JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Abstract

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of ‘‘collateral’’ neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

Introduction

Death of oligodendrocytes and destruction of the myelin sheath accompanied by loss of neurons and axons are typical pathological findings in grey matter lesions in individuals suffering from multiple sclerosis (MS)1,2. Cortical lesions can be divided so far in three different subtypes2: subpial, intracortical and leukocortical lesions. In comparison to white matter plaques, infiltrates are characterized by a predominance of CD8+ T-cells, suggesting their possible decisive role in grey matter inflammation3. Furthermore, oligoclonal expansions in blood, cerebrospinal fluid (CSF) and within inflammatory lesions can be found for CD8+ T-cells themselves4-6.

In line with this, it is assumed that CD8+ T-cells may be specific for different myelin proteins7,8. Indeed, CD8+ T-cells are found near oligodendrocytes and myelin sheaths9,10 that show MHC I expression11 and might therefore be responsible for the loss of the myelin sheath. This process is often seen together with extensive ‘‘collateral’’ neuronal and axonal damage within the central nervous system (CNS) grey matter1,2. In fact, direct and indirect death of oligodendrocytes and neurons is induced by CD8+ T-cells via two different mechanism: (i) cell membrane swelling and rupture due to the formation of cytotoxic granules following the release of perforins and granzymes and (ii) ligation to the Fas receptors or exposition of FasL on their surface8,12,13.

Different types of animal models are established to study the underlying mechanism of the mentioned processes. In this respect, primed CD8+ T-cells specific for autoantigens with induced expression in CNS glial cells, like oligodendrocytes or astrocytes, can be adoptively transferred to analyse ‘‘collateral’’ neuronal and axonal death in grey matter subsequently14,15. To perform such in vivo experiments is a big help to mimic some pathophysiological aspects of MS, however, this approach is not suited to resolve the underlying mechanism and kinetics of axonal damage and neuronal apoptosis.

To overcome these restrictions, an ex vivo approach was established to study the mechanisms and time course of neuronal cell death following a oligondendrocytes-directed CD8+ T-cell attack. Since only oligodendrocytes and therefore myelin sheath production should be targeted by immune cells, MHC class-I-restricted, ovalbumin (OVA)-reactive OT-I Tcells are used16. These cells are subsequently transferred into brain slices obtained from mice selectively expressing OVA in oligodendrocytes (ODC-OVA mice)17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הניסויים באמצעות עכברים צריכים להתבצע בהתאם להנחיות ועדת טיפול בבעלי החיים ושימוש המוסדית, בהתאמה.

1. הערות כלליות לניסויים בעכבר

  1. שמור על העכברים בתנאי הפתוגן ללא ולאפשר להם גישה כלרצונך מזון ומים.
    הערה: חשוב להשתמש בעכברי גיל והתאמת מין בקבוצות ניסוי כי דפוסים חיסוניים יכולים להשתנות עם גיל ומין.

2. CD8 + T לתאי הכנה והפעלה של OVA ספציפי (OT-I)

  1. לבצע גירוי של תאי OT-T אני כמתואר להלן 5 ימים לפני הכנת פרוסות מוח.
    הערה: 5 x 10 5 מפעיל מופעל CD8 + OT-אני תאי T ריכוז 5 x (CD8 + T-תאים של עכברים הטרנסגניים הכרת פפטיד OVA 257-264 רק בהקשר של מולקולות MHC-I) יש צורך לכל פרוסה 10 5 נבחר ניסויברית כאופטימלית לטובת אינטראקציה תאי תאים טובה ברגע שהתאים מתחילים נודדים לפרוסה ו, באותו הזמן, את כמות התאים היא לא גבוהה מדי כדי לגרום לתגובת יתר המאפשר תא בודד ספירת 8,18.
  2. הכן את המדיום לculturing OT-T-תאים. להשלים DMEM 500 מיליליטר עם 5% עוברי עגל בסרום (FCS), 10 מ"מ HEPES, L-גלוטמין 2 מ"מ, 50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, חומצות אמינו החיוני 1% ו- 25 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין. אחסן הבינוני על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  3. הסר את הטחול של עכברים הטרנסגניים OT-כמו לכל התייחסות 16. העבר אותם למדיום מוכן.
  4. צור השעיה תא בודדת על ידי רסוק טחולים דרך מסננת השעיה ו צנטריפוגות 70 מיקרומטר ב XG 300 דקות 5, 4 ° C.
  5. דגירה השעיה תא עם 5 מיליליטר אמוניום כלוריד, אשלגן (ACK) חיץ (150 מ"מ NH 4 Cl, 10 מ"מ KHCO 3, 0.1 מ"מ EDTA, pH 7.3) במשך 5 דקות כדי lyse תאי דם אדומים.
  6. להפסיק incubatiעל עם מדיום 10 מיליליטר ו צנטריפוגות זה שוב כפי שתואר לעיל.
  7. לדלל השעיה התא בינוני ולחשב מספרים. פלייט תאים בצפיפות של 3 x 10 7 תאים / גם בצלחת 12 גם ו ראש על ידי דגירה עם OVA 257-264 (SIINFEKL; 1 ננומטר) ואינטרלוקין 2 (IL-2) (500 IU / ml) ל 5 ימים.
  8. לאחר 4 ימים, להוסיף IL-2 בריכוז של 500 IU / ml שוב.
  9. לאחר גירוי, לטהר OT-אני תאי T מהשעית תא באמצעות עכבר סלקציה שלילי מבוסס ערכת בידוד תא T CD8 + הבאים הוראות יצרן. טיהור מבוססת על הדלדול של כל מי שאינו CD8 + התאים באמצעות קוקטייל של נוגדנים נגד CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC Class II, Ter-119, וTCRγ / Δ אשר לאחר מכן הושלך על ידי שימוש בעמודות מגנטיות עבור elution של CD8 + T לתאים המטוהרים.
    הערה: צעדים קריטיים בprocedu זהמחדש מסומנים על ידי מייצר: חשובה שהתגובה כרוכה רק תאים בודדים, כי הנוכחות של גושים יכולה לחסום את הטור במהלך שלב elution; הספירה של התא לפני הוספת קוקטייל Byotin חשובה לתואר של טוהר של המדגם וההליך צריכה להתבצע על קרח כדי למזער איגודי נוגדן נוקבים.

3. הכנת פרוסות המוח חריפה ושיתוף התרבות עם OT-אני תאי T

  1. לפני הכנת המוח החריף פרוס 19, להכין פתרון placedine קר כקרח פיסיולוגי מלוח באמצעות 200 סוכרוז מ"מ, 20 מ"מ צינורות, 2.5 מ"מ KCL, 1.25 דקסטרוז 0.5 CaCl 2 ו -10 מ"מ לאא 2 PO 4, 10 מ"מ MgSO 4, ומלאכותי נוזל השדרתי (ACSF) באמצעות 125 mM NaCl, 2.5 KCl, 1.25 לאא 2 PO 4, 24 מ"מ NaHCO 3, 2 מ"מ MgSO 4, 2 מ"מ CaCl 2, 10 מ"מ דקסטרוז. התאם את ה- pH של כל פתרון ל7.35 על ידי using NaOH. לפני התאמת pH של ACSF, פתרון חייב להיות בועות בתערובת של 95% O 2, 5% CO 2.
  2. טרום לקרר את הפתרונות.
  3. הרדימי 8 - עכברים 10 שבוע ישנים (למשל, C57Bl / 6 כשליטה או עכברי ODC-OVA מהונדסים 17 עם שאיפה באמצעות isoflurane 5.0%, 5.0% halothane או להזריק 100 מ"ג / קילוגרם קטמין ו -10 מ"ג / xylazine קילוגרם משקל גוף באמצעות ה- IP חכה להרדמה ולהשתמש בקמצוץ הבוהן כדי להעריך את הרמה של הרדמה ולערוף אותם בבת אחת. להרדים את העכברים כמו לכל טיפול בבעלי חיים מוסדי ולהשתמש בקריטריוני וועדה להמתת חסד.
  4. שים עכבר בעמדת הגחון. לחטא ולחתוך קרקפת sagittally. פתח את עצם גולגולת sagitally, להסיר את המוח במהירות בעזרת סקופ ולתקן אותה על הצלחת של vibratome באמצעות דבק.
  5. מלא את הצלחת עם הפתרון מוכן placedine קר כקרח הפיזיולוגי מלוח.
  6. חותך 300 מיקרומטר פרוסות העטרה עם vibratome.
    הערה: הליך זה הוא יודעn להניב דגימות רקמה שלמות קיימא מתאימות ללימודים סלולריים פונקציונליים בתוך פרק זמן של לפחות 8 שעות 19-21 זמן. ואכן, לאחר פרק זמן זה, כבר מתחיל לאחר 6 שעות, הכנת תערוכות איכות מופחתת, כלומר שינויים במאפיינים בסיסיים ופונקציונליים כמו דור פוטנציאל פעולה והפצה.
  7. לאחר חתך, להעביר פרוסה אחת מייד לבאר כל צלחת 12 גם מלא בACSF.
  8. בזהירות להוסיף 5 x 10 5 תאי OT-T אני לכל פרוסה.
  9. דגירה פרוסות לתקופה של עד 8 ​​שעות בחממה (37 ° C, 5% CO 2).
  10. לאחר תקופת הדגירה, פרוסות קציר ולהטביע אותם על ידי שימוש ברקמה-tek מתחם OCT ולהקפיא אותם בחנקן נוזלי. לאחסן אותם ב -20 ° C ללימודים היסטולוגית נוספים לדוגמה, להעריך מבנה עצבי (למשל, אנטי-MAPII באמצעות או נוגדנים נגד synaptophysin) או אפופטוזיס (למשל, באמצעות אנטי caspase-3 נוגדנים ואנטי-אנטי NeuNגופים) על פי נהלים קבועים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

לאחר הדגירה של פרוסות מוח עם CD8 + תאי T-מכוון oligodendrocyte, oligodendrocytes כמו גם נוירונים עוברים אפופטוזיס (2A דמויות ו1C, בהתאמה). סימנים היסטולוגית של אפופטוזיס (למשל, caspase-3, Tunel) ניתן לאתרם מוקדמים לאחר 3 שעות של דגירה. תקופת דגירה לא צריכה להיות ארוכה יותר מ- 8 ש?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מודלים של בעלי חיים שונים תוארו בעשורים האחרונים לטיפול במאפייני פתולוגיים של הפרעות demyelinating דלקתיות כמו טרשת נפוצה. בvivo מודלים עכבר והחולדה נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקות את תכונות pathophysiological של המחלה, כלומר, ניתוח של ההשלכות של תהליכי demyelination וחידוש יצירת המיאלי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

This work was supported by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 to S.G.M. ME3283/2-1 to S.G.M.) and by Innovative Medizinische Forschung, Münster (I-BI111316, SB and SGM).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
12-Well plateCorning3513
2-MercaptoethanolGibco31350-010
2-MethylbutanRoth3927.1
70 µm strainerFalcon352350
CaCl2Merck1.02382.0500calcium chloride
CD8+-isolation kitMiltenyi Biotech130-090-859
D(+)-glucoseMerck1.08337.1000
DMEMGibco31966-021warm in 37 °C water bath before use
EDTASigmaE5134
FCSPAA LaboratoriesA15-151fetal calve serum
GentamicinGibco15750-060
HEPES 1 MGibco15630-050
IL-2Peprotech212-12
IsofluranAbbott05260-05
KClMerck1.04933.0500potassium chloride
KHCO3SigmaP9144potassium hydrogen carbonate
L-GlutamineGibco35050-038
MgSO4Merck1.05886.0500magnesium sulfate
NaClSigma31434sodium chloride
NaH2PO4 * H2OMerck1.06346.0500sodium hydrogen phosphate
NaHCO3Merck1.06329.0500sodium hydrogen carbonate
NaOHMerck1.09137.1000sodium hydroxide
NH4ClSigma213330ammonium chloride
Non essential amino acidGibco11140-050
OVA (257-264)GenscriptRP10611ovalbumin
PIPESSigmaP6757
SucroseMerck1.07687.1000
Tissue-Tek OCTSakura4583

References

  1. Moll, N. M., et al. Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences. Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).
  2. Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).
  3. Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).
  4. Babbe, H., et al. Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction. J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).
  5. Junker, A., et al. Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions. Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).
  6. Skulina, C., et al. Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).
  7. Friese, M. A., Fugger, L. Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy. Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).
  8. Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability). FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).
  9. Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis. J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).
  10. Hauser, S. L., et al. Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).
  11. Hoftberger, R., et al. Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions. Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).
  12. Göbel, K., et al. Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack. Glia. 58, 469-480 (2010).
  13. Melzer, N., et al. Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter. J Neuroinflammation. 10, 121(2013).
  14. Huseby, E. S., et al. A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis. J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).
  15. McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen. Glia. 53 (5), 457-466 (2006).
  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76 (1), 17-27 (1994).
  17. Cao, Y., et al. Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes. Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).
  18. Göbel, K., et al. CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level. J Neuroinflammation. 9, 41(2012).
  19. Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
  20. Meuth, S. G., et al. Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons. J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).
  21. Misgeld, U., Frotscher, M. Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply. Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).
  22. Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices. J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

96Vivoneuroinflammation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved