Um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de um Ataque de T-Cell dirigiu-Oligodendrocyte em Agudos fatias de cérebro

Resumo

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8⁺ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Resumo

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8⁺ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of ‘‘collateral’’ neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8⁺ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8⁺ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

Introdução

Death of oligodendrocytes and destruction of the myelin sheath accompanied by loss of neurons and axons are typical pathological findings in grey matter lesions in individuals suffering from multiple sclerosis (MS)^1,2. Cortical lesions can be divided so far in three different subtypes²: subpial, intracortical and leukocortical lesions. In comparison to white matter plaques, infiltrates are characterized by a predominance of CD8⁺ T-cells, suggesting their possible decisive role in grey matter inflammation³. Furthermore, oligoclonal expansions in blood, cerebrospinal fluid (CSF) and within inflammatory lesions can be found for CD8⁺ T-cells themselves^4-6.

In line with this, it is assumed that CD8⁺ T-cells may be specific for different myelin proteins^7,8. Indeed, CD8⁺ T-cells are found near oligodendrocytes and myelin sheaths^9,10 that show MHC I expression¹¹ and might therefore be responsible for the loss of the myelin sheath. This process is often seen together with extensive ‘‘collateral’’ neuronal and axonal damage within the central nervous system (CNS) grey matter^1,2. In fact, direct and indirect death of oligodendrocytes and neurons is induced by CD8⁺ T-cells via two different mechanism: (i) cell membrane swelling and rupture due to the formation of cytotoxic granules following the release of perforins and granzymes and (ii) ligation to the Fas receptors or exposition of FasL on their surface^8,12,13.

Different types of animal models are established to study the underlying mechanism of the mentioned processes. In this respect, primed CD8⁺ T-cells specific for autoantigens with induced expression in CNS glial cells, like oligodendrocytes or astrocytes, can be adoptively transferred to analyse ‘‘collateral’’ neuronal and axonal death in grey matter subsequently^14,15. To perform such in vivo experiments is a big help to mimic some pathophysiological aspects of MS, however, this approach is not suited to resolve the underlying mechanism and kinetics of axonal damage and neuronal apoptosis.

To overcome these restrictions, an ex vivo approach was established to study the mechanisms and time course of neuronal cell death following a oligondendrocytes-directed CD8⁺ T-cell attack. Since only oligodendrocytes and therefore myelin sheath production should be targeted by immune cells, MHC class-I-restricted, ovalbumin (OVA)-reactive OT-I Tcells are used¹⁶. These cells are subsequently transferred into brain slices obtained from mice selectively expressing OVA in oligodendrocytes (ODC-OVA mice)¹⁷.

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Protocolo

Todos os experimentos com ratos deve ser realizado em conformidade com as orientações do respectivo comitê de cuidados com os animais e uso institucional.

1. Comentários gerais para mouse Experiments

1. Mantenha os ratos em condições livres de patógenos e permitir-lhes o acesso a comida e água ad libitum.
   NOTA: É importante o uso de ratos da mesma idade e sexo em grupos experimentais porque os padrões imunológicos podem variar de acordo com idade e sexo.

2. As células T específicas de OVA-preparação e activação de células CD8 ⁺ (OT-I)

1. Realize a estimulação das células T OT-I, conforme descrito abaixo cinco dias antes de preparar fatias de cérebro.
   NOTA: 5 x 10 ⁵ efectoras activadas CD8 ⁺ OT-I de células T (CD8 ⁺ T-células de ratinhos transgénicos que reconhecem apenas o peptídeo OVA _257-264, no contexto das moléculas MHC-I) são necessários por fatia Os concentração de 5 x 10 ⁵ foi escolhido experimentoaliado como uma óptima para favorecer uma interacção célula-célula boa uma vez que as células começam a migrar para o corte e, ao mesmo tempo, a quantidade de células não é demasiado elevada para induzir uma reacção excessiva permitindo que uma única célula contando ^8,18.
2. Preparar o meio para a cultura de células T OT-I. Suplemento 500 ml de DMEM com 5% de soro fetal de vitelo (FCS), 10 mM de HEPES, 2 mM de L-glutamina, 50 uM de 2-mercaptoetanol, 1% de aminoácidos não essenciais e 25 ug / ml de gentamicina. Armazenar o meio a 4 ° C até à sua utilização.
3. Retire o baço de OT-I camundongos transgênicos como por referência ^16. Transferi-los para o meio preparado.
4. Gerar suspensão de células individuais triturando os baços através de uma peneira de centrifugação e suspensão de 70 mm a 300 xg durante 5 min, 4 ° C.
5. Incubar suspensão de células com 5 ml de cloreto de amónio-potássio (ACK) de tampão (150 mM de _NH4Cl, 10 mM de _KHCO3, 0,1 mM de EDTA, pH 7,3) durante 5 minutos para lisar as células vermelhas do sangue.
6. Pare incubaticom 10 ml de meio e centrifuga-se novamente conforme descrito acima.
7. Diluir suspensão de células em médio e calcular números. As células em placas a uma densidade de 3 x 10 ⁷ células / poço numa placa de 12 poços e eles privilegiada por incubação com OVA _257-264 (SIINFEKL; 1 nM) e a interleucina 2 (IL-2) (500 UI / ml) durante 5 dias.
8. Após 4 dias, adicionar IL-2 a uma concentração de 500 UI / ml, novamente.
9. Após a estimulação, purificar as células T OT-I a partir de suspensão de células usando um mouse negativo seleção baseada kit de isolamento de células T CD8 ^+, seguindo as instruções do fabricante. A purificação é baseado na depleção de todas as células não-CD8 ^+, utilizando um cocktail de anticorpos contra CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC de Classe II, Ter-119, e TCRγ / δ que são então descartados utilizando colunas magnéticas para a eluição das células T CD8 ⁺ purificadas.
   NOTA: As etapas críticas neste procedure são indicados pelos fabricantes: é importante que a reacção envolve apenas as células individuais, pois a presença de aglomerados pode bloquear a coluna durante o passo de eluição; contagem da célula antes de adicionar o cocktail Byotin é importante para o grau de pureza da amostra e o procedimento deve ser realizado em gelo para minimizar vinculações anticorpos inespecíficos.

3. Preparação de fatias do cérebro do aguda e Co-cultura com células T OT-I

1. Antes da preparação de fatias cerebrais agudas ^19, preparar uma solução fisiológica gelada placedine salina utilizando 200 mM de sacarose, PIPES 20 mM, KCl 2,5 mM, 1,25 mM NaH ₂ PO _4, 10 mM de _MgSO4, dextrose 0,5 CaCl ₂ e 10 mM e fluido cerebrospinal artificial (ACSF), utilizando NaCl a 125 mM, KCl 2,5, 1,25 NaH ₂ PO _4, mM de NaHCO ₃ 24, 2 mM _MgSO4, 2 mM de _CaCl2, 10 mM de dextrose. Ajustar o pH de cada solução a 7,35 por using de NaOH. Antes de ajustar o pH da ACSF, solução deve ser borbulhado com uma mistura de 95% _{de O2} e 5% de CO _2.
2. Pré-resfriar as soluções.
3. Anestesiar 8 - camundongo de 10 semanas de idade (por exemplo, C57BL / 6 como controlo ou ratinhos transgénicos ODC ^OVA-17 com a inalação usando 5,0% de isoflurano, 5,0% de halotano ou injectar 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de peso corporal de xilazina via ip Espera para anestesia e usar uma pitada de igual para avaliar o nível de anestesia e decapitá-los de uma só vez. Euthanize os ratos como por cuidados com os animais institucional e utilizar critérios da comissão para a eutanásia.
4. Coloque o mouse em posição ventral. Desinfetar e corte sagital couro cabeludo. Abra o osso craniano sagitalmente, retire o cérebro rapidamente com a ajuda de uma colher e corrigi-lo sobre a placa de um vibratome usando cola.
5. Encher o prato com a solução salina preparada placedine gelada fisiológico.
6. Corte 300 mm cortes coronais com o vibratome.
   NOTA: Este procedimento é sabern, para se obter amostras de tecido intactas viáveis ​​adequados para estudos celulares funcionais dentro de um intervalo de tempo de pelo menos 8 h ^19-21. De fato, após este período de tempo, já começando após 6 horas, a preparação mostra qualidade reduzida, ou seja, mudanças nas propriedades básicas e funcionais, como ação potencial de geração e propagação.
7. Após a secção, transferir uma fatia imediatamente em cada poço de uma placa de 12 poços preenchidos com ACSF.
8. Adicione cuidadosamente 5 x 10 ⁵ células OT-I T por fatia.
9. Incubar fatias de até 8 horas, numa incubadora (37 ° C, 5% CO _2).
10. Após o período de incubação, as fatias de colheita e de incorporá-los usando outubro composto tecido-tek e congelá-los em nitrogênio líquido. Armazená-las a -20 ° C durante mais estudos histológicos para, por exemplo, avaliar a estrutura neuronal (por exemplo, utilizando anticorpo anti-MAPII ou anticorpos anti-sinaptofisina) ou apoptose (por exemplo, utilizando caspase 3 anti-anti-anticorpos e de anti-NeuNorganismos) de acordo com procedimentos padrão.

