JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Abstract

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of ‘‘collateral’’ neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

Introduction

Death of oligodendrocytes and destruction of the myelin sheath accompanied by loss of neurons and axons are typical pathological findings in grey matter lesions in individuals suffering from multiple sclerosis (MS)1,2. Cortical lesions can be divided so far in three different subtypes2: subpial, intracortical and leukocortical lesions. In comparison to white matter plaques, infiltrates are characterized by a predominance of CD8+ T-cells, suggesting their possible decisive role in grey matter inflammation3. Furthermore, oligoclonal expansions in blood, cerebrospinal fluid (CSF) and within inflammatory lesions can be found for CD8+ T-cells themselves4-6.

In line with this, it is assumed that CD8+ T-cells may be specific for different myelin proteins7,8. Indeed, CD8+ T-cells are found near oligodendrocytes and myelin sheaths9,10 that show MHC I expression11 and might therefore be responsible for the loss of the myelin sheath. This process is often seen together with extensive ‘‘collateral’’ neuronal and axonal damage within the central nervous system (CNS) grey matter1,2. In fact, direct and indirect death of oligodendrocytes and neurons is induced by CD8+ T-cells via two different mechanism: (i) cell membrane swelling and rupture due to the formation of cytotoxic granules following the release of perforins and granzymes and (ii) ligation to the Fas receptors or exposition of FasL on their surface8,12,13.

Different types of animal models are established to study the underlying mechanism of the mentioned processes. In this respect, primed CD8+ T-cells specific for autoantigens with induced expression in CNS glial cells, like oligodendrocytes or astrocytes, can be adoptively transferred to analyse ‘‘collateral’’ neuronal and axonal death in grey matter subsequently14,15. To perform such in vivo experiments is a big help to mimic some pathophysiological aspects of MS, however, this approach is not suited to resolve the underlying mechanism and kinetics of axonal damage and neuronal apoptosis.

To overcome these restrictions, an ex vivo approach was established to study the mechanisms and time course of neuronal cell death following a oligondendrocytes-directed CD8+ T-cell attack. Since only oligodendrocytes and therefore myelin sheath production should be targeted by immune cells, MHC class-I-restricted, ovalbumin (OVA)-reactive OT-I Tcells are used16. These cells are subsequently transferred into brain slices obtained from mice selectively expressing OVA in oligodendrocytes (ODC-OVA mice)17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

كل التجارب باستخدام الفئران يجب أن يتم تنفيذ وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية منها رعاية الحيوانات واستخدامها.

1. التعليقات العامة للتجارب ماوس

  1. الحفاظ على الفئران تحت ظروف خالية من مسببات الأمراض وتمكينهم من الحصول على الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية.
    ملاحظة: من المهم استخدام الفئران السن والمطابقة الجنس في المجموعات التجريبية لأنماط المناعية يمكن أن تختلف مع تقدم العمر والجنس.

2. CD8 + T-خلايا إعداد وتفعيل OVA محددة (OT-I)

  1. أداء تحفيز خلايا OT-I T كما هو موضح أدناه 5 أيام قبل إعداد شرائح الدماغ.
    ملاحظة: 5 × 10 5 المستجيب تنشيط CD8 + OT-I T-خلايا (CD8 + T-خلايا الفئران المعدلة وراثيا الاعتراف فقط الببتيد OVA 257-264 في سياق جزيئات MHC-I) وهناك حاجة لكل شريحة تركيز 5 × 10 5 تم اختيار التجربةحليف واحدة الأمثل لصالح جيدة التفاعل خلية خلية أخرى أن الخلايا تبدأ يهاجرون إلى شريحة، وفي الوقت نفسه، كمية من الخلايا ليست مرتفعة جدا للحث على رد فعل مبالغ فيه السماح خلية واحدة العد 8،18.
  2. إعداد المتوسطة لزراعة OT-I T-الخلايا. تكملة 500 مل DMEM مع 5٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 10 ملي HEPES، 2 مم L-الجلوتامين، 50 ميكرومتر 2-المركابتويثانول، 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية و 25 ميكروغرام / مل الجنتاميسين. تخزين المتوسطة في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  3. إزالة الطحال من OT-I الفئران المعدلة وراثيا وفقا لمرجعية 16. نقلها إلى متوسطة على استعداد.
  4. توليد تعليق خلية واحدة من يهرس الطحال من خلال 70 ميكرومتر مصفاة وأجهزة الطرد المركزي تعليق في 300 x ج لمدة 5 دقائق، 4 ° C.
  5. احتضان تعليق الخلية مع 5 مل الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK) عازلة (150 ملي NH 4 CL، 10 ملي KHCO 3، 0.1 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 7.3) لمدة 5 دقائق لليز خلايا الدم الحمراء.
  6. وقف incubatiعلى مع 10 مل المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى كما هو موضح أعلاه.
  7. تمييع تعليق خلية في المتوسط ​​وحساب الأرقام. لوحة الخلايا في مناطق ذات كثافة من 3 × 10 7 خلايا / جيد في لوحة 12-جيدا ومنهم الوزراء من قبل الحضانة مع OVA 257-264 (SIINFEKL، 1 نانومتر) وانترلوكين 2 (IL-2) (500 وحدة دولية / مل) ل 5 أيام.
  8. بعد 4 أيام، إضافة IL-2 عند تركيز 500 وحدة دولية / مل مرة أخرى.
  9. وبعد أن التحفيز، وتنقية OT-I T-الخلايا من التعليق الخلية باستخدام مجموعة مختارة الماوس السلبي القائم CD8 + T عدة عزل خلايا التالية تعليمات الشركة الصانعة. ويستند تنقية على استنزاف جميع CD8 + غير الخلايا باستخدام مزيج من الأجسام المضادة ضد CD4، CD11b، CD11c و، CD19، CD45R (B220)، CD49b (DX5)، CD105، MHC من الدرجة الثانية، تير-119، وTCRγ / δ التي يتم بعد ذلك التخلص منها باستخدام أعمدة المغناطيسية لشطف من CD8 + T-خلايا النقاء.
    ملاحظة: الخطوات الهامة في هذا proceduيشار إلى إعادة كتبها المصنوعات: من المهم أن رد الفعل ينطوي على الخلايا واحد فقط لأن وجود كتل يمكن منع العمود خلال الخطوة شطف. عد من الخلية قبل إضافة كوكتيل Byotin المهم للحصول على درجة نقاوة العينة ويجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء على الجليد للحد من الارتباطات الأجسام المضادة غير محددة.

3. إعداد الحاد الدماغ شرائح والمشارك الثقافة مع OT-I T-خلايا

  1. قبل إعداد الدماغ الحاد شرائح 19، وإعداد placedine محلول ملحي الفسيولوجية الجليد الباردة باستخدام 200 ملي السكروز، 20 أنابيب ملي، و 2.5 ملي بوكل، 1.25 ملي ناه 2 PO 4، 10 ملي MgSO 4، 0.5 CaCl 2 و 10 ملي سكر العنب والسائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) باستخدام 125 مم كلوريد الصوديوم، و 2.5 بوكل، 1.25 ناه 2 PO 4، 24 ملي NaHCO 3، 2 ملي MgSO 4، 2 مم CaCl 2، 10 ملم سكر العنب. ضبط درجة الحموضة من كل حل ل7.35 كتبها النقيبز هيدروكسيد الصوديوم. قبل ضبط درجة الحموضة من ACSF، لا بد من فقاعات الحل مع خليط من 95٪ O 2 و 5٪ CO 2.
  2. قبل تبريد الحلول.
  3. تخدير 8 - 10 أسابيع الفئران القديم (على سبيل المثال، C57BL / 6 عن السيطرة أو المعدلة وراثيا ODC-OVA الفئران 17 مع استنشاق باستخدام 5.0٪ الأيزوفلورين، 5.0٪ هالوثان أو حقن 100 ملغ / كغ الكيتامين و 10 ملغم / كغم من وزن الجسم عن طريق زيلازين الملكية الفكرية انتظر للتخدير واستخدام قرصة أخمص القدمين إلى تقييم مستوى التخدير واقطع رؤوسهم في آن واحد. الموت ببطء الفئران وفقا لرعاية الحيوان المؤسسية واستخدام معايير لجنة للقتل الرحيم.
  4. ضع الماوس في موقف بطني. تطهير فروة الرأس وقطع sagittally. فتح عظم الجمجمة sagitally، وإزالة الدماغ بسرعة مع مساعدة من مغرفة وإصلاحه على لوحة من vibratome باستخدام الغراء.
  5. ملء لوحة مع استعداد placedine محلول ملحي الفسيولوجية الجليد الباردة.
  6. قطع 300 ميكرون شرائح الاكليلية مع vibratome.
    ملاحظة: هذا الإجراء هو أعلمن لتسفر قابلة للحياة عينات الأنسجة سليمة مناسبة للدراسات الخلوية وظيفية في غضون فترة زمنية لا يقل عن 8 ساعة 19-21. وبالفعل، وبعد هذه الفترة الزمنية، بدءا بالفعل بعد 6 ساعات، وإعداد يظهر انخفاض الجودة، وهي التغيرات في الخصائص الأساسية والوظيفية مثل عمل الجيل المحتملين والانتشار.
  7. بعد باجتزاء، ونقل شريحة واحدة على الفور في كل بئر من لوحة 12-جيدا مليئة ACSF.
  8. إضافة بعناية 5 × 10 5 خلايا OT-I T لكل شريحة.
  9. احتضان شرائح لمدة تصل إلى 8 ساعات في حاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2).
  10. بعد فترة الحضانة، وشرائح الحصاد وتضمين عليها باستخدام أكتوبر مجمع الأنسجة تيك وتجميدها في النيتروجين السائل. تخزينها في -20 ° C لمزيد من الدراسات النسيجية لمثل تقييم بنية الخلايا العصبية (على سبيل المثال، وذلك باستخدام مكافحة MAPII أو أضداد synaptophysin) أو موت الخلايا المبرمج (على سبيل المثال، وذلك باستخدام معاداة كاسباس 3 الأجسام المضادة والمعادية للNeuN المضادةالهيئات) وفقا للإجراءات القياسية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

بعد مرور فترة الحضانة من شرائح الدماغ مع CD8 + T-خلايا الموجه دبقية قليلة التغصن، قليلة التغصن وكذلك الخلايا العصبية تخضع لموت الخلايا المبرمج (أرقام 2A و 1C، على التوالي). علامات النسيجية من موت الخلايا المبرمج (على سبيل المثال، كاسباس 3، في Tunel) يمكن أ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد وصفت نماذج حيوانية مختلفة على مدى العقود الماضية لمعالجة الميزات المرضية من الاضطرابات المزيل للالتهابات مثل MS. في الجسم الحي وتستخدم على نطاق واسع الماوس والفئران نماذج لمحاكاة السمات الفيزيولوجية المرضية للمرض، أي تحليل النتائج المترتبة على عمليات إزال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

This work was supported by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 to S.G.M. ME3283/2-1 to S.G.M.) and by Innovative Medizinische Forschung, Münster (I-BI111316, SB and SGM).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
12-Well plateCorning3513
2-MercaptoethanolGibco31350-010
2-MethylbutanRoth3927.1
70 µm strainerFalcon352350
CaCl2Merck1.02382.0500calcium chloride
CD8+-isolation kitMiltenyi Biotech130-090-859
D(+)-glucoseMerck1.08337.1000
DMEMGibco31966-021warm in 37 °C water bath before use
EDTASigmaE5134
FCSPAA LaboratoriesA15-151fetal calve serum
GentamicinGibco15750-060
HEPES 1 MGibco15630-050
IL-2Peprotech212-12
IsofluranAbbott05260-05
KClMerck1.04933.0500potassium chloride
KHCO3SigmaP9144potassium hydrogen carbonate
L-GlutamineGibco35050-038
MgSO4Merck1.05886.0500magnesium sulfate
NaClSigma31434sodium chloride
NaH2PO4 * H2OMerck1.06346.0500sodium hydrogen phosphate
NaHCO3Merck1.06329.0500sodium hydrogen carbonate
NaOHMerck1.09137.1000sodium hydroxide
NH4ClSigma213330ammonium chloride
Non essential amino acidGibco11140-050
OVA (257-264)GenscriptRP10611ovalbumin
PIPESSigmaP6757
SucroseMerck1.07687.1000
Tissue-Tek OCTSakura4583

References

  1. Moll, N. M., et al. Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences. Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).
  2. Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).
  3. Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).
  4. Babbe, H., et al. Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction. J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).
  5. Junker, A., et al. Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions. Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).
  6. Skulina, C., et al. Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).
  7. Friese, M. A., Fugger, L. Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy. Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).
  8. Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability). FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).
  9. Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis. J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).
  10. Hauser, S. L., et al. Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).
  11. Hoftberger, R., et al. Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions. Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).
  12. Göbel, K., et al. Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack. Glia. 58, 469-480 (2010).
  13. Melzer, N., et al. Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter. J Neuroinflammation. 10, 121(2013).
  14. Huseby, E. S., et al. A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis. J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).
  15. McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen. Glia. 53 (5), 457-466 (2006).
  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76 (1), 17-27 (1994).
  17. Cao, Y., et al. Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes. Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).
  18. Göbel, K., et al. CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level. J Neuroinflammation. 9, 41(2012).
  19. Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
  20. Meuth, S. G., et al. Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons. J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).
  21. Misgeld, U., Frotscher, M. Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply. Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).
  22. Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices. J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

96 MS neuroinflammation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved