JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Аннотация

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of ‘‘collateral’’ neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

Введение

Death of oligodendrocytes and destruction of the myelin sheath accompanied by loss of neurons and axons are typical pathological findings in grey matter lesions in individuals suffering from multiple sclerosis (MS)1,2. Cortical lesions can be divided so far in three different subtypes2: subpial, intracortical and leukocortical lesions. In comparison to white matter plaques, infiltrates are characterized by a predominance of CD8+ T-cells, suggesting their possible decisive role in grey matter inflammation3. Furthermore, oligoclonal expansions in blood, cerebrospinal fluid (CSF) and within inflammatory lesions can be found for CD8+ T-cells themselves4-6.

In line with this, it is assumed that CD8+ T-cells may be specific for different myelin proteins7,8. Indeed, CD8+ T-cells are found near oligodendrocytes and myelin sheaths9,10 that show MHC I expression11 and might therefore be responsible for the loss of the myelin sheath. This process is often seen together with extensive ‘‘collateral’’ neuronal and axonal damage within the central nervous system (CNS) grey matter1,2. In fact, direct and indirect death of oligodendrocytes and neurons is induced by CD8+ T-cells via two different mechanism: (i) cell membrane swelling and rupture due to the formation of cytotoxic granules following the release of perforins and granzymes and (ii) ligation to the Fas receptors or exposition of FasL on their surface8,12,13.

Different types of animal models are established to study the underlying mechanism of the mentioned processes. In this respect, primed CD8+ T-cells specific for autoantigens with induced expression in CNS glial cells, like oligodendrocytes or astrocytes, can be adoptively transferred to analyse ‘‘collateral’’ neuronal and axonal death in grey matter subsequently14,15. To perform such in vivo experiments is a big help to mimic some pathophysiological aspects of MS, however, this approach is not suited to resolve the underlying mechanism and kinetics of axonal damage and neuronal apoptosis.

To overcome these restrictions, an ex vivo approach was established to study the mechanisms and time course of neuronal cell death following a oligondendrocytes-directed CD8+ T-cell attack. Since only oligodendrocytes and therefore myelin sheath production should be targeted by immune cells, MHC class-I-restricted, ovalbumin (OVA)-reactive OT-I Tcells are used16. These cells are subsequently transferred into brain slices obtained from mice selectively expressing OVA in oligodendrocytes (ODC-OVA mice)17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты на мышах должны быть выполнены в соответствии с руководящими принципами соответствующей институциональной уходу и использованию животных комитета.

1. Общие Комментарии к экспериментах на мышах

  1. Держите мышей под патогена условиях и позволяют им доступ к пище и воде вволю.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать возрасту и полу соответствием мышей в экспериментальных группах, потому что иммунологические образцы могут варьироваться в зависимости от возраста и пола.

2. Подготовка и активация OVA-специфических CD8 + Т-клетки (ОТ-я)