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Resultados

Após a incubação de fatias de cérebro com as células T CD8 dirigida-oligodendrócitos ^+, oligodendrócitos, bem como neurónios, sofrem apoptose (Figuras 2A e 1C, respectivamente). Sinais histológicos de apoptose (por exemplo, caspase-3, Tunel) pode ser mais antigo detectado após 3 horas de incubação. O período de incubação não deve ser maior do que 8 horas, a fim de garantir uma boa qualidade da preparação e reprodutibilidade dos resultados. Células em apoptose pode ...

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Discussão

Diferentes modelos animais foram descritos nas últimas décadas para abordar as características patológicas de doenças desmielinizantes inflamatórias como MS. Modelos in vivo em ratinhos e ratos são amplamente utilizados para imitar aspectos fisiopatológicos da doença, ou seja, a análise das consequências de processos de desmielinização e remielinização e de episódios de permeio de inflamação e neurodegeneração. No entanto, só uma abordagem ex vivo permite dissecar os mecanismos exa...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-Well plate	Corning	3513
2-Mercaptoethanol	Gibco	31350-010
2-Methylbutan	Roth	3927.1
70 µm strainer	Falcon	352350
CaCl2	Merck	1.02382.0500	calcium chloride
CD8+-isolation kit	Miltenyi Biotech	130-090-859
D(+)-glucose	Merck	1.08337.1000
DMEM	Gibco	31966-021	warm in 37 °C water bath before use
EDTA	Sigma	E5134
FCS	PAA Laboratories	A15-151	fetal calve serum
Gentamicin	Gibco	15750-060
HEPES 1 M	Gibco	15630-050
IL-2	Peprotech	212-12
Isofluran	Abbott	05260-05
KCl	Merck	1.04933.0500	potassium chloride
KHCO3	Sigma	P9144	potassium hydrogen carbonate
L-Glutamine	Gibco	35050-038
MgSO4	Merck	1.05886.0500	magnesium sulfate
NaCl	Sigma	31434	sodium chloride
NaH2PO4 * H2O	Merck	1.06346.0500	sodium hydrogen phosphate
NaHCO3	Merck	1.06329.0500	sodium hydrogen carbonate
NaOH	Merck	1.09137.1000	sodium hydroxide
NH4Cl	Sigma	213330	ammonium chloride
Non essential amino acid	Gibco	11140-050
OVA (257-264)	Genscript	RP10611	ovalbumin
PIPES	Sigma	P6757
Sucrose	Merck	1.07687.1000
Tissue-Tek OCT	Sakura	4583