Protocole pour l'étude de l'extinction de la peur conditionnée dans le cyclisme Naturellement rats femelles

Résumé

Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.

Résumé

Extinction de la peur conditionnée a été largement étudiée chez les rongeurs mâles. Récemment, il ya eu un nombre croissant d'études indiquant que les mécanismes neuronaux pour certaines tâches comportementales et les comportements de réponse sont différents chez les femelles et les mâles. Utilisation de femelles dans les études de recherche peut représenter un défi en raison de la variation des hormones gonadiques au cours de leur cycle oestral. Ce protocole décrit les procédures bien établies qui sont utiles dans les enquêtes sur le rôle des œstrogènes dans la peur consolidation de la mémoire d'extinction chez les rats femelles. Phase du cycle oestral et de l'administration de l'oestrogène exogène avant la formation d'extinction peut influencer le rappel d'extinction 24 h plus tard. La technique de lubrification vaginale pour l'identification de phase oestrus décrit ici facilite l'examen et la manipulation de vélo naturellement hormones gonadiques. L'utilisation de ce modèle de rongeur de base peut en outre définir les mécanismes par lesquels les œstrogènes peut moduler la mémoire d'extinction de la peur dansfemelles.

Introduction

Différences entre les sexes sont inhérentes observées dans divers comportements cognitifs et des paradigmes d'apprentissage chez les humains et les rongeurs. Par exemple, il a été rapporté que les femmes ont généralement des capacités verbales et le souci du détail plus fortes, alors que les hommes ont de meilleures aptitudes spatiales ^1-3. Ces différences entre les sexes peuvent être dues en partie à l'influence des hormones gonadiques. Des niveaux élevés d'estradiol améliorer les performances sur des tâches où les femmes sont mieux, mais aggravent la performance sur les tâches que les hommes font généralement bien ^4-6. Bien que cette preuve est incontestable, la capacité limitée de contrôler complètement les environnements expérimentaux dans les études humaines, il est difficile de déterminer si ces effets sur le comportement peuvent être attribués spécifiquement aux hormones. Les études animales, en revanche, permettent de circonstances totalement contrôlées.

Bien que les mécanismes neuronaux de base de la peur extinction ont été identifiés et sont bien étudiés chez les hommes, il est difficile de savoir sices systèmes sont les mêmes chez les femelles ou leur évolution au cours du cycle œstral. Conditionnement de la peur et l'extinction sont largement utilisés paradigmes comportementaux chez les rongeurs et les humains de mener des études liées à des troubles de l'anxiété. Étant donné que les femmes ont un risque plus élevé pour les troubles anxieux ainsi que la durée des symptômes et la gravité supérieur ^7-13, il est essentiel de comprendre les femmes dans ces études. La sous-représentation des femmes dans cette recherche peut être attribuée aux défis de la surveillance de phase oestrus et comptable pour les effets sur le comportement des hormones sexuelles. Les laboratoires qui ne examinent les femmes à cet égard des questions de rencontre qui vont souvent non déclarée ou ne sont pas décrits dans les méthodes de leurs études.

De nouvelles preuves chez les rongeurs suggèrent que les différences sexuelles dans la peur extinction sont modulés par les hormones gonadiques ^14-18. Dans conditionnement de la peur, les animaux sont formés à craindre un stimulus particulier. Après un certain nombre de présentations non renforcés dele stimulus, les animaux apprennent pas à craindre la queue, un processus appelé extinction. Comment bien l'animal apprend et consolide la mémoire de l'apprentissage de cette tâche peut être observé lors d'un test de rappel de disparaître étant donné un certain temps après la formation d'extinction. Moins expression de la peur pendant le rappel d'extinction démontre une bonne consolidation de la mémoire d'extinction. Les résultats récents de notre laboratoire suggèrent que l'oestrogène peut moduler la consolidation de la mémoire de l'extinction de la peur et améliorer le rappel d'extinction. Plus précisément, les rats femelles qui sont éteints dans proestrus, la phase du cycle œstral durant laquelle taux d'estrogènes circulants pic, présentent meilleure rétention de la mémoire d'extinction. En revanche, les femmes qui sont éteints dans le bas-oestrogène affichage des phases de metestrus relativement pauvre de rappel d'extinction, qui peuvent être améliorées avec l'administration de l'estradiol exogène avant ou immédiatement après la formation d'extinction ^15,16. Les mécanismes neuronaux de l'extinction consolidation de la mémoire (de inclCOMPRIS le rôle des hormones gonadiques) chez les femmes ne sont pas claires.