  1. Выполните стимуляции OT-я Т-клеток, как описано ниже 5 дней перед приготовлением кусочки мозга.
    Примечание: 5 х 10 5 активированного CD8 + эффекторные ОТ-I Т-клеток (CD8 + Т-клетки трансгенных мышей, распознающих только OVA 257-264 пептида в контексте молекул MHC-I) необходимы в срезе концентрации 5 х 10 5 был выбран экспериментсоюзника в оптимальной отдавать предпочтение хорошее взаимодействие клетка-клетка сразу, что клетки начинают мигрировать в часть и, в то же время, количество клеток не было слишком высоким, чтобы вызвать чрезмерную реакцию, позволяющую одной клетки подсчета 8,18.
  2. Подготовка среды для культивирования ОТ-I Т-клеток. Дополнение 500 мл DMEM с 5% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 10 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 1% заменимых аминокислот и 25 мкг / мл гентамицина. Хранить среду при 4 ° С до использования.
  3. Снимите селезенки OT-I трансгенных мышей, в ссылке 16. Передача их в подготовленную среду.
  4. Генерация суспензии отдельных клеток путем затирания селезенки через сито и центрифуги суспензии 70 мкм при 300 х г в течение 5 мин, 4 ° С.
  5. Инкубируйте клеточной суспензии 5 мл аммония-хлорида калия (ACK) буфера (150 мМ NH 4 Cl, 10 мМ КНСО 3, 0,1 мМ ЭДТА, рН 7,3) в течение 5 мин, чтобы лизировать красные кровяные клетки.
  6. Стоп incubatiна 10 мл среды и центрифуги его снова, как описано выше.
  7. Развести клеточной суспензии в среде и рассчитать число. Пластина клеток при плотности 3 × 10 7 клеток / лунку в 12-луночный планшет и простое их путем инкубации с OVA 257 - 264 (SIINFEKL; 1 нМ) и интерлейкин-2 (ИЛ-2) (500 МЕ / мл) в течение 5 дней.
  8. После 4 дней, добавить IL-2 в концентрации 500 МЕ / мл снова.
  9. После стимуляции, очистить OT-I T-клеток из клеточной суспензии с помощью отрицательного отбора, основанного мышь набор для выделения Т-клеток CD8 + в соответствии с инструкциями изготовителя. Очистка основана на истощение всех не CD8 + клеток с использованием коктейля антител против CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC класса II, трет-119, и TCRγ / δ, которые затем отбрасывают с использованием магнитных колонки для элюирования очищенных CD8 + Т-клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Критические шаги в этом процедуры, применяемыеRe обозначены производит: важно, что реакция включает в себя только отдельные клетки, поскольку присутствие комков может блокировать столбец в течение стадии элюирования; Подсчет клетки перед добавлением Byotin коктейль имеет важное значение для степени чистоты образца и процедура должна быть выполнена на льду, чтобы минимизировать неспецифических привязки антител.

3. Подготовка острой мозга ломтиками и сотрудничеству в культуре с OT-I Т-клеток

  1. До подготовки острого мозга ломтики 19, подготовить placedine ледяной физиологический раствор, используя 200 мМ сахарозы, 20 мм Трубы диаметром 2,5 мм KCl, 1,25 мМ NaH 2 PO 4, 10 мМ MgSO 4, 0,5 CaCl 2 и 10 мМ декстрозы и искусственный спинномозговой жидкости (ACSF) с помощью 125 мМ NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 24 мМ NaHCO 3, 2 мМ MgSO 4, 2 мМ CaCl 2, 10 мМ декстрозы. Отрегулируйте рН каждого раствора 7,35 по Усинг NaOH. Перед регулировкой рН ACSF, раствор должен быть барботируют смесью 95% O 2 и 5% CO 2.
  2. Pre-охлаждать решения.
  3. Обезболить 8 - 10 недель старых мышей (например, C57BL / 6 в качестве контроля или трансгенных ODC-OVA мышей 17 с помощью ингаляции 5,0% изофлуран, 5,0% галотана или инъекции 100 мг / кг кетамина и 10 мг / кг веса тела с помощью ксилазина IP Подождите для анестезии и использовать ОО щепотку для оценки уровня анестезии и обезглавить их сразу. Эвтаназии мышей, как в учреждениях для животных и использовать критерии Комитет по эвтаназии.
  4. Положите мышь в брюшной положении. Лечить и сократить кожу головы в сагиттальной. Откройте кости черепа сагиттально, извлечь мозг быстро с помощью совка и закрепить его на пластины vibratome с помощью клея.
  5. Заполните табличку с подготовленной placedine ледяной физиологическом растворе.
  6. Вырезать 300 мкм корональные срезы с vibratome.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура знаюп для получения жизнеспособных образцов интактной ткани, подходящие для функциональных клеточных исследований в течение периода времени, равного по меньшей мере 8 ч 19-21. Действительно, после этого периода времени, уже начиная после 6 часов, препарат показал снижение качества, а именно изменения в основных и функциональных свойств, таких как генерации потенциала действия и распространения.
  7. После секционирования, передавать один кусок непосредственно в каждую лунку 12-луночного планшета, заполненной ACSF.
  8. Добавить внимательно 5 х 10 5 OT-я Т-клеток в срезе.
  9. Инкубируйте ломтики в течение до 8 ч в инкубаторе (37 ° С, 5% СО 2).
  10. После инкубационного периода, урожай ломтиками и вставлять их с помощью октября соединение тканей-Tek и заморозить их в жидком азоте. Хранить их при температуре -20 ° С для дальнейших гистологических исследований в например, оценку нейрональной структуры (например, с использованием анти-MAPII или анти-антитела синаптофизина) или апоптоз (например, с использованием анти-каспазы-3 антитела и анти-анти NeuNорганы) в соответствии со стандартными процедурами.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

