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要約

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

要約

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of ‘‘collateral’’ neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

概要

Death of oligodendrocytes and destruction of the myelin sheath accompanied by loss of neurons and axons are typical pathological findings in grey matter lesions in individuals suffering from multiple sclerosis (MS)1,2. Cortical lesions can be divided so far in three different subtypes2: subpial, intracortical and leukocortical lesions. In comparison to white matter plaques, infiltrates are characterized by a predominance of CD8+ T-cells, suggesting their possible decisive role in grey matter inflammation3. Furthermore, oligoclonal expansions in blood, cerebrospinal fluid (CSF) and within inflammatory lesions can be found for CD8+ T-cells themselves4-6.

In line with this, it is assumed that CD8+ T-cells may be specific for different myelin proteins7,8. Indeed, CD8+ T-cells are found near oligodendrocytes and myelin sheaths9,10 that show MHC I expression11 and might therefore be responsible for the loss of the myelin sheath. This process is often seen together with extensive ‘‘collateral’’ neuronal and axonal damage within the central nervous system (CNS) grey matter1,2. In fact, direct and indirect death of oligodendrocytes and neurons is induced by CD8+ T-cells via two different mechanism: (i) cell membrane swelling and rupture due to the formation of cytotoxic granules following the release of perforins and granzymes and (ii) ligation to the Fas receptors or exposition of FasL on their surface8,12,13.

Different types of animal models are established to study the underlying mechanism of the mentioned processes. In this respect, primed CD8+ T-cells specific for autoantigens with induced expression in CNS glial cells, like oligodendrocytes or astrocytes, can be adoptively transferred to analyse ‘‘collateral’’ neuronal and axonal death in grey matter subsequently14,15. To perform such in vivo experiments is a big help to mimic some pathophysiological aspects of MS, however, this approach is not suited to resolve the underlying mechanism and kinetics of axonal damage and neuronal apoptosis.

To overcome these restrictions, an ex vivo approach was established to study the mechanisms and time course of neuronal cell death following a oligondendrocytes-directed CD8+ T-cell attack. Since only oligodendrocytes and therefore myelin sheath production should be targeted by immune cells, MHC class-I-restricted, ovalbumin (OVA)-reactive OT-I Tcells are used16. These cells are subsequently transferred into brain slices obtained from mice selectively expressing OVA in oligodendrocytes (ODC-OVA mice)17.

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プロトコル

マウスを用いた実験はすべて、それぞれの機関の動物管理使用委員会のガイドラインに従って行われるべきである。

マウスの実験のために1。一般的なコメント

  1. 病原体を含まない条件下でマウスを維持し、それらに食物と水を自由にアクセスできるようにする。
    注：免疫学的パターンは、年齢や性別に応じて変化することができますので、それは実験群における年齢および性別をマッチさせたマウスを使用することが重要です。

2. OVA特異的CD8 + T細胞（OT-I）の調製及び活性化

  1. 脳スライスを準備する前に、5日以下に説明するようにOT-I T細胞の刺激を実行します。
    注：5×10 5活性化エフェクターCD8 + OT-I T細胞（CD8 + T細胞はMHC-I分子の状況においてのみOVA 257-264ペプチドを認識するトランスジェニックマウス）は、スライス毎に必要とされる濃度5× 10 図5は、実験を選ばれました細胞は、同時に、スライスに移行し始めていることをいったん良好な細胞-細胞相互作用を有利にするために最適なものとして味方は、細胞の量は、単一の細胞が8,18をカウントできるように過剰反応を誘発するために高すぎない。
  2. OT-I T細胞を培養するための培地を準備します。 、5％ウシ胎仔血清（FCS）、10mMのHEPES、2mMのL-グルタミン、50μM2-メルカプトエタノール、1％非必須アミノ酸および25μg/ mlのゲンタマイシンを500mlのDMEMを補う。使用するまで4℃でメディアを保管してください。
  3. 参照16に従ってOT-Iトランスジェニックマウスの脾臓を削除します。準備中にそれらを転送します。
  4. 5分、4℃、300×gで70μmのストレーナーと遠心サスペンションを通じて脾臓をすりつぶすことによって、単一細胞懸濁液を生成します。
  5. 赤血球を溶解するために5分間、5ミリリットル塩化アンモニウム-カリウム（ACK）緩衝液（150mMのNH 4 Clを、10mMのKHCO 3、0.1mMのEDTA、pH7.3）中で細胞懸濁液をインキュベートする。
  6. incubati停止再度の10ml培地遠心分離機を持つに上記のように。
  7. 培地中で細胞懸濁液を希釈し、数値を計算する。プレート3×10 7細胞の密度で細胞/ウェルで12ウェルプレートプライムそれらインキュベーションによるOVA 257 - 264（SIINFEKL; 1nMの）およびインターロイキン2（IL-2）（500 IU / ml）のための5日。
  8. 4日後、500 IU / mlの濃度で再度のIL-2を追加する。
  9. 刺激に続いて、製造者の指示に従って負の選択ベースのマウスCD8 + T細胞単離キットを使用して、細胞懸濁液からのOT-I T細胞を精製する。精製は、CD4、のCD11b、CD11cの、CD19、CD45R（B220）、CD49b（DX5）、CD105、MHCクラスII、テル-119、およびTCRγに対する抗体のカクテルを使用して、すべての非CD8 +細胞の枯渇に基づいています/δその後、精製CD8 + T細胞の溶出に磁気カラムを使用して、破棄される。
    注：この。手順で重要なステップREが製造してによって示されている：それは塊の存在は、溶出ステップの間に列をブロックする可能性があるため、反応は、単一の細胞が関与することが重要です。サンプルおよび手順の純度は非特異的抗体バインディングを最小限に抑えるために氷上で行われるべきであるためにByotinカクテルを添加する前に細胞をカウントすることが重要である。

OT-I T細胞急性脳スライスとの共培養の調製

  1. 急性脳スライス19の製造の前に、200mMのスクロースを用いplacedine氷冷生理食塩水を調製し、20mMのPIPES、2.5mMのKCL、1.25ミリモルのNaH 2 PO 4、10mMのMgSO 4を、0.5のCaCl 2及び10mMデキストロースそして人工脳脊髄液（ACSF）125のNaCl、2.5のKClを使用して1.25のNaH 2 PO 4、24mMのNaHCO 3を、2mMのMgSO 4を、10mMのデキストロース2のCaCl 2、。使うによって7.35に各溶液のpHを調整するgのNaOHを。 ACSFのpHを調整する前に、溶液を、95％O 2および5％CO 2の混合物でバブリングされなければならない。
  2. 解決策を事前に冷却する。
  3. 8麻酔- （10週齢のマウスを、例えば、のC57Bl 5.0％イソフルラン、5.0％ハロタンまたは待ち ​​腹腔内を介して100mg / kgのケタミンおよび10mg / kg体重のキシラジンを注入を使用してコントロールまたは吸入トランスジェニックODC-OVAマウス17のような/ 6麻酔のための麻酔のレベルを評価し、一度にそれらを斬首するためにつま先のピンチを使用しています。制度的動物のケアに従ってマウスを安楽死させると安楽死のための委員会の基準を使用。
  4. 腹の位置にマウスを置く。駆除と矢状頭皮をカット。 、矢状頭蓋骨を開き、スクープの助けを借りてすぐに脳を除去し、接着剤を使用してビブラトームの板の上にそれを修正。
  5. 準備placedine氷冷生理食塩水でプレートを埋める。
  6. ビブラトームで300μmの冠状切片をカットします。
    注：この手順は、知られているnは、少なくとも8時間19-21の時間間隔内で機能的な細胞研究のための適切な実行可能な無傷の組織標本を得た。この期間の後、すでに6時間後に開始し、準備は品質の低下を示している事実、すなわち、活動電位発生と伝播などの基本的および機能的特性が変化する。
  7. 切片化した後、ACSFで満たされた12ウェルプレートの各ウェルに直ちにつのスライスを転送する。
  8. スライスごとに慎重に5×10 5 OT-I T細胞を追加します。
  9. インキュベーター（37℃、5％CO 2）中で、最大8時間スライスをインキュベートする。
  10. インキュベーション期間の後、収穫スライスおよびOCT化合組織-tekのを使用してそれらを埋め込み、液体窒素中でそれらを凍結する。 例えばへの更なる組織学的研究のために-20℃で保管してください（抗MAPIIまたは抗シナプトフィジン抗体を使用するなど、）ニューロンの構造を評価するか、アポトーシス（ 例えば、抗カスパーゼ3抗体を使用し、抗NeuNの抗体）を、標準的な手順に従って。

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結果

オリゴデンドロサイト特異的CD8 + T細胞による脳切片をインキュベートした後、希突起膠細胞、ならびに神経細胞（それぞれ図2Aおよび図1C）、アポトーシスを受ける。アポトーシス（ 例えば、カスパーゼ-3、TUNEL）の組織学的徴候が早いインキュベーションの3時間後に検出することができる。潜伏期間は準備と再現性のある結果の良い品質を保証するために、8時間...

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ディスカッション

別の動物モデルは、MSのような炎症性脱髄性疾患の病理学的特徴に対処するために、最後の数十年にわたって記載されている。 インビボでのマウス及びラットモデルは広く疾患の病態生理学的特徴を模倣するために使用される、すなわち、脱髄及び髄鞘再形成のプロセスの結果の分析炎症および神経変性の混在エピソードの。それにもかかわらず、唯一のex vivoでのアプローチは...

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開示事項

The authors declare that they have no competing financial interests.

謝辞

This work was supported by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 to S.G.M. ME3283/2-1 to S.G.M.) and by Innovative Medizinische Forschung, Münster (I-BI111316, SB and SGM).

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
12-Well plateCorning3513
2-MercaptoethanolGibco31350-010
2-MethylbutanRoth3927.1
70 µm strainerFalcon352350
CaCl2Merck1.02382.0500calcium chloride
CD8+-isolation kitMiltenyi Biotech130-090-859
D(+)-glucoseMerck1.08337.1000
DMEMGibco31966-021warm in 37 °C water bath before use
EDTASigmaE5134
FCSPAA LaboratoriesA15-151fetal calve serum
GentamicinGibco15750-060
HEPES 1 MGibco15630-050
IL-2Peprotech212-12
IsofluranAbbott05260-05
KClMerck1.04933.0500potassium chloride
KHCO3SigmaP9144potassium hydrogen carbonate
L-GlutamineGibco35050-038
MgSO4Merck1.05886.0500magnesium sulfate
NaClSigma31434sodium chloride
NaH2PO4 * H2OMerck1.06346.0500sodium hydrogen phosphate
NaHCO3Merck1.06329.0500sodium hydrogen carbonate
NaOHMerck1.09137.1000sodium hydroxide
NH4ClSigma213330ammonium chloride
Non essential amino acidGibco11140-050
OVA (257-264)GenscriptRP10611ovalbumin
PIPESSigmaP6757
SucroseMerck1.07687.1000
Tissue-Tek OCTSakura4583

参考文献

  1. Moll, N. M., et al. Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences. Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).
  2. Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).
  3. Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).
  4. Babbe, H., et al. Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction. J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).
  5. Junker, A., et al. Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions. Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).
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  8. Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability). FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).
  9. Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis. J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).
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  11. Hoftberger, R., et al. Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions. Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).
  12. Göbel, K., et al. Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack. Glia. 58, 469-480 (2010).
  13. Melzer, N., et al. Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter. J Neuroinflammation. 10, 121(2013).
  14. Huseby, E. S., et al. A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis. J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).
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  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76 (1), 17-27 (1994).
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  18. Göbel, K., et al. CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level. J Neuroinflammation. 9, 41(2012).
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  20. Meuth, S. G., et al. Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons. J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).
  21. Misgeld, U., Frotscher, M. Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply. Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).
  22. Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices. J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).

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