Chez les animaux de laboratoire, le rôle des hormones peut être étudiée en utilisant des procédures d'éloignement chirurgicales invasives comme la castration et de l'ovariectomie. Après récupération de la chirurgie, les hormones gonadiques sont souvent manipulés de manière exogène pendant l'exécution d'une tâche comportementale ^19. Cette approche a fourni des informations essentielles sur les hormones sexuelles et est utile car il permet des manipulations bien contrôlée d'hormones gonadiques (en termes de calendrier et de la dose) ^20-23. Cette approche, cependant, ne permet pas d'évaluer l'influence des fluctuations naturelles qui se produisent à travers le cycle oestral, ni ne représentent qu'elles animaux "normaux", ce qui limite le potentiel de translation à des études humaines. Il a été bien documenté que les niveaux d'hormones sexuelles femelles pic et du déclin à des phases spécifiques du cycle oestral, et les changements d'expression du récepteur de l'oestrogène dans le cycle,et après ovariectomie ^24. Ainsi, il est nécessaire de mener des études sur les femmes ayant des gonades intactes et d'affiner des modèles expérimentaux pour étudier de manière fiable les effets que les états haut et bas oestrogènes peuvent avoir sur les femmes tout au long de leur durée de vie.

Ce protocole met l'accent sur l'effet des œstrogènes sur les systèmes neurobiologiques impliqués dans la peur extinction. Il décrit comment: 1) de suivre de près le cycle oestral, 2) préparer les doses efficaces d'estradiol pour l'administration systémique, et 3) suivre un paradigme comportemental qui inclut conditionnement de la peur, de l'extinction, et de rappeler dans le cyclisme naturellement les rats femelles. Ce protocole peut être modifié avec d'autres manipulations pharmacologiques et des outils cellulaires et moléculaires à l'aide des études pour mieux comprendre les différences de sexe qui sont observés dans le comportement conditionné craindre d'extinction. A noter que les modes opératoires décrits ci-dessous sont celles utilisées à l'intérieur de notre laboratoire, et il existe un certain nombre de variantes de ces procédures in la littérature.

Protocole

NOTE: Toutes les procédures dans ce protocole ont été approuvés par le Sous-comité sur la recherche de protection des animaux, qui sert de la Commission institutionnelle de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) pour le Massachusetts General Hospital, et sont en conformité avec les Instituts nationaux de la santé des lignes directrices.

1. logement des animaux et la manipulation procédure

1. À l'arrivée, la maison des adultes Sprague Dawley rats femelles environ 8-10 semaines d'âge (pesant 200 à 225 g) en groupes de bacs en plastique 3-4 pouces avec une literie de copeaux de bois. Les maintenir à un régime d'accès ad libitum à chow et de l'eau et un cycle de 12 heures de lumière / obscurité. Laissez rats se acclimater à des conditions de logement et animalerie pour un minimum de 1 semaine.
   NOTE: Toutes les procédures dans ce manuscrit sont réalisées durant le cycle de lumière.
2. Après cette période d'acclimatation, les animaux pour traiter toutes les 5 min chacun pour 2-3 jours. Correctement ramasser le rat un à la fois (soutenu par le torse et non par la queue),les tenir en toute sécurité, et de les caresser pendant ce temps. Manipuler les animaux qui apparaissent plus stressés, nerveux ou anxieux pendant des périodes de temps plus longues. Pour ce faire, pour minimiser le stress de manipulation, ce qui pourrait affecter les étapes suivantes dans ce protocole.
   REMARQUE: Le nombre de jours et la quantité de la manipulation des animaux peuvent varier entre les différents laboratoires de temps; Toutefois, ceux-ci doivent être cohérentes entre les expériences dans le même laboratoire.

2. Suivi du cycle oestral: Ecouvillon vaginal Smearing et Procédure de coloration

1. Ajouter une solution saline à 0,9% (chlorure de sodium dissous dans l'eau distillée). Humidifiez un coton-tige dans cette solution. Éponger la pointe avec une serviette en papier pour éviter la sursaturation, ce qui pourrait conduire à la collecte insuffisante de l'échantillon ou la perte de cellules. Tenant la queue vers le haut loin de l'ouverture vaginale, insérez délicatement le coton-tige dans le canal vaginal et rouler autour des murs pour capturer les cellules vaginales lâches.
2. Si l'animal urine sur le litpointe de tonnes, le remplacer par un nouveau, que la contamination de l'urine, il sera difficile pour l'identification de phase. Soyez extrêmement prudent pour ne pas causer de la détresse à l'animal au cours de cette procédure, car l'exposition au stress va perturber le cycle oestral. Lorsque pistonnage, visent à parvenir à une insertion rapide et retrait qui ne est pas trop profonde à minimiser la stimulation supplémentaire pour le col, ce qui peut induire pseudogestation.
   REMARQUE: pseudogestation peut être identifié comme un cycle oestral acyclique qui dure généralement pendant environ 12 jours, ce est à dire jours consécutifs de dioestrus ^25.
3. Retirez délicatement l'embout applicateur et le rouler sur une lame de microscope pré-étiquetés. Evitez d'appuyer trop fort trop de liquide sur la lame peut rendre l'identification de phase difficile une fois sec.
   NOTE: Une diapositive peut contenir plusieurs jours pour chaque animal, même si cela peut être fait en fonction des préférences individuelles.
4. Assurez-vous que les transferts échantillon sur la diapositive. Prélever des échantillons pour Several jours consécutifs sur une diapositive à être en mesure de mieux suivre et identifier les phases quotidiennes oestraux changements.
   NOTE: Si possible, il est aussi idéal si les personnes qui recueillent des échantillons restent les mêmes pour tous les animaux.
5. Une fois que la lame est sèche, commencer le protocole de coloration pour l'identification des phases. En utilisant le kit de coloration (voir le tableau des matériaux), immergez diapositives 10 fois dans le fixateur (bleu clair), 10 fois dans la solution de coloration (rose), et 5 fois dans une solution de contraste (violet). Rincer les lames délicatement sous l'eau courante. Laissez sécher à l'air complètement diapositives avant l'examen au microscope.
   NOTE: Le cycle long oestrus généralement 4-5 jours se compose de (dans cet ordre): l'oestrus (E), metestrus (M), dioestrus (D), et proestrus (P) ^26. Oestrus est caractérisé par bleu, cellules cornées metestrus par les leucocytes, et une combinaison de cellules cornées et nucléées, diestrus est similaire à metestrus en présence de types de cellules, sauf qu'ils sont très rares, et par des agrégats proestrus pourpre teintéles cellules nucléées de (figure 1). Il existe différentes procédures de coloration, en plus de ceux décrits ci-dessus, qui sont tout aussi efficace pour frottis vaginal cytologie.
6. Prélever des échantillons pendant au moins deux cycles complets (~ 8-10 jours) afin de suivre les phases précision avant l'expérimentation. Soyez cohérent avec le moment de la journée les échantillons sont prélevés. Prélever des échantillons de frottis vaginal tous les jours pendant et jusqu'à la fin de l'expérience.

3. pré-exposition

1. Avant le début de l'expérience, de pré-exposer les animaux au conditionnement chambres permettent aux animaux de se acclimater au contexte (chambres de conditionnement) avant le test comportemental.
   1. Pré-exposer les femmes à des chambres de conditionnement (situés dans des boîtes sonores atténuation) avec les lumières de la maison pendant 20 à 30 minutes par jour pendant 3 jours avant toute expérimentation. Attribuer la boîte, ils sont pré-exposés à leur chambre pour l'étude. Nettoyer soigneusement til boîtes (murs et plateaux) entre les sessions et les animaux pour enlever les odeurs, car ils peuvent influer sur le comportement et le cycle oestral.

4. Jour 1: accoutumance / conditionnement de la peur

1. Une fois que les animaux ont été vérifiés pour être en phase oestrus de leurs cycles oestraux, commencer la phase d'accoutumance / conditionnement de l'expérience 3-jours.
   1. Prenez pré-ton mesures de base de gel (CS) des présentations avant la première tonalité stimulus conditionné sur chaque jour de l'expérience. Pour ce faire, par l'acquisition de scores pour cent de congélation (calculé en divisant les secondes passées immobiles par la durée de l'essai, multiplié par 100) au cours de l'intervalle de temps stimulus-absent au début du premier procès CS-alone avant le début CS.
      NOTE: Ces mesures peuvent être utilisées pour évaluer et comparer les niveaux de gel de base avec ceux au cours accoutumance, le conditionnement, l'extinction, et le rappel.
   2. Pour assurer la formation d'extinction pendant la phase de metestrus,conditionner les rats dans leur dernier jour de l'oestrus. Swab et d'identifier la phase d'oestrus (étape 2) chaque jour avant de commencer le protocole expérimental (conditionné / extinction / rappel). Comme la phase oestrus peut durer plus d'une journée, l'histoire de cycle d'utilisation de prédire la longueur des phases pour déterminer quand les animaux sont prêts à commencer la formation.
2. Dans les chambres de conditionnement, connectez pied-choc plancher grillagé à un générateur de stimulation électrique. Utilisez un niveau de stimulation de 0,5 à 0,6 mA que le stimulus inconditionnel (US). Utilisez un 4 kHz, 80 dB ton que le stimulus conditionné (CS).
   REMARQUE: Ces paramètres peuvent varier selon les laboratoires et peut être modifié pour le conditionnement optimal.
   1. Si le programme d'analyse de congélation nécessite des repères visuels (par opposition à temporelle), co-activer une lumière LED avec le ton. Positionner la lumière à l'extérieur de la chambre opérante, dans la trame vidéo. Au début de chaque essai, activez la lumière LED et le garder allumé jusqu'à la fin de ee procès.
      NOTE: Cette lumière ne est pas visible par l'animal et ne sert de marqueur pour l'initiation et à la fin de l'essai dans les fichiers vidéo enregistrés (à utiliser pour mesurer le comportement de congélation).
3. Placez les animaux dans les chambres de conditionnement pour cinq essais CS-seules d'accoutumance. Immédiatement après la session d'habituation, effectuer 7 paires essais CS-américaines de conditionnement de la peur. Assurez-vous que le ton CS dure 30 sec et coterminates le choc 0,5 sec US. D'effectuer des essais dans toutes les sessions (habituation, le conditionnement, l'extinction, et de rappel) avec un intervalle intertrial variable de 3 minutes en moyenne.
4. A la fin de la session de conditionnement, les animaux revenir dans leur cage d'origine et à l'animalerie jusqu'au lendemain.

5. Jour 2: Préparation Estradiol

1. Swab et d'identifier la phase d'oestrus pour tous les animaux qui ont subi Jour 1 de ce protocole. Préparer estradiol (également connu sous E2, 17beta-estradiol, oubêta-estradiol) pour un / kg dose de 15 pg par injection sous-cutanée en utilisant l'huile de sésame ou 0,9% de solution saline comme véhicule.
2. Pour calculer la quantité d'estradiol pour préparer les injections, utiliser les poids de corps de tous les animaux qui ont été mesurés et enregistrés quand ils ont été conditionnés au jour 1 de ce protocole.
3. Faire des calculs de normaliser le volume administré de l'estradiol (soit 0,2 ml) par rat. Depuis estradiol est difficile à dissoudre en raison de son insolubilité dans l'eau et nécessite un grand volume de solvant pour la petite dose, préparer une solution de bouillon en mélangeant estradiol dans l'huile de sésame à feu jusqu'à dissolution. La solution peut ensuite être passé à travers un filtre de 0,22 um pour éliminer les contaminants. Par exemple, ajouter un volume calculé de a / 1 ml d'huile de sésame solution mère de 3000 ug d'estradiol au volume nécessaire totale de l'huile de sésame afin d'obtenir un kg dose de 15 ug / dans un volume de 0,2 ml par injection par animal.
   NOTE: Vous pouvez également utiliser d'autres formes d'oestrogène tha t sont solubles dans l'eau et plus facile à dissoudre.

6. Jour 2: Administration Estradiol / Formation d'extinction

1. Administrer le sous-cutanée de l'estradiol. Soulever la peau lâche entre l'omoplate par le cou dans un pincement doux et insérer l'aiguille de la seringue dans le triangle formé par les plis de la peau.
2. 30 minutes suivantes injections sous-cutanées de l'estradiol, placer les animaux dans les chambres de conditionnement encore et commencer la formation d'extinction. Dans cette session d'extinction, effectuer 20 essais CS-seuls, avec chaque essai constitué d'un 30 sec, 4 kHz, 80 dB ton, présenté à un intervalle intertrial variables moyenne 3 min.
   NOTE: L'effet de l'estradiol sur le rappel se produit lorsque l'estradiol est administrée avant la formation d'extinction ou immédiatement après extinction. L'effet ne est pas observé quatre heures après l'extinction, il est donc recommandé d'injecter près à temps pour le début ou la fin de la session de formation de ^15.

. le "> 7 Jour 3: Extinction Rappel

1. 24 heures après la formation d'extinction, tamponner les animaux qui ont rempli Jour 1 et 2 de ce protocole.
2. Placez les animaux dans leurs chambres de conditionnement assignées (les mêmes que Jour 1 et 2). Commencez la session de rappel d'extinction en présentant trois essais CS-seuls (les trois essais de rappel d'extinction), qui se compose de seulement 3,80 dB essais CS-seul avec intervalles intertrial similaires aux 20 essais administrés pour la formation d'extinction comme décrit dans l'étape 6.2.
3. À la fin de la session de rappel, renvoyer les animaux dans leurs cages à domicile.

8. Analyse des données

1. Acquérir des données comportementales grâce à la vidéo et de les analyser à l'aide de logiciels informatiques.
   NOTE: Gel scores peuvent également être comptés manuellement par un expérimentateur qui est aveugle au traitement de la toxicomanie par temps de combats de gel lors de la présentation CS de chaque essai, exprimée en pourcentage du temps passé gel pendant le ton. La congélation estdéfinie par l'absence totale de mouvement à l'exception de la respiration au cours des 30 essais sec CS-américains. Calculer pour cent congélation en divisant les secondes passées congélation (immobile) par 30 secondes (durée de l'essai), multiplié par 100.

Résultats

Dans ce protocole de rappel peur d'extinction, pour cent gel a été mesurée comme un indicateur de la peur. Les animaux qui éteints bien et gardé le souvenir de la formation d'extinction exposées faible peur sur le dernier jour de l'essai de comportement pendant le rappel d'extinction. Rats mâles et femelles ne diffèrent pas de manière significative dans l'expression de la peur conditionnée pendant le conditionnement, l'extinction, et rappellent phases (figure 2). Cepend...

Discussion

Peur extinction a été largement étudiée chez les rats mâles avec les mécanismes neuraux conditionné extinction de la peur identifié et évalué en vertu de diverses manipulations. Relativement peu d'études ont examiné les rats femelles ou le rôle des hormones gonadiques dans la peur extinction. Pour étudier spécifiquement les effets des œstrogènes sur la peur extinction, vélo naturellement rats femelles sont soumis à un paradigme comportemental trois jours. Cette procédure consiste à phases accout...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fear conditioning chamber	Coulbourn Instruments
Graphic State	Coulbourn Instruments
Sound-attenuating box	Med Associates, Inc.	NIR-022MD
Estradiol	Sigma-Aldrich	E1024	In sesame oil for subcutaneous injection
Sesame oil	Sigma-Aldrich	S3547-250ML
Freezescan	Cleversys, Inc.
Dip quick stain	Jorgensen Laboratories, Inc.	J0322A1, J0322A2, J0322A3
Cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-114	6-inch, sterile
0.9% saline	LabChem, Inc.	LC23460-2	Sodium chloride w/v
Selectfrost microscope slides	Fisher Scientific	12-550-003
Virex II 256	Diversey, Inc.	5019317	Dilute 1:256 with water
Luer-Lok Tip 1ml Syringes	Becton Dickinson	309628
Hypodermic disposable needles	Exelint International, Co.	26402	26-gauge