당연히 여성 쥐 사이클링에 에어컨 공포의 멸종 유학을위한 프로토콜

요약

Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.

초록

조건화 된 공포의 멸종 광범위 남성 설치류에서 연구되고있다. 최근, 특정 행동 작업 및 대응 행동에 대한 신경 메커니즘이 여성과 남성의 차이가 있음을 나타내는 연구의 증가가 있었다. 연구 조사에서 여성을 사용하면 자체 발정주기 동안 성선 호르몬의 변화의 도전을 나타낼 수 있습니다. 이 프로토콜은 암컷 쥐의 공포 멸종 메모리의 통합에 에스트로겐의 역할을 조사하는데 유용하다 잘 확립 된 절차에 대해 설명합니다. 발정주기 및 외인성 에스트로겐 투여 전에 멸종 훈련의 단계는 24 시간 이상 멸종 리콜에 영향을 미칠 수있다. 여기에 설명 발정 상 동정을위한 질 보라고 기술은 심사 자연스럽게 성선 호르몬의 순환 조작을 돕는다. 또한 에스트로겐은 공포 멸종 메모리를 변조 할 수있는 메커니즘을 서술 수도 기본 설치류 모델의 사용여성.

서문

고유의 성별 차이는 인간과 쥐 모두에서 다양한인지 적 행동과 학습 패러다임에서 관찰된다. 예를 들면, 사람들이 더 나은 공간 능력 ^1-3 반해 여성은 일반적으로, 강력한 구두 및 세부 지향 능력을 가지고 있다고보고되고있다. 이러한 성별 차이는 성선 호르몬의 영향으로 일부 원인 일 수 있습니다. 높은 에스트라 디올 수치는 여성이 더 나은하는 작업에 대한 성능을 향상시킬 수 있지만, 사람들이 일반적으로 잘 ^4-6을 작업의 성능을 악화. 이 증거는 강제적이지만, 완전 인간 연구에서의 실험 환경을 제어하는​​ 능력은 제한된 행동에 이러한 효과가 호르몬에 특이 적으로 기인 할 수 있는지 결정하기 어렵게 할 수있다. 동물 연구는 반대로 완전히 제어 상황을 허용.

공포 소멸 신경 기본 메커니즘이 확인되었으며, 수컷 잘 연구되어 있지만하는지 확실이 시스템은 여성 또는 그들이 어떻게 발정주기에 걸쳐 변경에 동일합니다. 공포 컨디셔닝 및 멸종 널리 불안 장애에 관한 연구를 수행하는 설치류와 인간의 행동 패러다임을 사용한다. 여성이 불안 장애 위험이 높은뿐만 아니라 높은 증상 기간과 심각성 ^7-13을 감안할 때, 이러한 연구에 여성을 포함하는 것이 중요하다. 이 연구에서 여성의 대표되지 못하고는 성 호르몬의 행동 효과 발정 단계 모니터링 및 회계의 도전에 기인 할 수있다. 자주보고되지 또는 연구를위한 방법에 설명되지 않은 이와 관련 실전 문제에서 여성을 조사 할 연구소.

설치류 증거 신흥 공포 멸종에 성차가 성선 호르몬 ^14-18에 의해 조절되는 것을 의미한다. 두려움 컨디셔닝, 동물은 특정 자극을 두려워하는 훈련. 의 비 강화 프리젠 테이션의 숫자 후자극은 동물 큐, 소멸이라는 과정을 두려워하지 않는 배우. 얼마나 잘 동물 배우고 멸종 훈련 후 약간의 시간이 주어진 멸종 리콜 테스트 중에 관찰 할 수있다이 작업을 학습의 메모리를 통합합니다. 멸종 리콜 동안 적은 두려움의 표현은 좋은 멸종 메모리의 통합을 보여줍니다. 우리 연구실의 최근 연구 결과는 에스트로겐이 공포 멸종 메모리의 통합을 조절하고 멸종 리콜을 향상시킬 수 있음을 시사한다. 구체적으로 소멸 발정 암컷 래트, 발정주기의 위상 기간 동안 에스트로겐 피크 흡광 메모리 전시 보존성 순환. 대조적으로, 이전 또는 그 직후 소등 후에 훈련 ^15,16 에스트라 외인성 투여를 향상시킬 수 저 에스트로겐 metestrus 위상 디스플레이 비교적 불량한 소등 리콜 소멸 암컷. 멸종 메모리 통합의 신경 메커니즘 (포함여성의 생식 호르몬의 역할을) uding은 명확하지 않다.

실험 동물에서 호르몬의 역할은 거세 및 난소 절제술과 같은 침습 수술 제거 절차를 사용하여 조사 할 수있다. 수술에서 회복 이후, 성선 호르몬은 주로 외생 적 행동 작업 ^(19)의 성능 동안 조작된다. 이 방법은 성 호르몬에 대한 중요한 정보를 제공하고 ^{20 ~ 23} (타이밍과 용량면에서) 성선 호르몬의 잘 조절 조작이 가능하기 때문에 유용합니다. 그러나,이 방법은 발정주기에 걸쳐 발생 않으며함으로써 인간 연구로 병진 가능성을 제한 "정상"동물을 나타내는가 자연적 변동의 영향을 평가하지 않는다. 그것은 잘 문서화 된 특정 발정주기의 단계 및주기 내에서 에스트로겐 수용체 발현 변화에서 여성의 성 호르몬 수준 피크와 감소,그리고 난소 ⁽²⁴⁾ 후. 따라서, 그대로 암컷 생식선에 대한 연구를 수행하고 신뢰성 높고 낮은 에스트로겐 상태들이 그들의 수명 내내 암컷 가질 수 있다는 효과를 연구하기 위해 실험적인 설계를 구체화 할 필요가있다.

이 프로토콜은 공포 멸종에 관여하는 신경 생물학적 시스템에서 에스트로겐의 효과에 초점을 맞추고있다. 1)주의, 발정주기를 모니터링 2) 전신 투여에 대한 에스트라 디올의 효과적인 복용량을 준비하고, 3) 공포 에어컨, 멸종을 포함하는 행동 패러다임을 따라 자연스럽게 순환 암컷 쥐를 불러올 :이 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 더 소등 동작 공포 조건화에서 관찰되는 성차 연구를 이해를 돕기 위해 다른 약리학 조작 세포 및 분자 도구로 변형 될 수있다. 이하 절차는 연구실에서 사용되는 것들이다 뿐이고, 이러한 절차의 다수의 변형이 존재 In은 문학.

프로토콜

참고 :이 프로토콜의 모든 절차는 매사추세츠 종합 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 역할을 연구 동물 관리에 분과위원회에 의해 승인 및 National Institutes of Health 안내문을 준수하고 있습니다.

1. 동물 주택 및 취급 절차

1. 도착 후, 집 성인 스프 라그 돌리 암컷 쥐 나이의 약 8-10주 우드 칩 침구와 3-4 인치 플라스틱 쓰레기통 그룹 (2백~2백25g 무게). 이 국수 임의로 액세스식이 요법과 물과 12 시간 / 암주기를 유지한다. 일주 최소 주택 및 동물 시설 조건에 적응 쥐를 남겨.
   참고 :이 원고의 모든 절차가 빛을주기 동안 수행된다.
2. 이 적응 기간 후, 5 분 2~3일에 대한 각각의 모든 동물을 처리합니다. 제대로, (몸통에 의해 아닌 꼬리가 지원하는) 한 번에 쥐를 데리러안전하게를 개최하고,이 시간 동안 그들을 애완 동물. 흠칫, 또는 오랜 기간에 대한 불안, 스트레스를 더 나타날 동물을 처리합니다. 이 프로토콜에서 다음 단계에 영향을 미칠 수있는 스트레스를 처리 최소화하기 위해이 작업을 수행합니다.
   참고 : 일수 및 시간 다른 실험실에 따라 다를 수 있습니다 동물을 처리하는 금액 그러나, 이들은 같은 실험실 내 실험 사이에 일관성이 있어야합니다.

2. 발정주기를 모니터링 : 질 면봉 번짐 및 염색 절차

1. 0.9 % 식염수 용액 (염화 나트륨을 증류수에 용해)을 만든다. 이 솔루션에 면봉을 적셔. 부적절한 시료 채취 또는 세포의 손실을 초래할 수 과포화를 방지하기 위해 종이 타월을 사용하여 팁을 오 점. 위로 떨어져 질 입구에서 꼬리를 잡고 천천히 질 운하에면 팁을 삽입하고 느슨한 질 세포를 캡처 벽 주위에 롤.
2. 동물 침대에 소변 경우소변 오염이 상 식별을 위해 어렵게 만들 것 같은 톤의 팁은 새 것으로 교체합니다. 스트레스에 노출 발정주기를 방해하기 때문에이 절차를 수행하는 동안 동물에게 고통을 일으키지로서 특히 조심하십시오. 보라고하​​면, pseudopregnancy을 유도 할 수있는 자궁 경부에 여분의 자극을 최소화하기 위해 너무 깊이없는 빠른 삽입 및 인출을 달성하는 것을 목표로하고 있습니다.
   참고 : Pseudopregnancy은 즉, 일반적으로 약 12 일 동안 지속 비순환 발정주기, diestrus ²⁵ 일 연속으로 식별 할 수 있습니다.
3. 조심스럽게 도포 팁을 제거하고 미리 라벨링 된 현미경 슬라이드에 그것을 롤. 상 식별 한 번 어려운 건조 할 수 있습니다 슬라이드에 너무 많은 유체로 너무 세게 눌러서 피하십시오.
   참고 :이 개인 환경 설정에 따라 수행 할 수 있지만 하나의 슬라이드, 각 동물에 대해 여러 일을 포함 할 수 있습니다.
4. 슬라이드로 샘플을 전송해야합니다. 단절에 대한 샘플을 수집하나의 슬라이드에 알 연속 일을 더 잘 파악 할 수 있어야하고, 매일 발정 단계의 변화를 확인합니다.
   참고 : 샘플을 수집하는 사람들이 모든 동물에서 동일하게 유지 될 경우, 그것은 또한 이상적입니다 가능합니다.
5. 슬라이드가 건조되면, 단계 식별을위한 염색 프로토콜을 시작합니다. 염색 키트 (재료의 표 참조)를 사용하여, 정착액 (하늘색)에 슬라이드 10 시간 몰입 (핑크) 염색 액의 10 배, 그리고 Counterstain과 솔루션에 5 회 (보라색). 린스는 부드럽게 흐르는 물 슬라이드. 현미경으로보기 전에 완전히 건조 공기를 슬라이드를 보자.
   참고 : 일반적으로 4~5일 긴 발정주기 (순서대로)로 구성 발정 (E), metestrus (M), diestrus (D) 및 발정 전기 (P) ^(26). 발정이 파란색, 각질화 된 세포, 백혈구 metestrus과 각질화와 핵 세포의 요구에 맞는 우수한 서비스, diestrus은 매우 드문 드문 제외하고 세포 유형의 존재 metestrus 유사하고, 발정 보라색 염색 집계하여의 핵 세포 (그림 1). 질 스미어 세포 검사 동등하게 효과적 위에서 설명한 이외에도 다양한 염색 절차가있다.
6. 사전 실험에 정확하게 위상을 모니터하기 위해 적어도 두 개의 완전 사이클 (~ 8-10일)에 대해 샘플을 수집. 샘플이 촬영 하루의 시간과 일치한다. 전체 및 실험이 끝날 때까지 매일 질 도말 검사 샘플을 수집합니다.

3. 사전 노출

1. 실험의 개시 이전에, 챔버는 모든 동물 행동 실험 전에 문맥 (컨디셔닝 챔버)에 적응하도록 허용 컨디셔닝에 동물을 미리 노출.
   1. 어떤 실험에 앞서 3 일간 하루에 20 ~ 30 분에 집 조명 (음향 감쇠 박스에 위치) 조절 실에 여성을 사전에 노출. 그들은 사전에 노출 연구를위한 자신의 챔버로있는 상자를 할당합니다. 철저하게 깨끗한 t그들은 행동과 발정주기에 영향을 미칠 수 있기 때문에 세션과 동물 사이에 그는 상자 (벽과 트레이) 냄새를 제거합니다.

4. 1 일 : 요법 이니 / 두려움 컨디셔닝

1. 동물들은 발정주기 발정 위상 판정을 확인했으면 3 일 실험 습관화 / 위상 조절을 시작한다.
   1. 사전 톤에게 실험의 각 날에 제 1 계조 조건 자극하기 전에 (CS) 프리젠 테이션을 동결 기본 조치를 취할 것. CS 발병 전에 먼저 CS 형 시험의 시작 부분에 자극없는 시간 간격 동안 (100을 곱한 시험 기간에 의해 움직이지 보냈다 초를 나누어 계산) %로 동결 점수를 획득하여이 작업을 수행합니다.
      주 : 이러한 치수 평가 습관화, 컨디셔닝, 소멸 및 회수 동안 그와 냉동 기준선 수준을 비교하기 위해 사용될 수있다.
   2. metestrus 단계에서 멸종 교육을 실시하기 위해,발정의 마지막 날에 쥐를하는 조건입니다. 면봉과 식별 발정 단계 (2 단계) 실험 프로토콜 (에어컨 / 소멸 / 리콜)을 시작하기 전에 매일. 발정 상 어느 날보다 더 오래 지속될 수있는 바와 같이 동물이 훈련을 시작할 준비가되면, 사용주기 역사를 결정하는 단계의 길이를 예측합니다.
2. 조절 실에서 전기 자극 발생기에 발 충격 그리드 바닥을 연결합니다. 무조건 자극 (US)로 0.5 ~ 0.6 mA의 자극 수준을 사용합니다. 4 kHz에서, 조건 자극 (CS)으로 80dB 톤을 사용합니다.
   참고 : 이러한 매개 변수는 실험실에서 다를 수 있으며, 최적의 조절을 위해 변경 될 수 있습니다.
   1. (시간적 반대) 동결 분석 프로그램이 시각적 신호를 필요로하는 경우, 톤 LED 조명을 공동 활성화. 비디오 프레임 내에서 조작 적 챔버의 외부에 빛을 놓습니다. 각 시험의 시작에서, LED 광을 활성화하고 제 끝날 때까지 점등 유지전자 시험.
      참고 :이 빛이 동물로 볼 수 없습니다 만 시작과 녹화 된 비디오 파일 내 재판의 끝 마커의 역할 (동결 행동을 측정하기 위해 사용되는).
3. 습관화 5 CS 형 시험에 대한 조절 챔버에 동물을 놓습니다. 즉시 습관화 세션 다음, 두려움 컨디셔닝 7 쌍 CS-US 시험을 수행합니다. CS 톤이 30 초 동안 지속되며 0.5 초 미국 충격 coterminates 있는지 확인합니다. 삼분 평균 가변 intertrial 간격으로 모든 세션 (요법 이니, 에어컨, 멸종, 리콜)에서 실행 시험.
4. 컨디셔닝 세션의 끝에서, 다음 날까지 동물 시설 홈 케이지 및 동물에게 반환한다.

5. 제 2 일 : 에스트라 디올 준비

1. 면봉과이 프로토콜의 1 일 시행 한 모든 동물의 발정 단계를 식별합니다. 에스트라 디올을 준비합니다 (또한 E2, 17beta-에스트라 디올, 또는으로 알려진참기름이나 차량과 같은 0.9 %의 식염수를 사용하여 15 ㎍ / kg 투여 피하 주사에 대한 베타 - 에스트라 디올).
2. 주사제 준비은 본 프로토콜의 하나 일 때를 조건으로 측정되고 기록 된 모든 동물의 체중을 사용하여 에스트라 디올의 양을 산출한다.
3. 쥐 당 에스트라 디올 (즉, 0.2 ㎖)의 관리 볼륨을 표준화하기 위해 계산을합니다. 에스트라다이 인해 물에 용해 불용성 어렵고 작은 도즈 대 용매의 큰 볼륨을 필요로하기 때문에, 용해 될 때까지 가열을 통해 참기름 에스트라 디올을 혼합하여 스톡 용액을 제조 하였다. 용액을 오염 물질을 제거 할 수있는 0.22 μm의 필터를 통과 할 수있다. 예를 들어, 동물 당 0.2ml의 주입 부피에서 15 ㎍ / kg 투여 량을 달성하기 위해 참기름 총 필요한 용적 3,000 μg의 에스트라 디올 / 1ml의 참기름 원액의 계산 볼륨.
   참고 : 또는 에스트로겐 그쪽의 다른 양식을 사용 t는 수용성 및 용해하기 쉽다.

6. 제 2 일 : 에스트라 디올 관리 / 멸종 교육

1. 에스트라 디올 피하을 관리합니다. 부드러운 핀치에 목에 의한 견갑골 사이의 느슨한 피부를 들어 올려 피부 주름에 의해 형성되는 삼각형에 주사기 바늘을 삽입합니다.
2. 에스트라 디올의 피하 주사 후 30 분, 다시 조절 챔버에 동물을 배치하고 멸종 훈련을 시작합니다. 이 멸종 세션에서, 3 분 평균 가변 intertrial 간격에서 발표 된 30 초, 4 kHz에서, 80dB 톤으로 구성된 각각의 시험과, 20 CS 형 시험을 수행합니다.
   참고 : 에스트라 디올 전에 멸종 훈련에 즉시 소멸 후 투여 할 때 리콜에 에스트라 디올의 효과가 발생합니다. 효과는 4 시간 포스트 멸종 관찰되지 않으므로 그것은 훈련 ^(15)의 시작과 끝 시간에 가까운 주입하는 것이 좋습니다.

. 제작 "> 7 주 3 : 멸종 리콜

1. 멸종 훈련 후 24 시간은 1 일이 프로토콜이 완료 동물을 면봉.
2. (주 1, 2와 동일) 할당 조절 챔버에 동물을 놓습니다. 단계 6.2에 설명 된대로 멸종 훈련 관리 (20) 시험과 유사한 intertrial 간격 만 3.80 dB CS 형 시험으로 구성되어 3 CS 형 시험 (멸종 리콜의 세 가지 시험)을 제시하여 멸종 리콜 세션을 시작합니다.
3. 리콜 세션이 완료되면, 자신의 홈 케이지에 동물을 반환합니다.

8. 데이터 분석

1. 비디오를 통해 행동 데이터를 수집하고 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 분석한다.
   참고 : 시간의 비율이 톤 동안 동결 지출로 동결 점수가 수동으로 각 시험의 CS 프레 젠 테이 션 동결 관찰 타이밍에 의한 약물 치료에 눈이 실험에 의해 계산 될 수있다, 표현. 냉동입니다30 초 CS-US 시험 동안 호흡을 제외하고 운동의 완전한 부족으로 정의했다. 100을 곱한 30초 (시험 기간)에 의해 (움직이지 않는)를 동결 소비 초를 나누어 %의 동결을 계산합니다.

결과

이 공포 멸종 리콜 프로토콜에서 %의 동결은 공포의 지표로 측정 하였다. 물론 진화와 멸종 훈련의 기억을 유지 동물 멸종 리콜 동안 행동 테스트의 마지막 날에 저 두려움을 나타냈다. 남성과 여성의 쥐 크게 에어컨, 멸종 동안 조건화 된 공포의 발현에 차이가, 그리고 단계 (그림 2)을 기억하지 않습니다. 동물 하이 사이드 및 로우 에스트로겐 발정 단계 그룹으로 개별적으로 분석된?...

토론

공포 멸종 다양한 조작에서 확인 및 평가 조건화 된 공포의 멸종을 중재 신경 메커니즘을 수컷 쥐에서 광범위하게 연구되고있다. 상대적으로 적은 연구는 암컷 쥐 공포의 멸종에서 성선 호르몬의 역할을 조사했다. 특히 공포 멸종에 에스트로겐의 효과를 연구하기 위해, 자연 순환 암컷 쥐에는 3 일간의 행동 패러다임을 실시한다. 이 절차는 습관화 / 에어컨, 멸종 및 멸종 리콜 단계로 구성됩니다....

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fear conditioning chamber	Coulbourn Instruments
Graphic State	Coulbourn Instruments
Sound-attenuating box	Med Associates, Inc.	NIR-022MD
Estradiol	Sigma-Aldrich	E1024	In sesame oil for subcutaneous injection
Sesame oil	Sigma-Aldrich	S3547-250ML
Freezescan	Cleversys, Inc.
Dip quick stain	Jorgensen Laboratories, Inc.	J0322A1, J0322A2, J0322A3
Cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-114	6-inch, sterile
0.9% saline	LabChem, Inc.	LC23460-2	Sodium chloride w/v
Selectfrost microscope slides	Fisher Scientific	12-550-003
Virex II 256	Diversey, Inc.	5019317	Dilute 1:256 with water
Luer-Lok Tip 1ml Syringes	Becton Dickinson	309628
Hypodermic disposable needles	Exelint International, Co.	26402	26-gauge