Una<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de un ataque de células T Oligodendrocyte dirigida en Rebanadas cerebral agudo

Resumen

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8⁺ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Resumen

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8⁺ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of ‘‘collateral’’ neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8⁺ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8⁺ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

Introducción

Death of oligodendrocytes and destruction of the myelin sheath accompanied by loss of neurons and axons are typical pathological findings in grey matter lesions in individuals suffering from multiple sclerosis (MS)^1,2. Cortical lesions can be divided so far in three different subtypes²: subpial, intracortical and leukocortical lesions. In comparison to white matter plaques, infiltrates are characterized by a predominance of CD8⁺ T-cells, suggesting their possible decisive role in grey matter inflammation³. Furthermore, oligoclonal expansions in blood, cerebrospinal fluid (CSF) and within inflammatory lesions can be found for CD8⁺ T-cells themselves^4-6.

In line with this, it is assumed that CD8⁺ T-cells may be specific for different myelin proteins^7,8. Indeed, CD8⁺ T-cells are found near oligodendrocytes and myelin sheaths^9,10 that show MHC I expression¹¹ and might therefore be responsible for the loss of the myelin sheath. This process is often seen together with extensive ‘‘collateral’’ neuronal and axonal damage within the central nervous system (CNS) grey matter^1,2. In fact, direct and indirect death of oligodendrocytes and neurons is induced by CD8⁺ T-cells via two different mechanism: (i) cell membrane swelling and rupture due to the formation of cytotoxic granules following the release of perforins and granzymes and (ii) ligation to the Fas receptors or exposition of FasL on their surface^8,12,13.

Different types of animal models are established to study the underlying mechanism of the mentioned processes. In this respect, primed CD8⁺ T-cells specific for autoantigens with induced expression in CNS glial cells, like oligodendrocytes or astrocytes, can be adoptively transferred to analyse ‘‘collateral’’ neuronal and axonal death in grey matter subsequently^14,15. To perform such in vivo experiments is a big help to mimic some pathophysiological aspects of MS, however, this approach is not suited to resolve the underlying mechanism and kinetics of axonal damage and neuronal apoptosis.

To overcome these restrictions, an ex vivo approach was established to study the mechanisms and time course of neuronal cell death following a oligondendrocytes-directed CD8⁺ T-cell attack. Since only oligodendrocytes and therefore myelin sheath production should be targeted by immune cells, MHC class-I-restricted, ovalbumin (OVA)-reactive OT-I Tcells are used¹⁶. These cells are subsequently transferred into brain slices obtained from mice selectively expressing OVA in oligodendrocytes (ODC-OVA mice)¹⁷.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos los experimentos con ratones se deben realizar de acuerdo con las directrices del respectivo comité de cuidado de los animales y el uso institucional.

1. Comentarios generales para experimentos con ratones

1. Mantenga los ratones en condiciones libres de patógenos y les permitirá el acceso a alimentos y agua ad libitum.
   NOTA: Es importante la utilización de ratones por edad y sexo en los grupos experimentales porque los patrones inmunológicos pueden variar con la edad y el género.

2. Las células T específicas de OVA Preparación y activación de CD8 ⁺ (OT-I)

1. Realice la estimulación de las células T OT-I como se describe a continuación 5 días antes de la preparación de cortes de cerebro.
   NOTA: 5 x 10 ⁵ efectoras CD8 ⁺ activadas OT-I células T (células T CD8 ⁺ de ratones transgénicos que reconocen sólo el OVA _257-264 péptido en el contexto de moléculas MHC-I) se necesitan por rebanada La concentración 5 x 10 ⁵ fue elegido experimentoaliado como uno óptima para favorecer una buena interacción célula-célula una vez que las células comienzan a migrar a la rebanada y, al mismo tiempo, la cantidad de células no es demasiado alta para inducir una reacción exagerada de una sola célula lo que permite contar ^8,18.
2. Preparar el medio para el cultivo de células T OT-I. Suplemento 500 ml de DMEM con 5% de suero de ternera fetal (FCS), 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamina, 50 micras 2-mercaptoetanol, 1% de aminoácidos no esenciales y 25 mg / ml de gentamicina. Almacenar el medio a 4 ° C hasta su uso.
3. Retirar el bazo de OT-I ratones transgénicos como por referencia ^16. Transferirlos al medio preparado.
4. Generar suspensión de células individuales por maceración bazos a través de un filtro de 70 micras y se centrifuga la suspensión a 300 xg durante 5 min, 4 ° C.
5. Incubar suspensión de células con 5 ml de amonio-cloruro de potasio (ACK) tampón (150 mM NH ₄ Cl, 10 mM _KHCO3, EDTA 0,1 mM, pH 7,3) durante 5 min para lisar las células rojas de la sangre.
6. Deje de incubatien 10 ml con medio y se centrifuga de nuevo como se describió anteriormente.
7. Diluir la suspensión celular en medio y calcular números. Células de la placa a una densidad de 3 x 10 ⁷ células / pocillo en una placa de 12 pocillos y se les prime por incubación con OVA _257-264 (SIINFEKL; 1 nM) y la interleucina 2 (IL-2) (500 UI / ml) durante 5 días.
8. Después de 4 días, añadir IL-2 a una concentración de 500 UI / mL de nuevo.
9. Después de la estimulación, purificar OT-I células T de suspensión celular mediante el uso de un ratón basado selección negativa kit de aislamiento de células T CD8 ^+, siguiendo las instrucciones del fabricante. La purificación se basa en el agotamiento de todas las células no-CD8 ⁺ mediante el uso de un cóctel de anticuerpos contra CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC Clase II, Ter-119, y TCRγ / δ que luego son desechados por el uso de columnas magnéticas para la elución de las células T CD8 ⁺ purificados.
   NOTA: Los pasos críticos en este procedire se indican por los fabricantes: es importante que la reacción implica sólo células individuales debido a la presencia de grupos podría bloquear la columna durante la etapa de elución; contando de la celda antes de añadir el cóctel Byotin es importante para el grado de pureza de la muestra y el procedimiento se debe realizar en hielo para minimizar los enlaces de anticuerpos no específicos.

3. Preparación de rodajas de cerebro agudo y co-cultivo con células T OT-I

1. Antes de la preparación de cerebral aguda rebana ^19, preparar la solución salina placedine fisiológica enfriada con hielo usando sacarosa 200 mM, tubos de 20 mm, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de dextrosa NaH ₂ PO _4, 10 mM MgSO _4, 0.5 CaCl ₂ y 10 mM y el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) utilizando NaCl 125 mM, 2,5 KCl, 1,25 NaH ₂ PO _4, 24 mM NaHCO _3, 2 mM MgSO _4, 2 mM CaCl _2, 10 mM de dextrosa. Ajuste el pH de cada solución a 7,35 por using NaOH. Antes de ajustar el pH de ACSF, solución debe burbujeó con una mezcla de 95% O ₂ y 5% de CO _2.
2. Pre-enfriar las soluciones.
3. Anestesie 8 - 10 semanas de edad ratones (por ejemplo, ratones C57BL / 6 como control o ratones transgénicos ODC-OVA ¹⁷ con la inhalación usando 5,0% de isoflurano, 5,0% de halotano o inyectar 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de peso corporal a través de xilazina ip Espere para la anestesia y utilizar una pizca dedo del pie para evaluar el nivel de anestesia y decapitar a la vez. La eutanasia a los ratones como por el cuidado de animales institucional y utilizar criterios del comité para la eutanasia.
4. Ponga el ratón en posición ventral. Desinfectar y cortar el cuero cabelludo sagital. Abra el hueso craneal sagital, retire el cerebro rápidamente con la ayuda de una cuchara y fijarlo en el plato de un vibratome utilizando pegamento.
5. Llene la placa con la solución salina preparada placedine enfriado con hielo fisiológica.
6. Cortar 300 micras cortes coronales con la vibratome.
   NOTA: Este procedimiento se conocen para producir muestras de tejido intactas viables adecuados para estudios celulares funcionales dentro de un intervalo de tiempo de al menos 8 hr ^19-21. En efecto, después de este período de tiempo, ya partir después de las 6 horas, la preparación muestra una menor calidad, es decir, cambios en las propiedades básicas y funcionales como la acción potencial de generación y propagación.
7. Después de seccionar, transferir una rebanada de inmediato en cada pocillo de una placa de 12 pocillos lleno de ACSF.
8. Añadir con cuidado 5 x 10 ⁵ células OT-I T por rebanada.
9. Incubar las rebanadas para un máximo de 8 horas en una incubadora (37 ° C, 5% de CO _2).
10. Después del período de incubación, las rebanadas de cosecha e integrarlos mediante OCT compuesto tejido-tek y congelarlos en nitrógeno líquido. Almacenar a -20 ° C para otros estudios histológicos a por ejemplo, evaluar la estructura neuronal (por ejemplo, usando anti-MAPII o anticuerpos anti-sinaptofisina) o apoptosis (por ejemplo, utilizando anti caspasa-3-anticuerpos y anti-NeuN contracuerpos) de acuerdo con procedimientos estándar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Después de la incubación de secciones de cerebro con células T de oligodendrocitos dirigida CD8 ^+, oligodendrocitos, así como las neuronas sufren apoptosis (Figuras 2A y 1C, respectivamente). Signos histológicos de la apoptosis (por ejemplo, la caspasa-3, Tunel) pueden ser detectados más temprano después de 3 horas de incubación. El período de incubación no debe ser de más de 8 horas con el fin de garantizar una buena calidad de la preparación y resultados reproducibles. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

Diferentes modelos animales se han descrito en las últimas décadas para abordar las características patológicas de trastornos desmielinizantes inflamatorias como la esclerosis múltiple. En vivo modelos de ratón y de rata son ampliamente utilizados para imitar las características fisiopatológicas de la enfermedad, es decir, el análisis de las consecuencias de los procesos de desmielinización y remielinización y de episodios entremezcladas de inflamación y neurodegeneración. Sin embargo, sólo un enf...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-Well plate	Corning	3513
2-Mercaptoethanol	Gibco	31350-010
2-Methylbutan	Roth	3927.1
70 µm strainer	Falcon	352350
CaCl2	Merck	1.02382.0500	calcium chloride
CD8+-isolation kit	Miltenyi Biotech	130-090-859
D(+)-glucose	Merck	1.08337.1000
DMEM	Gibco	31966-021	warm in 37 °C water bath before use
EDTA	Sigma	E5134
FCS	PAA Laboratories	A15-151	fetal calve serum
Gentamicin	Gibco	15750-060
HEPES 1 M	Gibco	15630-050
IL-2	Peprotech	212-12
Isofluran	Abbott	05260-05
KCl	Merck	1.04933.0500	potassium chloride
KHCO3	Sigma	P9144	potassium hydrogen carbonate
L-Glutamine	Gibco	35050-038
MgSO4	Merck	1.05886.0500	magnesium sulfate
NaCl	Sigma	31434	sodium chloride
NaH2PO4 * H2O	Merck	1.06346.0500	sodium hydrogen phosphate
NaHCO3	Merck	1.06329.0500	sodium hydrogen carbonate
NaOH	Merck	1.09137.1000	sodium hydroxide
NH4Cl	Sigma	213330	ammonium chloride
Non essential amino acid	Gibco	11140-050
OVA (257-264)	Genscript	RP10611	ovalbumin
PIPES	Sigma	P6757
Sucrose	Merck	1.07687.1000
Tissue-Tek OCT	Sakura	4583