Phenotyping ماوس الرئوي وظيفة<em&gt; في فيفو</em&gt; مع قدرة الرئة نشرها

Summary

We describe a means to quickly and simply measure the lung diffusing capacity in mice and show that it is sufficiently sensitive to phenotype changes in multiple common lung pathologies. This metric thus brings direct translational relevance to the mouse models, since diffusing capacity is also easily measured in humans.

Abstract

الفأر هو الآن الحيوان الأولية المستخدمة في تصميم نموذج لمجموعة متنوعة من أمراض الرئة. لدراسة الآليات التي تكمن وراء مثل هذه الأمراض، وهناك حاجة إلى أساليب المظهرية التي يمكن قياس تغيرات مرضية. وعلاوة على ذلك، لتوفير صلة متعدية إلى نماذج الماوس، وينبغي أن تكون هذه القياسات الاختبارات التي يمكن بسهولة أن يتم ذلك في كل من البشر والفئران. لسوء الحظ، في الأدب الحالي القليلة القياسات المظهرية وظائف الرئة لدى التطبيق المباشر للبشر. الاستثناء الوحيد هو القدرة نشرها لأول أكسيد الكربون، وهو القياس الذي يتم بشكل روتيني في البشر. في هذا التقرير، وصفنا وسيلة بسرعة وببساطة لقياس هذه القدرة نشرها في الفئران. ويشمل الإجراء التضخم الرئة وجيزة مع الغازات التتبع في الماوس تخدير، تليها 1 دقيقة وقت تحليل الغاز. لقد اختبرنا قدرة هذه الطريقة للكشف عن عدة أمراض الرئة، بما في ذلك انتفاخ الرئة والتليف، إصابة الرئة الحادة، والإنفلونزا، والتهابات الرئة الفطرية، فضلا عن رصد نضوج الرئة في الجراء الصغار. أظهرت النتائج انخفاض كبير في جميع أمراض الرئة، وكذلك زيادة في القدرة نشرها مع نضوج الرئة. هذا القياس من الرئة نشرها قدرة بالتالي يوفر اختبار وظيفة الرئة التي لديها تطبيق واسع النطاق مع قدرتها على اكتشاف التغيرات الهيكلية المظهرية مع معظم النماذج الرئة المرضية الموجودة.

Introduction

الفأر هو الآن الحيوان الأولية المستخدمة في تصميم نموذج لمجموعة متنوعة من أمراض الرئة. لدراسة آليات تشكل أساس هذه الأمراض، وهناك حاجة إلى أساليب المظهرية التي يمكن قياس ذلك التغيرات المرضية. على الرغم من أن هناك العديد من الدراسات الماوس حيث يتم قياس الميكانيكا والتهوية، وهذه القياسات هي عموما لا علاقة لها التقييمات القياسية من وظائف الرئة يتم عادة في الجسم البشري. وهذا أمر مؤسف، لأن القدرة على أداء قياسات تعادل في الفئران والموضوعات الإنسان قد تسهيل ترجمة نتائج في نماذج الماوس إلى الأمراض التي تصيب البشر.

واحدة من القياسات الأكثر شيوعا وأدلى بسهولة في المواد البشرية هو القدرة نشرها لأول أكسيد الكربون (DLCO) ^1،2، ولكن نادرا ما تم القيام به هذا القياس في نماذج الماوس. في تلك الدراسات حيث أفيد ^3-7، لم تكن هناك أي دراسات المتابعة، وذلك جزئيا بسبب الإجراءات غالبا ما تكون مرهقة أو مساuire المعدات المعقدة. وثمة نهج آخر هو استخدام طريقة CO إعادة التنفس في نظام الدولة مطرد، والتي لديها ميزة كونها قادرة على قياس CO نشر في الفئران واعية. ولكن هذا الأسلوب هو مرهقة جدا، والنتائج يمكن أن تختلف مع مستوى التهوية الماوس، وكذلك O ₂ وCO ₂ تركيزات ^8،9. ويبدو أن هذه الصعوبات قد تحول دون الاستخدام الروتيني للنشرها القدرة على كشف الأمراض الرئة في الفئران، على الرغم من عدة مزاياه.

للتحايل على مشاكل مع قياس نشرها القدرات في الفئران، وتفاصيل وسيلة بسيطة لقياس ذلك في الفئران تم الإبلاغ مؤخرا ^10. الإجراء يلغي المشكلة الصعبة المتمثلة في أخذ عينات الغاز السنخية غير ملوثة من قبل بسرعة أخذ عينات من حجم مساو للغاز وحي بأكمله. ويؤدي هذا الإجراء في قياس استنساخه للغاية، وصفه عامل نشر لأول أكسيد الكربون (DFCO)، التي تعتبر حساسة لمجموعة من السلطة الفلسطينيةالتغييرات thologic في النمط الظاهري الرئة. وبالتالي، تقدر DFCO ك 1 - (CO ₉ / CO _ج) / (ني ₉ / ني _ج)، حيث ج و 9 السفلية تشير إلى تركيزات الغازات المعايرة حقن والغازات إزالتها بعد 9 ثانية عقد التنفس الوقت، على التوالي. DFCO هو متغير أبعاد، والتي تختلف بين 0 و 1، مع 1 يعكس امتصاص كامل لجميع CO، و0 لا تعكس أي امتصاص CO.

في هذا العرض وتبين لنا كيفية جعل هذا قياس قدرة نشرها، وكيف أنها يمكن أن تستخدم لتوثيق التغيرات في ما يقرب من جميع نماذج المرض الماوس الرئة الموجودة، بما في ذلك انتفاخ الرئة والتليف، إصابة الرئة الحادة، والعدوى الفيروسية والفطرية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوان من قبل لجنة جامعة رعاية الحيوان واستخدام جونز هوبكنز.

1. إعداد الحيوانية

1. تحضير الفئران C57BL 6/6 السيطرة لقياس DFCO، من خلال التخدير لهم الكيتامين وزيلازين على النحو المبين في الخطوة 2.3 أدناه.
2. إعداد كل من الفئران الأخرى مع أمراض الرئة المختلفة هو مبين في الجدول رقم 1 عن طريق استخدام نفس الإجراء لعناصر التحكم. وتوجد تفاصيل محددة اللازمة لإنشاء كل من هذه النماذج في المراجع ذات الصلة. السيطرة على الفئران وتلك الموجودة في الأفواج مرضية أخرى كلها أسابيع 6-12 من العمر.

2. قياس انتشار عامل لأول أكسيد الكربون (DFCO)

