Une<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modèle de T-Cell Attaque de Oligodendrocyte dirigée dans aigus tranches cérébrales

Résumé

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8⁺ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Résumé

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8⁺ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of ‘‘collateral’’ neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8⁺ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8⁺ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

Introduction

Death of oligodendrocytes and destruction of the myelin sheath accompanied by loss of neurons and axons are typical pathological findings in grey matter lesions in individuals suffering from multiple sclerosis (MS)^1,2. Cortical lesions can be divided so far in three different subtypes²: subpial, intracortical and leukocortical lesions. In comparison to white matter plaques, infiltrates are characterized by a predominance of CD8⁺ T-cells, suggesting their possible decisive role in grey matter inflammation³. Furthermore, oligoclonal expansions in blood, cerebrospinal fluid (CSF) and within inflammatory lesions can be found for CD8⁺ T-cells themselves^4-6.

In line with this, it is assumed that CD8⁺ T-cells may be specific for different myelin proteins^7,8. Indeed, CD8⁺ T-cells are found near oligodendrocytes and myelin sheaths^9,10 that show MHC I expression¹¹ and might therefore be responsible for the loss of the myelin sheath. This process is often seen together with extensive ‘‘collateral’’ neuronal and axonal damage within the central nervous system (CNS) grey matter^1,2. In fact, direct and indirect death of oligodendrocytes and neurons is induced by CD8⁺ T-cells via two different mechanism: (i) cell membrane swelling and rupture due to the formation of cytotoxic granules following the release of perforins and granzymes and (ii) ligation to the Fas receptors or exposition of FasL on their surface^8,12,13.

Different types of animal models are established to study the underlying mechanism of the mentioned processes. In this respect, primed CD8⁺ T-cells specific for autoantigens with induced expression in CNS glial cells, like oligodendrocytes or astrocytes, can be adoptively transferred to analyse ‘‘collateral’’ neuronal and axonal death in grey matter subsequently^14,15. To perform such in vivo experiments is a big help to mimic some pathophysiological aspects of MS, however, this approach is not suited to resolve the underlying mechanism and kinetics of axonal damage and neuronal apoptosis.

To overcome these restrictions, an ex vivo approach was established to study the mechanisms and time course of neuronal cell death following a oligondendrocytes-directed CD8⁺ T-cell attack. Since only oligodendrocytes and therefore myelin sheath production should be targeted by immune cells, MHC class-I-restricted, ovalbumin (OVA)-reactive OT-I Tcells are used¹⁶. These cells are subsequently transferred into brain slices obtained from mice selectively expressing OVA in oligodendrocytes (ODC-OVA mice)¹⁷.

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Protocole

Toutes les expériences utilisant des souris doivent être effectuées en conformité avec les directives du comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle respective.

1. Observations générales pour l'expérimentation de la souris

1. Gardez les souris dans des conditions exemptes d'agents pathogènes et de leur permettre l'accès à la nourriture et de l'eau ad libitum.
   NOTE: Il est important d'utiliser des souris d'âge et le sexe dans les groupes expérimentaux parce que les habitudes immunologiques peuvent varier avec l'âge et le sexe.

2. Préparation des cellules T et l'activation de OVA-spécifiques CD8 ⁺ (OT-I)

1. Effectuer la stimulation des cellules T OT-I comme décrit ci-dessous cinq jours avant de préparer des tranches de cerveau.
   NOTE: 5 x 10 ⁵ effectrices CD8 ⁺ activées OT-I des cellules T CD8 ⁺ (cellules T de souris transgéniques qui reconnaissent le peptide OVA seule _257-264 dans le contexte de molécules du CMH-I) sont nécessaires par tranche la concentration 5 x 10 ⁵ a été choisi expérienceallié comme optimale une à favoriser une bonne interaction cellule-cellule une fois que les cellules commencent à migrer dans la tranche et, en même temps, la quantité de cellules ne est pas trop élevée pour induire une réaction excessive permettant cellule unique comptant ^8,18.
2. Préparer le milieu de culture de cellules T OT-I. Supplément 500 ml de DMEM avec 5% de sérum de veau foetal (FCS), 10 mM d'HEPES, 2 mM de L-glutamine, 50 pM de 2-mercaptoéthanol, 1% acides aminés non essentiels et 25 ug / ml de gentamicine. Conserver le milieu à 4 ° C jusqu'à utilisation.
3. Retirer la rate de souris transgéniques OT-I par référence ^16. Les transférer dans le milieu préparé.
4. Générer suspension cellulaire unique en écrasant les rates à travers une passoire et centrifuger la suspension de 70 um à 300 g pendant 5 min, 4 ° C.
5. Incuber suspension de cellules avec 5 ml de chlorure d'ammonium-potassium (ACK) du tampon (150 mM de NH ₄ Cl, 10 mM KHCO _3, 0,1 mM d'EDTA, pH 7,3) pendant 5 minutes pour lyser les globules rouges.
6. Arrêtez incubatiavec un milieu de 10 ml et on centrifuge à nouveau comme décrit ci-dessus.
7. Diluer la suspension de cellules dans un milieu et calculer des nombres. cellules de la plaque à une densité de 3 x 10 ⁷ cellules / puits dans une plaque à 12 puits et on les premier par incubation avec de l'OVA _257-264 (SIINFEKL; 1 nM) et de l'interleukine 2 (IL-2) (500 UI / ml) pendant 5 jours.
8. Après 4 jours, ajouter l'IL-2 à une concentration de 500 UI / mL à nouveau.
9. Après stimulation, les cellules T purifier OT-I de la suspension de cellules à l'aide d'une sélection négative à base de souris CD8 ⁺ kit d'isolement des cellules T suivant les instructions du fabricant. La purification est basée sur l'épuisement de toutes les cellules CD8 ⁺ non en utilisant un cocktail d'anticorps contre CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, CMH de classe II, Ter-119, et TCRy / δ qui sont ensuite mis au rebut en utilisant des colonnes magnétiques pour l'élution des cellules T CD8 ⁺ purifiées.
   REMARQUE: Les étapes critiques dans ce procre sont indiqués par les constructeurs: il est important que la réaction ne implique que des cellules uniques, car la présence de touffes peut bloquer la colonne lors de l'étape d'élution; le comptage de la cellule avant l'addition du cocktail Byotin est important que le degré de pureté de l'échantillon et le test doit être réalisé sur de la glace pour minimiser les liaisons non spécifiques des anticorps.

3. Préparation des tranches de cerveau aiguë et co-culture avec des cellules T OT-I

1. Avant la préparation de cerveau aiguë tranches ^19, préparer une solution saline placedine glacée physiologique utilisant le saccharose 200 mM, 20 mM de PIPES, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM NaH ₂ PO _4, mM MgSO _4, 10 0,5 _CaCl2 et 10 mM de dextrose et le liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) en utilisant 125 mM de NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH ₂ PO _4, 24 mM de NaHCO _3, 2 mM de MgSO _4, 2 mM de _CaCl2, 10 mM de dextrose. Ajuster le pH de chaque solution à 7,35 par usinNaOH g. Avant d'ajuster le pH de l'ACSF, solution doit être fait barboter avec un mélange de 95% O ₂ et 5% de CO _2.
2. Pré-refroidir les solutions.
3. Anesthésier 8 - souris âgées 10 semaines (par exemple, C57BL / 6 que le contrôle ou transgénique ODC-OVA souris ¹⁷ à l'inhalation en utilisant 5,0% d'isoflurane, 5,0% d'halothane ou injecter 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine de poids corporel par ip Attendre pour l'anesthésie et utiliser une pincée d'orteil pour évaluer le niveau de l'anesthésie et décapiter à la fois. Euthanasier la souris selon protection des animaux et utiliser des critères du comité pour l'euthanasie.
4. Mettez la souris en position ventrale. Désinfecter et couper le cuir chevelu sagittalement. Ouvrez l'os crânien sagittal, retirez rapidement le cerveau à l'aide d'une pelle et le fixer sur la plaque d'un vibratome en utilisant de la colle.
5. Remplir la plaque avec la solution saline préparée placedine glacée physiologique.
6. Couper 300 um coupes coronales avec le vibratome.
   NOTE: Cette procédure est connuen pour obtenir des échantillons de tissus intacts viables appropriés pour des études fonctionnelles cellulaires dans un intervalle de temps d'au moins 8 h ^{19 à 21.} En effet, après cette période de temps, commence déjà après 6 h, la préparation montre la qualité réduite, à savoir la modification des propriétés de base et fonctionnelles comme action potentielle génération et la propagation.
7. Après la coupe, transférer une tranche immédiatement dans chaque puits d'une plaque de 12 puits rempli d'ACSF.
8. Ajouter soigneusement 5 x 10 ⁵ cellules T OT-I par tranche.
9. Incuber tranches jusqu'à 8 heures dans un incubateur (37 ° C, 5% CO _2).
10. Après la période d'incubation, les tranches de récolte et de les intégrer en utilisant octobre composé Tissue-Tek et les congeler dans l'azote liquide. Rangez-les à -20 ° C pour de plus amples études histologiques à par exemple, évaluer la structure neuronale (par exemple, en utilisant anti-MAPII ou des anticorps anti-synaptophysine) ou l'apoptose (par exemple, en utilisant des anti-caspase-3 et des anticorps anti-NeuN anti-corps) selon des procédures standard.

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Résultats

Après une incubation de coupes de cerveau avec des cellules T d'oligodendrocytes dirigée CD8 ^+, les oligodendrocytes ainsi que les neurones subissent une apoptose (figures 2A et 1C, respectivement). Signes histologiques de l'apoptose (par exemple, la caspase-3, Tunel) peuvent être détectés plus tôt après 3 heures d'incubation. La période d'incubation ne doit pas être plus long que 8 heures afin de garantir une bonne qualité de la préparation et des résulta...

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Discussion

Différents modèles animaux ont été décrits au cours des dernières décennies pour répondre aux caractéristiques pathologiques de troubles inflammatoires démyélinisantes comme MS. In vivo des modèles de souris et de rat sont largement utilisés pour imiter les caractéristiques physiopathologiques de la maladie, à savoir, l'analyse des conséquences des processus de démyélinisation et de remyélinisation et des épisodes entremêlées de l'inflammation et de la neurodégénérescence. Néan...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-Well plate	Corning	3513
2-Mercaptoethanol	Gibco	31350-010
2-Methylbutan	Roth	3927.1
70 µm strainer	Falcon	352350
CaCl2	Merck	1.02382.0500	calcium chloride
CD8+-isolation kit	Miltenyi Biotech	130-090-859
D(+)-glucose	Merck	1.08337.1000
DMEM	Gibco	31966-021	warm in 37 °C water bath before use
EDTA	Sigma	E5134
FCS	PAA Laboratories	A15-151	fetal calve serum
Gentamicin	Gibco	15750-060
HEPES 1 M	Gibco	15630-050
IL-2	Peprotech	212-12
Isofluran	Abbott	05260-05
KCl	Merck	1.04933.0500	potassium chloride
KHCO3	Sigma	P9144	potassium hydrogen carbonate
L-Glutamine	Gibco	35050-038
MgSO4	Merck	1.05886.0500	magnesium sulfate
NaCl	Sigma	31434	sodium chloride
NaH2PO4 * H2O	Merck	1.06346.0500	sodium hydrogen phosphate
NaHCO3	Merck	1.06329.0500	sodium hydrogen carbonate
NaOH	Merck	1.09137.1000	sodium hydroxide
NH4Cl	Sigma	213330	ammonium chloride
Non essential amino acid	Gibco	11140-050
OVA (257-264)	Genscript	RP10611	ovalbumin
PIPES	Sigma	P6757
Sucrose	Merck	1.07687.1000
Tissue-Tek OCT	Sakura	4583