Fenotipizzazione mouse Pulmonary Function<em&gt; In Vivo</em&gt; Con la capacità polmonare Diffusione

Riepilogo

We describe a means to quickly and simply measure the lung diffusing capacity in mice and show that it is sufficiently sensitive to phenotype changes in multiple common lung pathologies. This metric thus brings direct translational relevance to the mouse models, since diffusing capacity is also easily measured in humans.

Abstract

Il mouse è ora l'animale principale utilizzato per modellare una varietà di malattie polmonari. Per studiare i meccanismi che sono alla base di tali patologie, sono necessari metodi fenotipici in grado di quantificare i cambiamenti patologici. Inoltre, per fornire rilevanza traslazionale ai modelli murini, tali misure devono essere prove che possono essere facilmente fatto in entrambi gli esseri umani e topi. Sfortunatamente, nella presente letteratura alcune misurazioni fenotipiche della funzione polmonare hanno applicazione diretta agli esseri umani. Un'eccezione è la capacità di diffusione del monossido di carbonio, che è una misura che viene normalmente fatto in esseri umani. Nella presente relazione, descriviamo un mezzo per misurare rapidamente e semplicemente questo capacità di diffusione nei topi. La procedura implica breve gonfiaggio polmonare con gas traccianti in un mouse anestetizzato, seguito da un tempo di analisi gas 1 min. Abbiamo testato la capacità di questo metodo per individuare varie patologie polmonari, tra cui l'enfisema, la fibrosi, danno polmonare acuto, e l'influenza einfezioni polmonari fungine, così come il monitoraggio la maturazione polmonare in giovani cuccioli. I risultati mostrano una significativa diminuzione di tutte le patologie polmonari, nonché un aumento della capacità di diffusione con la maturazione polmonare. Questa misura di capacità di diffusione polmonare fornisce quindi un test di funzionalità polmonare, che ha una vasta applicazione con la sua capacità di rilevare i cambiamenti strutturali fenotipiche con la maggior parte dei modelli di polmone patologiche esistenti.

Introduzione

Il mouse è ora l'animale principale utilizzato per modellare una varietà di malattie polmonari. Per studiare i meccanismi che sottostanno tali patologie, sono necessari metodi fenotipici in grado di quantificare il che le alterazioni patologiche. Anche se ci sono molti studi sui topi in cui sono misurati meccanici di ventilazione, queste misure sono generalmente estranei a valutazioni standard di funzionalità polmonare di solito fatto in esseri umani. Questo è un peccato, in quanto la capacità di eseguire misure equivalenti nei topi e soggetti umani possono facilitare la traduzione dei risultati in modelli murini di patologie umane.

Una delle misure più comuni e facilmente realizzati in soggetti umani è la capacità di diffusione del monossido di carbonio (DLCO) ^1,2, ma questa misura è stato raramente fatto solo in modelli murini. In questi studi in cui è stato segnalato ^3-7, non ci sono stati studi di follow-up, in parte perché le procedure sono spesso ingombranti o possono REQuire attrezzature complesse. Un altro approccio è quello di utilizzare un metodo di CO rirespirazione in un sistema di stato stazionario, che ha il vantaggio di essere in grado di misurare CO diffusione in topi coscienti. Tuttavia questo metodo è molto ingombrante, e risultati può variare con il livello di ventilazione del topo e O ₂ e CO ₂ concentrazioni ^8,9. Queste difficoltà sembrano essere precluso l'uso di routine di capacità di individuare patologie polmonari nei topi diffusione, nonostante i suoi numerosi vantaggi.

Per aggirare i problemi con la misurazione della capacità nei topi diffusione, dettagli di un semplice mezzo per misurare in topi sono stati recentemente segnalati ^10. La procedura elimina il difficile problema di campionamento incontaminata gas alveolare campionando rapidamente un volume pari a tutto il gas ispirato. Questa procedura comporta una misurazione molto riproducibili, definito il fattore di diffusione per il monossido di carbonio (DFCO), che è sensibile a un host di pacambiamenti thologic del fenotipo polmonare. Il DFCO è quindi calcolato come 1 - (CO ₉ / CO _c) / (Ne ₉ / Ne _c), dove c e 9 pedici riferiscono alle concentrazioni dei gas di taratura iniettati e gas rimossi dopo un tempo 9 sec apnea, rispettivamente. DFCO è una variabile adimensionale, che varia tra 0 e 1, con 1 riflettendo completo assorbimento di tutti CO, e 0 riflettendo nessun assorbimento di CO.

In questa presentazione vi mostriamo come fare questa misura la capacità di diffusione, e in che modo può essere utilizzato per documentare i cambiamenti in quasi tutti i modelli di malattia del mouse polmone esistenti, tra cui l'enfisema, la fibrosi, danno polmonare acuto, e le infezioni virali e fungine.

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Protocollo

NOTA: Tutti i protocolli su animali sono stati approvati dall'Università Animal Care and Use Committee Johns Hopkins.

1. Preparazione degli animali

1. Preparare topi 6 C57BL / 6 di controllo per la misurazione DFCO, da loro anestetizzare con ketamina e xilazina come indicato al punto 2.3.
2. Preparare tutti gli altri topi con diverse patologie polmonari mostrati nella Tabella 1 usando la stessa procedura per i controlli. I dettagli specifici necessari per stabilire ciascuno di questi modelli si trovano nei riferimenti pertinenti. Topi di controllo e quelle delle altre coorti patologiche sono tutti 6-12 settimane di età.

2. Misura di Diffusion Factor per monossido di carbonio (DFCO)

1. Impostare il modulo gascromatografo fornito con la macchina per misurare picchi di azoto, ossigeno, neon, e il monossido di carbonio. Per questo uso applicazione solo i dati al neon e CO.
   NOTA: Questo strumento utilizza un s molecolareIEVE colonna con l'elio come gas di trasporto, con un 12,00 micron film, 320.00 ID micron e 10 m di lunghezza. La colonna cromatografo ha un volume di 0,8 ml, ma abbiamo usato 2 ml per garantire un'adeguata compensazione del tubo di collegamento con il campione.
2. All'inizio di ogni giornata sperimentale, prima di effettuare le misurazioni dei campioni dai topi, prendere un campione di 2 ml direttamente da un sacchetto di miscela di gas contenente circa lo 0,5% Ne, 0,5% di CO, e bilanciare l'aria, e utilizzare questo esempio per calibrare il gascromatografo.
3. Anestetizzare topi con ketamina (90 mg / kg) e xilazina (15 mg / kg), e confermare l'anestesia dall'assenza di movimento riflesso. Applicare pomata veterinaria sugli occhi per evitare la secchezza. Tracheostomize i topi con una cannula stub ago (18 G in adulti o 20 G in molto giovani topi).
   NOTA: Il DFCO si completa in meno di 10 minuti dopo l'anestesia e prima di ogni ventilazione meccanica o altre procedure.
4. Nei topi superiori a 6 settimane di età, usare una siringa da 3 ml to prelevare 0,8 ml di gas dalla sacca miscela di gas. Collegare la siringa cannula tracheale e gonfiare rapidamente il polmone. Utilizzando un metronomo, conta 9 sec, e poi rapidamente ritirare i 0,8 ml (aria espirata).
5. Diluire questa ritirati 0,8 ml aria espirata a 2 ml con aria ambiente, lasciarlo riposare per almeno 15 sec. Poi iniettare l'intero campione nel gascromatografo per l'analisi.
6. Analizzando questo primo campione DFCO, gonfiare il polmone mouse con una seconda 0,8 ml dal sacchetto miscela di gas, e quindi elaborare questo campione identico al primo campione. La media dei due misurazioni DFCO.
   NOTA: Per misure in topi giovani come 2 settimane di vita, utilizzare un volume di 0,4 ml, in quanto 0,8 ml è un volume eccessivo di fare misure in polmoni dei giovanissimi topi. E 'meglio usare il volume di 0,8 ml per i topi più anziani di 6 settimane, e che se è necessario il volume 0,4 ml per alcuni topi, che dovrebbe essere utilizzato in modo coerente per tutti i mouse nella coorte in fase di studio.
7. Calcola DFCOcome 1 - (CO ₉ / CO _c) / (Ne ₉ / Ne _c), dove C e 9 pedici riferiscono alle concentrazioni dei gas di taratura iniettati e gas rimossi dopo un tempo 9 sec apnea, rispettivamente.
8. Analizzare e confrontare le differenze con un one-way ANOVA e valutare il livello di significatività con correzione di Tukey per confronti multipli in tutti i topi di coorte. Considerare p <0,05 valore significativo.
   NOTA: Tutti i topi utilizzati qui facevano parte di studi sperimentali che coinvolgono diverse misurazioni successive di ventilazione polmonare, la meccanica, lavaggio polmonare, o istologia, che non sono riportati qui. Inoltre, dato che il metodo è la stessa in tutti i modelli sperimentali come è stato fatto in precedenza nei topi di controllo, solo i risultati dei vari modelli patologiche sono presentati. Per ulteriori informazioni su questi modelli è presentato nella tabella supplementare.
9. Eutanasia degli animali da profondi anestheoverdose tic seguita da dislocazione cervicale o decapitazione. Dove necessario, rimuovere le cellule e / o tessuti polmonari da topi morti per ulteriori biologica o trasformazione istologica e analisi.

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Risultati

La figura 1 mostra le misurazioni DFCO dai topi adulti in gruppi A, B, C, D, E e F. c'erano diminuzioni significative con entrambe le infezioni da Aspergillus e influenza, nonché riduzioni significative del fibrotico, enfisematosa, e acuta modelli danno polmonare. La figura 2 mostra il gruppo G alterazioni dello sviluppo DFCO nel tempo come l'età topi 2-6 settimane. C'è stato un lieve ma significativo aumento con lo sviluppo polmonare nel corso del tempo. L'effetto di...

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Discussione

Nel presente lavoro, abbiamo definito una nuova metrica di quantificare la capacità gas scambio del polmone mouse. Questo parametro è analogo alla capacità di diffusione, una misura comune clinica che misura la funzione primaria del polmone, cioè la capacità di scambiare gas. La capacità di diffusione è l'unica misurazione funzionale polmonare che può essere fatto facilmente e rapidamente sia nei topi e nell'uomo. Per la rilevazione di malattie polmonari nei topi, un obiettivo importante è quello di qua...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gas Chromatograph	Inficon	Micro GC Model 3000A	Agilent makes a comparable model
18 G Luer stub needle	Becton Dickenson		Several other possible vendors
3 ml plastic syringe	Becton Dickenson		Several other possible vendors
Polypropylene gas sample bags	SKC	1 or 2 L capacity works well	Other gas tight bags will work well
Gas tank, 0.3% Ne, 0.3% CO, balance air; (size ME)	Airgas, Inc	Z04 NI785ME3012	This is the standard mixture used for DLCO in humans
25 TCID50/mouse of influenza virus A/PR8 diluted in phosphate buffered saline.
Porcine pancreatic elastase	Elastin Products, Owensville, MO		5.4 U
Bleomycin	APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL		0.25 U
Escherichia coli LPS	Sigma L2880		3 μg/g body weight; O55:B5
Aspergillus fumigatus (isolate Af293) conidia were collected from mature colonies grown on potato dextrose agar.