Doğal Kadın Rats Bisiklet içinde Koşullandırılmışlıktan Korku Extinction incelenmesi için Protokol

Özet

Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.

Özet

Şartlı korku Extinction yaygın erkek kemirgenlerde çalışılmıştır. Son zamanlarda, bazı davranışsal görevleri ve tepki davranışları için nöral mekanizmalar kadın ve erkeklerde farklı olduğunu belirten çalışmaların giderek artan sayıda olmuştur. Araştırma çalışmalarında kadın kullanma nedeniyle östrus döngüsü sırasında gonadal hormonların değişimi bir meydan okuma temsil edebilir. Bu protokol, dişi sıçanlarda korku söndürme bellek konsolidasyon östrojen rolünü araştıran yararlıdır köklü prosedürleri açıklar. Östrus döngüsü ve eksojen östrojen verilmesi öncesinde söndürme eğitimi Faz 24 saat sonra yok olma hatırlama etkileyebilir. Burada anlatılan östrus faz tanımlanması için vajinal alma, temizleme tekniği muayene ve doğal gonadal hormonlar bisiklet manipülasyonu yardımcı olur. ayrıca östrojen korku söndürme bellek modüle hangi mekanizmalar tasvir edebilir bu temel kemirgen modelinin kullanılmasıkadın.

Giriş

İçsel cinsiyet farklılıkları insanlarda ve kemirgenler hem de çeşitli bilişsel davranışları ve öğrenme paradigmaları arasında görülmektedir. Örneğin, erkekler daha iyi mekansal yetenekleri ^1-3 sahipken kadınlar genellikle, güçlü sözel ve detay odaklı yeteneklere sahip olduğu bildirilmiştir. Bu cinsiyet farklılıkları gonadal hormonların etkisiyle kısmen olabilir. Yüksek östradiol seviyesi kadınların daha iyi olduğu görevler performansını artırmak, ama erkekler genelde kuyu ^4-6 yaptığınız görevler performansı kötüleşir. Bu kanıt zorlayıcı olsa da, tamamen insan çalışmalarında deneysel ortamlarda kontrol sınırlı yeteneği davranışı bu etkilerin hormonlar özellikle isnat edilebilir, eğer zor belirlemek için yapar. Hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalar, bunun aksine, tam olarak kontrol edilen durumlar için izin verir.

Korku yok temel nöral mekanizmaları tespit edilmiştir ve iyi erkeklerde okudu rağmen, o belirsizdirBu sistemler kadın ya da nasıl östrus döngüsü boyunca değişiklik aynıdır. Korku klima ve sönme yaygın anksiyete bozukluğu ile ilgili çalışmalar yapmak üzere kemirgenlerde ve insanlarda davranış paradigmalar kullanılmaktadır. Kadınlar anksiyete bozuklukları için yüksek risk yanı sıra yüksek semptom süresi ve şiddetini ^7-13 sahip olduğu göz önüne alındığında, bu çalışmalarda kadın dahil etmek önemlidir. Bu araştırmada kadınların underrepresentation seks hormonlarının davranışsal etkileri için estrojen faz izleme ve muhasebe zorlukları bağlı olabilir. Genellikle geçmiyor veya kendi çalışmaları için yöntemler açıklanmayan Bu bağlamda karşılaşma konularında kadın incelemek yapmak Laboratuvarlar.

Kemirgenlerde delil Yükselen korku yok seks farklılıkları gonadal hormonların ^14-18 tarafından modüle olduğunu göstermektedir. Korku klima, hayvanlar, belirli bir uyaran korku için eğitilmiştir. Bir Katkısız sunumlar bir sayıdan sonrauyarıcı, hayvanlar işaret, yok denilen bir süreç korku değil öğrenirler. Ne kadar iyi hayvan öğrenir ve söndürme eğitimi bir süre sonra verilen bir nesli geri çağırma testi sırasında görülebilir bu görevi öğrenme bellek birleştirir. Tükenme hatırlama sırasında daha az korku ifadesi iyi söndürme bellek konsolidasyonu gösterir. Laboratuvarımızda elde edilen son bulgular östrojen korku söndürme bellek konsolidasyonu modüle ve söndürme hatırlama artırabilir öneririz. Özellikle, Proestrus içinde söndürülür dişi sıçanlar, östrus döngüsü faz sırasında östrojen düzeyleri zirve, tükenme bellek sergi gelişmiş tutma dolaşan. Buna karşılık, önce veya hemen söndürme eğitimi ^15,16 sonra eksojen östradiol yönetimi ile geliştirilebilir düşük östrojen ostrus faz ekran nispeten zayıf nesli hatırlama olarak söndürülür kadın,. tükenme bellek konsolidasyon nöral mekanizmaları (KDVKadınlarda gonadal hormonların rolü) uding net değil.

Laboratuvar hayvanlarında, hormonların, kastrasyon ve ovariektomi invazif cerrahi olarak çıkarılması prosedürler kullanılarak araştırılabilir. Ameliyat sonrası iyileşme müteakiben, gonadal hormonlar genellikle dışsal olarak bir davranış görev ¹⁹ performansı sırasında manipüle edilmektedir. Bu yaklaşım, seks hormonları hakkında önemli bilgiler sağladı ve ^20-23 (zamanlama ve doz açısından) gonadal hormonların iyi kontrollü manipülasyon için izin verir, çünkü yararlıdır olmuştur. Bu yaklaşım, ancak, östrüs döngüsü boyunca ortaya ne de böylece insan çalışmalara translasyonel potansiyelini sınırlayan, "normal" hayvanları temsil ediyor doğal olarak meydana gelen dalgalanmaların etkisini değerlendirmek değildir. Bu iyi belgelenmiş oldu belirli östrus döngüsü aşamalarında, ve döngüsü içinde östrojen reseptör ifade değişiklikleri de kadın cinsiyet hormonu seviyeleri zirve ve düşüş,ve ovariektomiye ²⁴ sonrası. Böylece, sağlam gonadlar kadınlarda üzerinde çalışmalar yapmak ve güvenilir yüksek ve düşük östrojen devletler kendi ömrü boyunca kadın üzerinde olan etkilerini incelemek için deneysel tasarımlar geliştirmek için bir ihtiyaç vardır.

Bu protokol korku yok katılan nörobiyolojik sistemler üzerinde östrojenin etkisi üzerinde duruluyor. 1) dikkatli, östrus döngüsü izlemek 2) Sistemik uygulama için östradiol etkili dozlarda hazırlamak, ve 3) korku klima, nesli içeren bir davranış paradigma takip ve doğal bisiklet dişi sıçanlar içinde hatırlamak: Bu nasıl açıklanır. Bu protokol, daha tükenme davranışını korku şartlandırılmış gözlenen cinsiyet farklılıkları anlamak için çalışmalar yardım için diğer farmakolojik manipülasyonlar ve hücresel ve moleküler araçlar ile modifiye edilebilir. Aşağıda açıklanan prosedürleri laboratuvar içinde kullanılan olanlar olduğunu unutmayın, ve bu işlemlerin varyasyonları bir dizi var in edebiyat.

Protokol

NOT: Bu protokol tüm işlemler Massachusetts Genel Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) olarak hizmet vermektedir Araştırma Hayvan Bakım Alt Komitesi tarafından onaylanmış, ve Sağlık kılavuzların National Institutes uygundur edilmiştir.

1. Hayvan Konut ve Taşıma Prosedürü

1. Girişte, ev erişkin Sprague Dawley dişi sıçanlar yaş yaklaşık 8-10 hafta woodchip yatak ile 3-4 inçlik plastik bidon gruplar halinde (200-225 gr ağırlığında). Bir tanesi çorbaya ad libitum erişim diyet ve su ve 12 saat aydınlık / karanlık döngüsünde bunları muhafaza edin. 1 hafta en az konut koşulları ve hayvan tesis gelmesini fareler bırakın.
   NOT: Bu yazının tüm işlemler ışık döngüsü sırasında yapılmaktadır.
2. Bu alışma süresinden sonra, 5 dakika 2-3 gün her biri için tüm hayvanları idare. Düzgün, (gövde tarafından değil kuyruk tarafından desteklenen) bir seferde sıçan bir pick upgüvenli onları tutun ve bu süre içinde onları pet. Ürkek, ya da daha uzun süre için endişeli, stresli daha görünür hayvanları taşıyınız. Bu protokolde aşağıdaki adımları etkileyebilecek stres en aza indirmek için bunu yapın.
   NOT: gün sayısı ve zaman farklı laboratuvarlarında arasında değişebilir hayvanların taşıma miktarı; Ancak, bu aynı laboratuvarda içindeki deneyler arasında tutarlı olmalıdır.

2. Kızgınlık Döngüsü İzleme: Vajinal Çubuğu bulaşması ve Boyama Prosedürü

1. % 0.9 tuzlu su çözeltisi (sodyum klorür, distile su içinde çözündürülmüş) olun. Bu çözümde bir pamuk uçlu aplikatör nemlendirin. Yetersiz numune toplama veya hücre kaybına yol açabilecek doyma önlemek için kağıt havlu kullanarak ucu kurulayın. Yukarı doğru vajinal açıklıktan kuyruk Holding, yavaşça vajinal kanal içine pamuk ucu takın ve gevşek vajinal hücreler yakalamak için duvarların etrafında döndürün.
2. Hayvan karyolası urinates iseidrar kirlenme faz tanımlanması için zor hale getirecek gibi tonluk ucu, bir yenisi ile değiştirin. Strese maruz östrus döngüsü bozabilir çünkü bu işlem sırasında hayvana sıkıntı neden değil son derece dikkatli olun. Sürüntü zaman sahte gebeliği uyarabilir serviks, ekstra stimülasyon en aza indirmek için çok derin olmayan bir hızlı ekleme ve geri çekilme sağlamayı hedefliyoruz.
   Not: yalancı örneğin tipik olarak yaklaşık 12 gün süren bir asiklik östrus döngüsü, diöstrüste ²⁵ ardışık gün olarak tespit edilebilir.
3. Dikkatle aplikatör ucu çıkarın ve bir ön-etiketli mikroskop lamı üzerine yuvarlayın. Faz kimlik kez zor kuru yapabilirsiniz slayt çok fazla sıvı gibi çok sert basmaya kaçının.
   NOT: Bu bireysel tercihlerine göre yapılabilir, ancak bir slayt, her hayvan için birden fazla gün içerebilir.
4. Slayt üzerine numune transferler emin olun. Sever için örnekleri toplayınbir slaytta al gün üst üste iyi parça muktedir ve günlük östrus fazlar değişiklikleri tanımlamak için.
   NOT: örneklerin toplanması insanlar hayvanlar için aynı kalırsa, o da ideal Mümkünse.
5. Slayt kuruduktan sonra, faz tespiti için boyama protokolü başlar. Boyama kiti (Malzeme Tablo) kullanarak, fiksatif (açık mavi) slaytlar 10 kez batırmayın, (pembe) leke çözeltisi içinde 10 kez ve counterstain çözeltisi içinde 5 kez (mor). Durulayın yavaşça akan suyun altında kayar. Mikroskop altında inceleyen önce tamamen kuru hava slaytlar edelim.
   Not: 4-5 gün boyunca çevrimi (bu sırayla) oluşur: kızışma (E) ostrus (M) diöstrüste (D) ve proestrus (P) ^26. Östrus mavi, boynuzsu hücreleri, lökositler tarafından ostrus ve kornifıye ve çekirdekli hücrelerinin bir kombinasyonu ile karakterize olduğu, diöstrüste çok seyrek dışında hücre tiplerinin mevcudiyetinde ostrus benzer ve proestrus mor lekeli agregatları ileve çekirdekli hücreleri (Şekil 1). Vajinal sitoloji yayma için eşit derecede etkin olan, yukarıda tarif edilenlere ek olarak çeşitli boyama işlemleri vardır.
6. Doğru deney öncesinde aşamalarını izlemek için en az iki tam döngüsü (~ 8-10 gün) örnekleri toplayın. Numuneler alınır günün saatine ile tutarlı olun. Boyunca ve deney sonuna kadar günlük vajinal smear örnekleri toplayın.

3. Ön pozlama

1. Deneyin başlamasından önce, odalar hayvanlar herhangi bir davranış testi öncesi bağlamında (klima odaları) gelmesini bekleyin klima hayvanları önceden maruz.
   1. Herhangi bir deney öncesinde 3 gün boyunca günde 20-30 dakika süreyle ev ışıkları ile (ses azaltıcı kutularda bulunur) Klima odalarına kadın Öncesi maruz. Onlar önceden maruz kalan çalışma için kendi odasına olarak vardır kutuyu atayın. İyice temiz tonlar davranış ve östrus döngüsü etkileyebilir çünkü oturumları ve hayvanlar arasındaki o kutuları (duvarlar ve tepsiler) kokuları çıkarmak için.

4. Gün 1: Alışma / Korku Klima

1. Hayvanlar östrüs siklusu ve östrus fazında olduğu doğrulandıktan sonra, 3 gün deney alışkanlık / Klima faz başlar.
   1. Ön sinyal sesi deney her gün ilk sesi şartına uyarana önce (CS) sunumlar donma temel önlemleri alın. CS başlamasından önce ilk CS-alone davanın başında uyaran-devamsızlık zaman aralığında (100 ile çarpılır deneme süresi ile hareketsiz harcanan saniye bölünmesiyle hesaplanan) yüzde dondurma puanları alarak bu yapın.
      NOT: Bu tedbirler değerlendirmek ve alışma, klima, nesli ve hatırlama sırasında olanlarla temel donma seviyelerini karşılaştırmak için kullanılır.
   2. Ostrus aşamasında söndürme eğitimi yapmak için,kızışma onların son günü sıçan ko˛ullandırın. Sürüntü ve tanımlamak östrus faz (adım 2) deneysel protokol (Klima / sönme / hatırlama) başlamadan önce her gün. Kızışma faz bir gün daha uzun sürebilir gibi hayvanlar eğitime başlamak için hazır olduğunuzda, kullanım döngüsü geçmişi belirlemek için aşamadan uzunluğunu tahmin etmek.
2. Klima odalarında, bir elektrik stimülasyonu jeneratörüne ayak-şok ızgara zemin bağlayın. Koşulsuz uyarıcı (ABD) olarak 0.5-0.6 mA stimülasyon seviyesini kullanın. 4 kHz, şartlandırılmış uyaran (CS) olarak 80 dB sesi kullanın.
   NOT: Bu parametreler laboratuarlar arasında değişebilir ve optimal klima modifiye edilebilir.
   1. (Zamansal aksine) dondurma analiz programı görsel ipuçları gerektiriyorsa, sesi ile bir LED ışığı eş-etkinleştirin. Video çerçevesinde, edimsel odasının dışına ışık yerleştirin. Her denemenin başında, LED ışığı aktive ve th sonuna kadar ışıklı tutmakE deneme.
      NOT: Bu ışık hayvan tarafından görünür değildir ve sadece başlatılması ve kaydedilen video dosyaları içinde deneme sonu için bir belirteç olarak hizmet vermektedir (donma davranışı ölçmek için kullanılacak).
3. Alışma 5 CS-alone denemeler için klima odalarına hayvanları yerleştirin. Hemen alışma oturumu izleyen, korku şartlandırma 7 eşleştirilmiş CS-ABD denemeler yapın. CS tonu 30 saniye sürer ve 0,5 sn ABD şok coterminates emin olun. 3 dakika ortalama değişken intertrial aralıklarla tüm oturumlara (alışma, klima, yok olma, ve hatırlama) çalıştırın çalışmalar.
4. Klima oturumun sonunda, ertesi güne kadar hayvan tesis evlerinde kafeslerde ve hayvanların dönün.

5. Gün 2: Estradiol Hazırlık

1. Sürüntü ve bu protokolün 1. Gün yapılan tüm hayvanlar için estrojen faz tespit. Estradiol hazırlanması (aynı zamanda E2, 17beta-östradiol, ya da bilinensusam yağı ya da taşıyıcı olarak% 0.9 tuzlu su kullanılarak, bir 15 ug / kg dozda deri altı enjeksiyonu olarak beta-estradiol).
2. Enjeksiyonlar için hazırlamak bu protokolün Gün 1 şartına zaman ölçülmüş ve kaydedilmiş tüm hayvanların, vücut ağırlıkları kullanmak için östradiol miktarını hesaplamak için.
3. Sıçan başına estradiol (örneğin, 0.2 mi), aralannda, tatbik hacmi standardize etmek için hesaplamaları yapar. Östradiol dolayı suda çözünmezlik erimesi zor olan ve küçük bir doz için çözücünün büyük bir hacim gerektirdiği için, çözülene kadar ateşte susam yağı içinde estradiol karıştırılarak bir stok solüsyonu hazırlanır. Çözelti daha sonra kirlilikleri çıkarmak için bir 0.22 um filtre içinden geçirilebilir. Örneğin, hayvan başına 0.2 ml'lik bir enjeksiyon hacmi içinde 15 ug / kg bir doz elde etmek için, susam yağı, toplam gerekli hacme 3.000 ug estradiyol / 1 ml susam yağı stok çözeltisi hesaplanmış hacim ekleyin.
   NOT: Alternatif olarak, östrojen tha diğer formları kullanmak t, suda çözünür ve çözünmesi için daha kolaydır.

6. Gün 2: Estradiol Yönetimi / Extinction Eğitimi

1. Östradiol subkutan yönetme. Nazik bir tutam boynundan skapula arasında gevşek cilt kaldırın ve deri kıvrım oluşturduğu üçgenin içine şırınga iğnesi takın.
2. Östradiol deri altı enjeksiyonu takiben 30 dakika, yine klima odalarında hayvanları yerleştirin ve söndürme eğitimi başlar. Bu yok oluş oturumunda, 3 dakika ortalama değişken intertrial aralıklarla sunulan 30 sn, 4 kHz, 80 dB sesi oluşan her deneme, ile, 20 CS-alone denemeler yapmak.
   Not: östradiol önce söndürme eğitim veya hemen sönmesinden sonra tatbik edildiği zaman, geri çağırma estradiolün etkisi ortaya çıkar. etkisi 4 saat sonrası nesli görülmez, bu yüzden eğitim oturumu ¹⁵ başına veya sonuna zaman yakın enjekte tavsiye edilir.

. le "> 7 Gün 3: Extinction Geri Çağırma

1. Tükenme eğitimden sonra 24 saat, Gün 1 ve bu protokolün 2 tamamlamış hayvanlar çubukla.
2. (Gün 1 ve 2 ile aynı) kendi atanan klima odalarına hayvanları yerleştirin. Adım 6.2 anlatıldığı gibi yok olma eğitimi için uygulanan 20 çalışmaların benzer intertrial aralıklarla sadece 3.80 dB CS-alone çalışmaların oluşur 3 CS-alone denemeler (tükenme hatırlama üç deneme), sunarak nesli geri çağırma seansı başlayın.
3. Geri çağırma seansının tamamlanmasının ardından, evlerinde kafeslerde hayvanların dönün.

8. Veri Analizi

1. Video aracılığıyla davranışsal veri elde ve bilgisayar yazılımı kullanarak bunları analiz.
   NOT: zaman yüzdesi sesi sırasında donma harcanan Donma puanları da elle her deneme CS sunumu sırasında donma nöbetleri zamanlama ilaç tedavisine kör bir deneyci tarafından sayılabilir, dile getirdi. Donma olduğunu30 sn CS-ABD çalışmalar sırasında nefes dışında hareket eksikliği tamamlamak tarafından tanımlanan. 100 ile çarpılır 30 saniye (deneme süresi) tarafından (taşınmazı,) dondurma harcanan saniye bölerek yüzde donmasını hesaplayın.

Sonuçlar

Bu korku söndürme hatırlama protokolde, yüzde donma korku göstergesi olarak ölçüldü. Iyi söndürdü ve söndürme eğitimi bellek muhafaza Hayvanlar tükenme hatırlama sırasında davranışsal test son gününde düşük korku sergiledi. Erkek ve dişi sıçanlar anlamlı klima, nesli sırasında şartlandırılmış korku ifadesi farklı, ve aşamaları (Şekil 2) hatırlamıyorum. Hayvanlar yüksek ve düşük östrojen östrus faz grupları olarak ayrı ayrı incelendiğinde Ancak, bir se...

Tartışmalar

Korku söndürme çeşitli manipülasyonlar kapsamında tanımlanan ve değerlendirilen koşullandırılmış korku nesli aracılık nöral mekanizmalarla erkek sıçanlarda yoğun çalışılmıştır. Nispeten az sayıda çalışma dişi sıçanlar veya korku yok gonadal hormonların rolünü inceledik. Özellikle korku yok östrojenin etkilerini incelemek için, doğal olarak bisiklet dişi sıçanlar üç günlük davranış paradigmaya tabi tutulmaktadır. Bu prosedür alışma / Klima, tükenme ve yok oluş hatır...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fear conditioning chamber	Coulbourn Instruments
Graphic State	Coulbourn Instruments
Sound-attenuating box	Med Associates, Inc.	NIR-022MD
Estradiol	Sigma-Aldrich	E1024	In sesame oil for subcutaneous injection
Sesame oil	Sigma-Aldrich	S3547-250ML
Freezescan	Cleversys, Inc.
Dip quick stain	Jorgensen Laboratories, Inc.	J0322A1, J0322A2, J0322A3
Cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-114	6-inch, sterile
0.9% saline	LabChem, Inc.	LC23460-2	Sodium chloride w/v
Selectfrost microscope slides	Fisher Scientific	12-550-003
Virex II 256	Diversey, Inc.	5019317	Dilute 1:256 with water
Luer-Lok Tip 1ml Syringes	Becton Dickinson	309628
Hypodermic disposable needles	Exelint International, Co.	26402	26-gauge