После инкубации срезов головного мозга с олигодендроцитов-направленный CD8 + Т-клеток, олигодендроциты, а также нейроны претерпевают апоптоз (2а и 1С, соответственно). Гистологические признаки апоптоза (например, ген каспазы-3, Tunel) могут быть обнаружены после ранней 3 ч ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Различные модели на животных были описаны в последние десятилетия для решения патологические особенности воспалительных заболеваний демиелинизирующих как MS. В естественных условиях мышей и крыс модели широко используются для выполнения патофизиологические особенности заболе...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors declare that they have no competing financial interests.

Благодарности

This work was supported by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 to S.G.M. ME3283/2-1 to S.G.M.) and by Innovative Medizinische Forschung, Münster (I-BI111316, SB and SGM).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
12-Well plateCorning3513
2-MercaptoethanolGibco31350-010
2-MethylbutanRoth3927.1
70 µm strainerFalcon352350
CaCl2Merck1.02382.0500calcium chloride
CD8+-isolation kitMiltenyi Biotech130-090-859
D(+)-glucoseMerck1.08337.1000
DMEMGibco31966-021warm in 37 °C water bath before use
EDTASigmaE5134
FCSPAA LaboratoriesA15-151fetal calve serum
GentamicinGibco15750-060
HEPES 1 MGibco15630-050
IL-2Peprotech212-12
IsofluranAbbott05260-05
KClMerck1.04933.0500potassium chloride
KHCO3SigmaP9144potassium hydrogen carbonate
L-GlutamineGibco35050-038
MgSO4Merck1.05886.0500magnesium sulfate
NaClSigma31434sodium chloride
NaH2PO4 * H2OMerck1.06346.0500sodium hydrogen phosphate
NaHCO3Merck1.06329.0500sodium hydrogen carbonate
NaOHMerck1.09137.1000sodium hydroxide
NH4ClSigma213330ammonium chloride
Non essential amino acidGibco11140-050
OVA (257-264)GenscriptRP10611ovalbumin
PIPESSigmaP6757
SucroseMerck1.07687.1000
Tissue-Tek OCTSakura4583

Ссылки

  1. Moll, N. M., et al. Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences. Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).
  2. Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).
  3. Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).
  4. Babbe, H., et al. Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction. J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).
  5. Junker, A., et al. Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions. Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).
  6. Skulina, C., et al. Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).
  7. Friese, M. A., Fugger, L. Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy. Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).
  8. Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability). FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).
  9. Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis. J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).
  10. Hauser, S. L., et al. Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).
  11. Hoftberger, R., et al. Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions. Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).
  12. Göbel, K., et al. Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack. Glia. 58, 469-480 (2010).
  13. Melzer, N., et al. Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter. J Neuroinflammation. 10, 121(2013).
  14. Huseby, E. S., et al. A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis. J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).
  15. McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen. Glia. 53 (5), 457-466 (2006).
  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76 (1), 17-27 (1994).
  17. Cao, Y., et al. Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes. Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).
  18. Göbel, K., et al. CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level. J Neuroinflammation. 9, 41(2012).
  19. Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
  20. Meuth, S. G., et al. Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons. J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).
  21. Misgeld, U., Frotscher, M. Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply. Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).
  22. Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices. J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

96

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены