Função Pulmonar Fenotipagem Rato<em&gt; In Vivo</em&gt; Com a capacidade pulmonar Diffusing

Resumo

We describe a means to quickly and simply measure the lung diffusing capacity in mice and show that it is sufficiently sensitive to phenotype changes in multiple common lung pathologies. This metric thus brings direct translational relevance to the mouse models, since diffusing capacity is also easily measured in humans.

Resumo

O mouse é agora o animal primário usado para modelar uma variedade de doenças pulmonares. Para estudar os mecanismos que estão por trás dessas patologias, são necessários métodos fenotípicos que podem quantificar as alterações patológicas. Além disso, para proporcionar relevância translacional para os modelos de ratinho, tais medições devem ser testes que podem ser facilmente feitos em ambos os seres humanos e ratinhos. Infelizmente, no presente literatura algumas medições fenotípicas da função do pulmão têm aplicação directa em seres humanos. Uma exceção é a capacidade de difusão do monóxido de carbono, que é uma medida que é feito rotineiramente em seres humanos. No presente relatório, nós descrevemos um meio para medir rapidamente e simplesmente esta capacidade de difusão em camundongos. O procedimento envolve a inflação pulmonar breve com gases marcadores num rato anestesiado, seguido por um 1 min de tempo de análise de gás. Nós testamos a capacidade deste método para detectar várias patologias pulmonares, incluindo enfisema, fibrose, lesão pulmonar aguda e gripe einfecções pulmonares fúngicas, bem como a maturação pulmonar monitoramento em filhotes jovens. Os resultados mostram uma diminuição significativa em todas as patologias pulmonares, bem como um aumento da capacidade de difusão com a maturação pulmonar. Esta medida da capacidade de difusão pulmonar, portanto, fornece um teste de função pulmonar, que tem ampla aplicação com a sua capacidade de detectar mudanças estruturais fenotípicas com a maioria dos modelos de pulmão patológicas existentes.

Introdução

O mouse é agora o animal primário usado para modelar uma variedade de doenças pulmonares. Para estudar os mecanismos que underly tais patologias, são necessários métodos fenotípicos que podem quantificar a que as alterações patológicas. Embora existam muitos estudos com ratos, onde ventilação mecânica são medidos, essas medidas são geralmente relacionado com as avaliações padrão da função pulmonar normalmente feitos em seres humanos. Isso é lamentável, uma vez que a capacidade de executar as medidas equivalentes em camundongos e seres humanos podem facilitar a tradução dos resultados em modelos de ratos para doenças humanas.

Uma das medidas mais comuns e facilmente feitas em seres humanos é a capacidade de difusão do monóxido de carbono (DLCO) ^1,2, mas esta medida só foi raramente feito em modelos de ratos. Nesses estudos, onde foi relatado ^3-7, não houve estudos de acompanhamento, em parte porque os procedimentos são frequentemente onerosos ou pode reqùire equipamentos complexos. Outra abordagem é a utilização de um método de CO reinalatório em um sistema de estado estacionário, o que tem a vantagem de ser capaz de medir a difusão de CO em ratos conscientes. No entanto, este método é muito complicado, e os resultados podem variar de acordo com o nível de ventilação do rato bem como _de O ₂ e CO ₂ concentrações de ^8,9. Essas dificuldades parecem ter impedido o uso rotineiro de capacidade de detectar patologias pulmonares em ratos difusão, apesar de suas várias vantagens.

Para contornar os problemas com a medição da capacidade de difusão em camundongos, os detalhes de um meio simples para medi-lo em camundongos têm sido relatados recentemente ^10. O procedimento elimina o difícil problema de amostragem de gás alveolar não contaminada por amostragem rapidamente um volume igual a todo o gás inspirado. Este procedimento resulta em uma medida muito reprodutível, o denominado factor de difusão para o monóxido de carbono (Dfco), que é sensível a uma série de pathologic alterações no fenótipo pulmonar. O Dfco é portanto calculada como 1 - (CO ₉ / CO _c) / (Ne ₉ / Ne _c), onde a e c 9 subscritos referem-se a concentrações de gases de calibração injectados e os gases eliminados após um tempo de 9 s apneia, respectivamente. Dfco é uma variável adimensional, o qual varia entre 0 e 1, com 1 reflectindo a absorção completa de todo o CO, e 0 reflectindo qualquer absorção de CO.

Nesta apresentação, mostram como fazer a medição da capacidade de difusão, e como ela pode ser usada para documentar as alterações em quase todos os modelos existentes doença do pulmão do rato, incluindo enfisema, fibrose, lesão pulmonar aguda, e infecções virais e fúngicas.

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Protocolo

NOTA: Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê Universidade Animal Care and Use a Johns Hopkins.

1. Preparação de animais

1. Prepare ratos 6 C57BL / 6 de controle para a medição Dfco, anestesiando-los com cetamina e xilazina, conforme descrito no passo 2.3 abaixo.
2. Preparar todos os outros ratinhos com os diferentes patologias pulmonares mostrados na Tabela 1, utilizando o mesmo procedimento que para os controlos. Detalhes específicos necessários para estabelecer cada um destes modelos são encontrados nas referências relevantes. Os ratos de controlo e os dos outros grupos patológicos são todos 6-12 semanas de idade.

2. Medição do Fator de Difusão de monóxido de carbono (Dfco)

1. Configure o módulo cromatógrafo a gás fornecido com o equipamento para medir os picos de nitrogênio, oxigênio, néon, e monóxido de carbono. Para este uso aplicação apenas os dados de néon e CO.
   NOTA: Este instrumento utiliza um s molecularescoluna IEVE com hélio como gás de transporte, com 12,00 mm filme, 320,00 mm ID e 10 m de comprimento. A coluna de cromatografia tem um volume de 0,8 ml, mas utilizou-se 2 ml para assegurar adequada compensação da tubagem de ligação com a amostra.
2. No início de cada dia experimental, antes de se efectuarem as medições das amostras a partir dos ratinhos, tomar uma amostra de 2 ml directamente a partir de um saco de mistura de gás que contém cerca de 0,5% Ne, 0,5% de CO, e equilibrar ar, e usar esta amostra para calibrar o cromatógrafo a gás.
3. Anestesiar ratos com cetamina (90 mg / kg) e xilazina (15 mg / kg), e confirmar a anestesia pela ausência do reflexo do movimento. Aplicar pomada veterinária sobre os olhos para evitar o ressecamento. Tracheostomize os ratos com uma cânula de agulha stub (18 g em adultos ou 20 G em muito jovem ratos).
   NOTA: O Dfco é completada em menos de 10 minutos após a anestesia e antes de qualquer ventilação mecânica ou outros procedimentos.
4. Em ratinhos superiores a 6 semanas de idade, usar uma seringa de 3 ml to retirar 0,8 ml de gás a partir do saco de mistura de gás. Ligar a seringa para a cânula traqueal e rapidamente inflar o pulmão. Usando um metrônomo, conte 9 seg, e então rapidamente retirar os 0,8 ml (no ar expirado).
5. Diluir esta retirados 0,8 ml ar exalado para 2 ml com ar ambiente, deixe-a descansar por pelo menos 15 segundos. Em seguida, injetar toda a amostra no cromatógrafo a gás para análise.
6. Ao analisar esta primeira amostra Dfco, inflar o pulmão do rato com um segundo de 0,8 ml do saco de mistura de gases, e, em seguida, processar esta amostra idêntica à primeira amostra. Calcular a média das duas medidas Dfco.
   NOTA: Para medições em ratos jovens como de 2 semanas de idade, usar um volume de 0,4 ml, 0,8 ml é desde um volume demasiado importante para fazer medições em pulmões de ratos muito jovens. É preferível utilizar o volume de 0,8 ml para os ratinhos mais velhos de 6 semanas, e que, se o volume de 0,4 ml é necessária para alguns ratinhos, que deve ser utilizado de forma consistente para todos os ratinhos no grupo a ser estudados.
7. Calcule Dfcocomo 1 - (CO ₉ / CO _c) / (Ne ₉ / Ne _c), onde C e 9 subscritos referem-se as concentrações dos gases de calibração injetados e os gases removidos após um 9 seg tempo apneia, respectivamente.
8. Analisar e comparar as diferenças com um one-way ANOVA e avaliar o nível de significância com correção de Tukey para comparações múltiplas em todos os ratos de coorte. Considere p <0,05 como significativo.
   NOTA: Todos os ratos usados ​​aqui foram parte de estudos experimentais envolvendo várias medições posteriores de ventilação pulmonar, mecânica, lavagem pulmonar, ou histologia, que não são aqui relatados. Além disso, uma vez que o método é o mesmo em todos os modelos experimentais como foi feito acima nos ratinhos de controlo, somente os resultados de vários modelos patológicos são apresentados. Informação adicional sobre estes modelos é apresentada na tabela suplementar.
9. Eutanásia os animais por anestesia profundasobredosagem tic seguido por deslocamento cervical ou decapitação. Sempre que necessário, remover as células e / ou tecidos do pulmão dos ratos mortos para mais biológico ou processamento histológico e análise.

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Resultados

A Figura 1 mostra as medições Dfco dos ratos adultos em grupos A, B, C, D, E e F. Houve uma redução significante com ambas as infecções por Aspergillus e da gripe, bem como diminuições significativas na fibrótica, enfisema, e aguda modelos de lesão do pulmão. A Figura 2 mostra as alterações do Grupo G de desenvolvimento em Dfco ao longo do tempo como a idade ratinhos 2-6 semanas. Houve um ligeiro mas significativo aumento no desenvolvimento pulmonar ao longo deste curso de ...

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Discussão

No presente trabalho, definimos uma nova métrica para quantificar a capacidade trocas gasosas do pulmão do rato. Esta métrica é análoga à capacidade de difusão, uma medida clínica comum que mede a função primária do pulmão, isto é, a sua capacidade para a troca de gás. A capacidade de difusão é a única medida funcional do pulmão que podem ser facilmente e rapidamente feito em ambos os ratos e os seres humanos. Para a detecção da doença de pulmão em camundongos, um objectivo importante é quantifica...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gas Chromatograph	Inficon	Micro GC Model 3000A	Agilent makes a comparable model
18 G Luer stub needle	Becton Dickenson		Several other possible vendors
3 ml plastic syringe	Becton Dickenson		Several other possible vendors
Polypropylene gas sample bags	SKC	1 or 2 L capacity works well	Other gas tight bags will work well
Gas tank, 0.3% Ne, 0.3% CO, balance air; (size ME)	Airgas, Inc	Z04 NI785ME3012	This is the standard mixture used for DLCO in humans
25 TCID50/mouse of influenza virus A/PR8 diluted in phosphate buffered saline.
Porcine pancreatic elastase	Elastin Products, Owensville, MO		5.4 U
Bleomycin	APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL		0.25 U
Escherichia coli LPS	Sigma L2880		3 μg/g body weight; O55:B5
Aspergillus fumigatus (isolate Af293) conidia were collected from mature colonies grown on potato dextrose agar.