1. إنشاء وحدة اللوني الغاز المتوفرة مع الجهاز لقياس قمم النيتروجين، والأكسجين، النيون، وأول أكسيد الكربون. لهذا الاستخدام والتطبيق فقط النيون وCO البيانات.
   ملاحظة: يستخدم هذا الصك الصورة الجزيئيةالعمود ieve مع الهيليوم كما الغاز الناقل، مع 12.00 ميكرون الفيلم، 320.00 ID ميكرون و 10 متر طول. العمود اللوني لديه حجم 0.8 مل، ولكن كنا 2 مل لضمان المقاصة كافية من أنابيب يربط مع العينة.
2. في بداية كل يوم التجريبية، قبل اتخاذ قياسات للعينات من الفئران، وأخذ عينة 2 مل مباشرة من كيس خليط الغاز التي تحتوي على ما يقرب من 0.5٪ ني، و 0.5٪ CO، والتوازن الهواء، واستخدام هذه العينة لمعايرة واللوني الغاز.
3. تخدير الفئران مع الكيتامين (90 ملغ / كلغ) وزيلازين (15 ملغ / كلغ)، وتأكيد التخدير بسبب عدم وجود حركة لا ارادي. تطبيق مرهم البيطرية على العيون لمنع جفاف. يفغر الرغامى الفئران مع قنية كعب إبرة (18 G في البالغين أو 20 G في الفئران الصغار جدا).
   ملاحظة: يتم الانتهاء من DFCO في أقل من 10 دقيقة بعد التخدير وقبل أي التهوية الميكانيكية أو غيرها من الإجراءات.
4. في الفئران أكبر من 6 أسابيع من العمر، واستخدام 3 مل حقنة رس سحب 0.8 مل من الغاز من حقيبة خليط الغاز. ربط حقنة لقنية القصبة الهوائية وبسرعة تضخيم الرئة. باستخدام المسرع، عد 9 ثانية، ثم سرعان ما سحب 0.8 مل (هواء الزفير).
5. تمييع هذا سحب 0.8 مل هواء الزفير إلى 2 مل مع هواء الغرفة، والسماح لها راحة لمدة لا تقل عن 15 ثانية. ثم حقن العينة كلها في الكروماتوجرافي الغاز للتحليل.
6. في حين تحليل هذه العينة DFCO الأولى، وتضخيم الرئة الماوس مع الثانية 0.8 مل من الكيس خليط الغاز، ومن ثم معالجة هذه العينة مطابقة للعينة الأولى. متوسط ​​اثنين من القياسات DFCO.
   ملاحظة: للحصول على القياسات في الفئران الشابة مثل 2 أسابيع من العمر، واستخدام حجم 0.4 مل، منذ 0.8 مل كبير جدا وبلغ حجم التداول لجعل القياسات في الرئتين من الفئران الصغار جدا. فمن الأفضل استخدام حجم 0.8 مل بالنسبة للفئران التي يزيد عمرها عن 6 أسابيع، وأنه إذا كانت هناك حاجة حجم 0.4 مل لبعض الفئران، فإنه ينبغي أن تستخدم باستمرار لجميع الفئران في المجموعة التي تجري دراستها.
7. حساب DFCOك 1 - (CO ₉ / CO _ج) / (ني ₉ / ني _ج)، حيث تشير ج و 9 السفلية لتركيزات الغازات المعايرة حقن والغازات إزالتها بعد 9 ثانية عقد التنفس الوقت، على التوالي.
8. تحليل ومقارنة الاختلافات مع ANOVA في اتجاه واحد وتقييم مستوى الدلالة مع تصحيح توكي للمقارنات متعددة في جميع الفئران الفوج. تنظر ف <0.05 قيمة كبيرة كما.
   ملاحظة: وكانت جميع الفئران المستخدمة هنا جزء من الدراسات التجريبية التي تنطوي على عدة قياسات لاحقة للتهوية الرئة، والميكانيكا، وغسل الرئة، أو الأنسجة، والتي لا يتم الإبلاغ عن هنا. وبالإضافة إلى ذلك، منذ الأسلوب هو نفسه في جميع النماذج التجريبية كما حدث أعلاه في السيطرة على الفئران، يتم عرض فقط النتائج من مختلف النماذج المرضية. يتم تقديم مزيد من المعلومات عن هذه النماذج في الجدول التكميلي.
9. الموت ببطء الحيوانات anesthe العميقجرعة زائدة من التشنج تليها خلع عنق الرحم أو قطع الرأس. حيث تدعو الحاجة، وإزالة الخلايا و / أو أنسجة الرئة من الفئران الميتة للحصول على مزيد البيولوجية أو المعالجة نسيجية والتحليل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويبين الشكل 1 القياسات DFCO من الفئران الكبار في مجموعات A، B، C، D، E، وF. كان هناك انخفاض كبير مع كل من عدوى الرشاشيات والإنفلونزا، وكذلك انخفاض كبير في متليف، نفاخي، وحادة نماذج إصابة الرئة. ويبين الشكل 2 التغيرات التنموية المجموعة G في DFCO بمرور الوقت م?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في العمل الحالي، حددنا مقياس جديد لقياس القدرة الغاز تبادل في الرئة الماوس. هذا المقياس هو مماثل لقدرات نشرها، وقياس السريري المشترك الذي يقيس الوظيفة الأساسية في الرئة، وهذا هو، قدرته على تبادل الغاز. القدرة نشرها هو الوحيد قياس وظيفية الرئة التي يمكن بسهولة وسرعة ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gas Chromatograph	Inficon	Micro GC Model 3000A	Agilent makes a comparable model
18 G Luer stub needle	Becton Dickenson		Several other possible vendors
3 ml plastic syringe	Becton Dickenson		Several other possible vendors
Polypropylene gas sample bags	SKC	1 or 2 L capacity works well	Other gas tight bags will work well
Gas tank, 0.3% Ne, 0.3% CO, balance air; (size ME)	Airgas, Inc	Z04 NI785ME3012	This is the standard mixture used for DLCO in humans
25 TCID50/mouse of influenza virus A/PR8 diluted in phosphate buffered saline.
Porcine pancreatic elastase	Elastin Products, Owensville, MO		5.4 U
Bleomycin	APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL		0.25 U
Escherichia coli LPS	Sigma L2880		3 μg/g body weight; O55:B5
Aspergillus fumigatus (isolate Af293) conidia were collected from mature colonies grown on potato dextrose agar.