучения Вымирание условных страх Естественно Велоспорт самок крыс

Резюме

Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.

Аннотация

Вымирание условного страха была тщательно изучена в мужских грызунов. В последнее время были все большее число исследований, показывающих, что нейронные механизмы для определенных поведенческих задач и поведения реагирования отличаются у женщин и мужчин. Использование женщин в научных исследованиях может представлять собой проблему из-за изменения половых гормонов во время их эстрального цикла. Этот протокол описывает устоявшиеся процедуры, которые являются полезными в исследовании роли эстрогенов в страхе консолидации вымирание памяти у крыс-самок. Фаза эстрального цикла и экзогенное введение эстрогенов до исчезновения обучения может влиять исчезновения отзыв 24 ч позже. Вагинальный техника швабры для эстрозного идентификации фазы, описанной здесь помогает осмотр и манипуляции, естественно, езда на велосипеде половых гормонов. Использование этой базовой модели грызунов может дополнительно определять механизмы, посредством которых эстроген может модулировать страх экстинкции памятьженщины.

Введение

Врожденные половые различия наблюдаются в различных когнитивных поведения и обучения парадигм в обоих людей и грызунов. Например, было сообщено, что женщины, как правило, сильные устные и ориентированы на детали способности, в то время как мужчины имеют лучшие пространственные способности ^1-3. Эти половые различия могут быть отчасти из-за влияния половых гормонов. Высокий уровень эстрадиола повысить производительность задач, в которых женщины лучше, но ухудшить производительность на задачах, которые мужчины, как правило, хорошо ^4-6. Хотя это свидетельство является убедительным, ограниченная способность полностью контролировать экспериментальных условий, в исследованиях на людях делает его трудно определить, если эти эффекты на поведение можно отнести именно к гормонам. Исследования на животных, напротив, позволяют полностью контролируемых условиях.

Хотя основные нервные механизмы страха вымирания были выявлены и изучены у мужчин, неясно, является лиЭти системы являются одинаковыми или у женщин, как они изменяются по эстрального цикла. Кондиционирование Страх и вымирание широко используются поведенческие парадигмы у грызунов и человека для проведения исследований, связанных с тревожными расстройствами. Учитывая, что женщины имеют более высокий риск для тревожных расстройств, а также более высокую продолжительность симптомов и тяжесть ^7-13, важно включить женщин в этих исследованиях. Недостаточная женщин в этом исследовании может быть связано с проблемами эстрозного контроля фаз и учета поведенческих эффектов половых гормонов. Лаборатории, осуждающих женщин в этом отношении вопросов, обнаружите, что часто не регистрируются и не описанных в способах их исследований.

Новые доказательства грызунов предполагает, что половые различия в страхе исчезновения модулируются половых гормонов ^14-18. В страхе кондиционирования, животные обучаются бояться конкретного раздражителя. После ряда неармированных презентацийстимул, животные научиться не бояться кий, процесс, называемый вымирания. Как хорошо животное учится и закрепляет память обучения эту задачу можно наблюдать во время испытания вымирание отзыва данного спустя некоторое время после обучения вымирания. Менее выражение страха во время тушения отзыва демонстрирует хорошую консолидацию вымирание памяти. Недавние исследования в нашей лаборатории предполагают, что эстроген может модулировать консолидации страха вымирания памяти и улучшить исчезновения отзыв. В частности, у самок крыс, которые тушили в проэструсе, фаза эстрального цикла, в течение которого циркулирует пиковые уровни эстрогена, проявляют повышенную задержку исчезновения памяти. В отличие от этого, женщины, которые тушили в низкой эстрогенов metestrus фазы обладают относительно бедных вымирание Напомним, которое может быть улучшено с администрацией экзогенный эстрадиол до или сразу же после исчезновения обучения ^15,16. Нервные механизмы консолидации памяти исчезновения (в т.ч.uding роль половых гормонов) у женщин не ясны.

В лабораторных животных, роль гормонов могут быть исследованы с помощью инвазивных процедур удаления хирургические, такие как кастрация и удаление яичников. После восстановления после операции, половых гормонов часто экзогенно манипулировать во время выполнения поведенческого задачи ^19. Такой подход обеспечивает необходимую информацию о половых гормонов и полезен, поскольку он позволяет хорошо контролируемых манипуляций половых гормонов (с точки зрения сроков и дозы) ^20-23. Этот подход, однако, не позволяет оценить влияние природных колебаний, которые происходят по всему эстрального цикла и они не представляют собой «нормальные» животных, тем самым ограничивая поступательное потенциал для исследований на людях. Он был хорошо документированы, что уровень женских половых гормонов пик и спад в определенных фазах эстрального цикла, а также изменения экспрессии рецепторов эстрогена в течение цикла,и после овариэктомии ^24. Таким образом, существует необходимость в проведении исследований на женщинах с неповрежденными половых желез и уточнить экспериментальные проекты, чтобы надежно изучению влияния, что высокие и низкие состояния эстрогена может оказывать на женщин на протяжении всей их жизни.

Этот протокол фокусируется на эффекте эстрогенов на нейробиологических систем, участвующих в страхе исчезновения. Он описывает, как: 1) внимательно следить за цикл течки, 2) подготовить эффективные дозы эстрадиола для системного введения, и 3) следуют поведенческие парадигмы, которая включает в себя страх кондиционер, вымирание, и вспомнить в естественно Велоспорт самок крыс. Этот протокол может быть изменен с другими фармакологическими манипуляций и клеточных и молекулярных инструментов, чтобы помочь исследования, чтобы лучше понять половые различия, которые наблюдаются в условный страх поведение вымирания. Обратите внимание, что процедуры, описанные ниже, являются использовать в течение нашей лаборатории, и существуют множество вариаций этих процедур ян литература.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры в этом протоколе были одобрены подкомитета по научным исследованиям животных помощи, которая служит уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) для Массачусетского общего госпиталя, и в соответствии с национальными институтами инструкций по охране.

1. Содержание животных и процедура обработки

1. Прибыв на место, дом для взрослых Sprague Dawley самок крыс около 8-10-недельного возраста (весом 200-225 г) в группах по 3-4 дюймовых пластиковые контейнеры с щепы постельные принадлежности. Поддерживать их на диету объявлений доступ вволю чау и воды и 12 ч свет / темнота цикла. Оставьте крыс акклиматизироваться к жилищным условиям и животных объекта в течение как минимум 1 недели.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры в этой рукописи проводятся в течение светового цикла.
2. После этого периода акклиматизации, обрабатывать все животные в течение 5 минут каждый в течение 2-3 дней. Правильно подобрать крысы по одному (поддерживаются туловища, а не за хвост),держать их надежно, и погладить их в течение этого времени. Обращайтесь животных, которые появляются более подчеркнул, нервный или тревоги в течение более длительного периода времени. Сделайте это, чтобы свести к минимуму обращения стресс, который может повлиять на следующие шаги в этом протоколе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: количество дней и количество времени, обработки животных может варьироваться в зависимости от различных лабораториях; Однако, они должны быть согласованы между экспериментами в пределах одной и той же лаборатории.

2. Контроль за цикл течки: вагинальный тампон размытие и Процедура окраски

1. Сделать 0,9% солевой раствор (хлорид натрия, растворенного в дистиллированной воде). Смочите ватный-аппликатор в этом растворе. Промокните кончик, используя бумажное полотенце, чтобы избежать перенасыщения, которые могут привести к неадекватности сбора или потери клеток образца. Проведение хвост вверх от входа во влагалище, аккуратно вставьте кончик хлопок в вагинальный канал и свернуть вдоль стен, чтобы захватить свободные вагинальных клеток.
2. Если животное мочится на кроватит наконечник, замените его новым, как загрязнение мочи будет трудно для идентификации фазы. Будьте крайне осторожны, чтобы не причинить страдания животному во время этой процедуры, так как воздействие стресса будет нарушать цикл течки. Когда моечные, стремиться к достижению быстрого введения и отмены, который не слишком глубоко, чтобы свести к минимуму дополнительные стимулы к шейке матки, которые могут вызывать Ложная.
   Примечание: Ложная могут быть идентифицированы в качестве ациклического эстрального цикла, что, как правило, длится в течение примерно 12 дней, т.е. последовательных дней диэструса ^25.
3. Осторожно снимите наконечник аппликатора и свернуть его на предварительно меченных предметное стекло. Не нажимайте вниз слишком сложно, как слишком много жидкости на слайде можно сделать Идентификация фаз трудно после высыхания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Один слайд может содержать несколько дней для каждого животного, хотя это может быть сделано в соответствии с индивидуальными предпочтениями.
4. Убедитесь, что образец переводы на слайде. Сбор образцов для SeverAl дней подряд на одном слайде, чтобы иметь возможность лучше отслеживать и идентифицировать ежедневные эстральных фазы изменения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, он также идеально подходит, если люди собирают образцы остаются одинаковыми для всех животных.
5. После того, как ползун сухой, начинают протокол окрашивания для идентификации фазы. Использование окрашивания комплект (табл материалов), погрузите слайды 10 раз в фиксатора (голубой), 10 раз в пятно раствором (розовый), и 5 раз в контрастирующая решения (фиолетовый). Промыть слайды аккуратно под проточной водой. Пусть слайды полностью высохнуть на воздухе перед просмотром под микроскопом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: обычно 4-5 дня течки цикл состоит из (в этом порядке): течка (E), metestrus (M), диэструс (D), и проэструс (P) ^26. Эструс характеризуется синий, ороговевших клеток, metestrus лейкоцитами и комбинации ороговевших и ядерных клеток, диэструс аналогично metestrus в присутствии типов клеток за исключением того, что они очень редки, и проэструс пурпурными пятнами агрегатовядерных клеток (рисунок 1). Существуют различные процедуры окрашивания, в дополнение к тем, которые описаны выше, которые в равной степени эффективны для вагинального мазка цитологии.
6. Соберите образцы в течение по крайней мере двух полных циклов (~ 8-10 дней) для того, чтобы контролировать фазы точно до эксперимента. Будьте последовательны со временем суток, когда берутся пробы. Сбор образцов вагинальных мазков ежедневно в течение и до конца эксперимента.

3. Pre-экспозиция

1. До начала эксперимента, предварительно подвергнуть животных в кондиционирования камеры дают животным привыкнуть к контексту (кондиционирования камер) перед любым поведенческим тестированием.
   1. Pre-разоблачать женщин в той кондиционирования камер (расположенных в звуковых-ослабления коробок) с домом огни на в течение 20-30 мин в день в течение 3 дней до любого эксперимента. Связать коробку они предварительно подвергались, как их камеры для исследования. Тщательно очистите тон коробки (стены и лотки) в период между сессиями и животных для удаления запахов, так как они могут влиять на поведение и эстрального цикла.

4. День 1: Привыкание / Страх Кондиционер

1. После того, как животные были проверены, чтобы быть в фазе течки их эстрального цикла, начинают фазу привыкание / кондиционирования в 3-дневном эксперименте.
   1. Возьмите предварительно тон базовых мер по заморозке до первого тона условного раздражителя (CS) презентации на каждый день эксперимента. Сделайте это путем приобретения баллы процентов замораживания (рассчитывается путем деления секунд, проведённых неподвижны длительностью судебного разбирательства, умноженное на 100) в течение стимула-отсутствует промежуток времени в начале первого CS-только суда до наступления CS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти меры могут быть использованы для оценки и сравнения базовых уровней замораживания с тем, во время привыкания, кондиционирования, исчезновения, и вспомнить.
   2. Для проведения исчезновения обучение во время фазы metestrus,состояние крыс в их последний день течки. Тампон и определить течки фаза (этап 2) каждый день перед началом экспериментального протокола (кондиционирование / исчезновение / повторного вызова). Как течка фаза может длиться дольше, чем один день, использование история цикла предсказать длину фаз чтобы определить, когда животные готовы начать обучение.
2. В кондиционирования камер, подключите футов шок решетчатый пол с электрическим генератором стимуляции. Используйте уровень стимуляции 0,5-0,6 мА в качестве безусловного раздражителя (США). Используйте 4 кГц, тон 80 дБ, как условный раздражитель (CS).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры могут варьироваться в зависимости от лаборатории и могут быть изменены для оптимального кондиционирования.
   1. Если программа замораживания анализ требует визуальные подсказки (в отличие от временных), со-активации светодиодные с тоном. Поместите свет на внешней стороне оперантного камере, в видеокадра. В начале каждого испытания, включите светодиодной подсветкой, и держать его не горит до конца гое испытание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот свет не виден животным и служит только в качестве маркера для начала и конца судебное разбирательство в записанных видео файлов (используется для измерения поведения замерзания).
3. Поместите животных в кондиционирования камер для 5 CS-только испытаниях привыкания. Сразу же после привыкания сессии, выполните 7 парных CS-американских испытаний страха кондиционирования. Убедитесь, что тон CS длится в течение 30 сек coterminates с 0,5 сек США током. Проводить испытания в всех сессий (привыкание, кондиционирование, вымирание, и помню) с переменным intertrial интервал усреднения 3 минут.
4. В конце устройства формирования сессии, не возвращают животных в их клетки и объекта животного до следующего дня.

5. День 2: Эстрадиол Подготовка

1. Тампон и определить течки фазу для всех животных, подвергшихся день 1 настоящего Протокола. Подготовка эстрадиол (также известный как E2, 17бета-эстрадиола илибета-эстрадиол) в течение 15 мкг / кг подкожно с использованием кунжутного масла или 0,9% солевой раствор в качестве транспортного средства.
2. Чтобы вычислить количество эстрадиола, чтобы подготовить для инъекций, используют массу тела всех животных, которые были измерены и записаны, когда они были обусловлены на 1 день этого протокола.
3. Сделать расчеты по стандартизации введенного объема эстрадиола (т.е. 0,2 мл) на крысу. Поскольку эстрадиол трудно растворим в связи с его нерастворимость в воде и требует большого объема растворителя для малой дозы, подготовки исходного раствора путем смешивания эстрадиол в кунжутном масле более высокой температуре, пока не растворится. Раствор затем может быть пропущен через 0,22 мкм фильтр для удаления загрязнений. Например, можно добавить вычисляемый объем в 3000 мкг эстрадиола / 1 мл кунжутного масла исходного раствора к общему необходимого объема кунжутное масло, с тем, чтобы достичь 15 мкг / кг дозу в объеме 0,2 мл на животное инъекции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, использовать другие формы эстрогена Tha т являются водорастворимыми и легче растворяются.

6. День 2: Эстрадиол управление / Extinction Обучение

1. Администрирование эстрадиола подкожно. Поднимите дряблая кожа между лопаток за шею в нежном шнура и вставить иглу шприца в треугольник, который образован в складках кожи.
2. 30 минут после подкожной инъекции эстрадиола, место животных в кондиционирования камер и приступить к вымирания обучение. В этом исчезновения сессии, выполните 20 CS-Alone испытания, с каждым испытанием, состоящей из 30 сек, 4 кГц, тон в 80 дБ, представленных на переменном intertrial интервал усреднения 3 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: эффект эстрадиола об отзыве происходит, когда эстрадиол вводят до исчезновения тренировки или сразу после исчезновения. Эффект не наблюдается 4 ч после исчезновения, поэтому его рекомендуется вводить близко по времени к началу или концу тренировки ^15.

. Le "> 7 День 3: Вымирание Напомним,

1. 24 ч после обучения исчезновения, мыть животных, которые завершили день 1 и 2 настоящего Протокола.
2. Поместите животных в их назначенных кондиционирования камер (такие же, как День 1 и 2). Начните исчезновения отзыва сессии, представляя 3 CS-Alone исследования (три испытания исчезновения отзыва), который состоит только из 3,80 CS-только дБ испытаний с intertrial интервалами, подобных 20 испытаний в ведении для тушения обучения, как описано в шаге 6.2.
3. После завершения отзыва сессии, вернуть животных в их клетки.

Анализ 8. Данные

1. Приобретать поведенческие данные с помощью видео и анализировать их с помощью компьютерных программ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Замораживание оценки также может быть вручную пересчитать экспериментатором, который слеп к лекарственной терапии по времени приступы замораживания во время презентации CS каждого испытания, выраженное в процентах от времени, проведенного замерзания во время звукового сигнала. Замораживаниеопределяется полным отсутствием движения, за исключением дыхания во время 30 сек CS-американских исследований. Рассчитать процентное замораживания путем деления секунды, потраченные замораживания (неподвижным) на 30 секунд (длительность судебного разбирательства), умноженное на 100.

Результаты

В этом протоколе отзыва страх экстинкции, процент замораживания измеряли как показатель страха. Животные, которые тушили хорошо и сохранили память о подготовке исчезновения характерно низкое страх на последний день тестирования поведения во время тушения отзыва. Мужские и женские кр...

Обсуждение

Страх вымирание была тщательно изучена у самцов крыс с нервных механизмов, опосредующих условный страх исчезновения определены и оценены в соответствии с различными манипуляциями. Относительно мало исследований самок крыс или роль половых гормонов в страхе исчезновения. Специально ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fear conditioning chamber	Coulbourn Instruments
Graphic State	Coulbourn Instruments
Sound-attenuating box	Med Associates, Inc.	NIR-022MD
Estradiol	Sigma-Aldrich	E1024	In sesame oil for subcutaneous injection
Sesame oil	Sigma-Aldrich	S3547-250ML
Freezescan	Cleversys, Inc.
Dip quick stain	Jorgensen Laboratories, Inc.	J0322A1, J0322A2, J0322A3
Cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-114	6-inch, sterile
0.9% saline	LabChem, Inc.	LC23460-2	Sodium chloride w/v
Selectfrost microscope slides	Fisher Scientific	12-550-003
Virex II 256	Diversey, Inc.	5019317	Dilute 1:256 with water
Luer-Lok Tip 1ml Syringes	Becton Dickinson	309628
Hypodermic disposable needles	Exelint International, Co.	26402	26-gauge