Фенотипирование мыши легочная функция<em&gt; В Vivo</em&gt; С жизненной емкости легких диффундирующих

Резюме

We describe a means to quickly and simply measure the lung diffusing capacity in mice and show that it is sufficiently sensitive to phenotype changes in multiple common lung pathologies. This metric thus brings direct translational relevance to the mouse models, since diffusing capacity is also easily measured in humans.

Аннотация

Мышь теперь основной животных используются для моделирования различных легочных заболеваний. Для изучения механизмов, лежащих в основе таких патологий, фенотипические методы необходимы, которые могут количественно патологические изменения. Кроме того, чтобы обеспечить поступательное отношение к модели мыши, такие измерения должны быть тесты, которые можно легко сделать у людей и мышей. К сожалению, в данном литературе несколько фенотипических измерения легочной функции имеют непосредственное применение в организме человека. Одним из исключений является диффузионная емкость для монооксида углерода, который является измерение, которое обычно делается в организме человека. В настоящем докладе мы описываем средства, чтобы быстро и просто измерить этот диффузионной способности у мышей. Процедура включает в себя краткое легких с инфляцией измеряемых газов в наркозом мыши, а затем на время газового анализа 1 мин. Мы протестировали способность этого метода обнаруживать несколько патологий легких, включая эмфизему, фиброз, острого повреждения легких и гриппа игрибковые инфекции легких, а также мониторинг развития легких у молодых щенков. Результаты показывают, значительное снижение всех патологий легких, а также увеличение пропускной способности рассеивающего с легких созревания. Это измерение диффузионной способности легких, таким образом, обеспечивает испытание функции легких, который имеет широкое применение с его способностью обнаруживать структурные изменения фенотипических с большинством существующих патологических моделей легких.

Введение

Мышь теперь основной животных используются для моделирования различных легочных заболеваний. Для изучения механизмов, которые underly такие патологии, фенотипические методы необходимы, которые могут количественно это патологические изменения. Хотя есть много исследований на мышах, где механики вентиляции оцениваются эти измерения, как правило, не связаны со стандартными оценками легочной функции обычно делается в организме человека. Это печально, так как способность выполнять эквивалентные измерения в мышей и человека в качестве субъекта может способствовать перевод результатов в мышиных моделях человеческой болезни.

Одним из наиболее распространенных и легко из измерений в человеческих субъектов является диффузионная емкость для монооксида углерода (DLCO) ^1,2, но это измерение очень редко было сделано на мышах. В тех исследованиях, где было сообщено, ^3-7, там не было никаких последующие исследования, в частности, потому, что процедуры часто громоздки или может REquire сложного оборудования. Другой подход заключается в использовании метода CO передыханию в стационарном системы, которая имеет преимущество, которое позволяет измерять CO диффузии в сознании мышей. Однако этот метод является очень громоздким, и результаты могут меняться в зависимости от уровня вентиляции мыши, а также O ₂ и CO ₂ концентрации ^8,9. Эти трудности, кажется, исключает рутинное использование диффузионной способности обнаруживать патологии легких у мышей, несмотря на его несколько преимуществ.

Чтобы обойти проблемы с измерением диффузионной способности у мышей, детали простого способа измерить его у мышей были недавно сообщил ^10. Процедура устраняет трудную проблему отбора незагрязненных альвеолярного газа, быстро выборки объем, равный всего вдохновенного газа. Эта процедура приводит к очень воспроизводимого измерения, называемая фактор диффузии для окиси углерода (DFCO), который чувствителен к целому ряду годовыхthologic изменения в фенотипе легких. DFCO, таким образом, рассчитывается как 1 - (CO ₉ / CO _C) / (Ne ₉ / Ne _С), где С и 9 индексы относятся к концентрации калибровочных газов Литьевая и газов, удаленных после 9 сек времени задержку дыхания, соответственно. DFCO безразмерная переменная, которая изменяется между 0 и 1, где 1 отражает полное поглощение всего CO и 0 не отражающие поглощение CO.

В этой презентации мы покажем, как сделать это измерение мощности распространении, и как он может быть использован для документирования изменений в почти всех существующих моделях болезни Мышь легких, в том числе эмфиземы, фиброза, острого повреждения легких, вирусные и грибковые инфекции.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все протоколы животных были одобрены Комитетом Университета Джонса Хопкинса уходу и использованию животных мимо.

1. Подготовка животных

1. Подготовка мышей 6 C57BL / 6 управления для измерения DFCO, посредством анестезии кетамином их и ксилазина, как описано в стадии 2.3 ниже.
2. Подготовьте все другие мышей с различных патологий легких, показанных в таблице 1, с использованием той же процедуры, что и для контрольной группы. Конкретные детали, необходимые для установления каждой из этих моделей можно найти в соответствующих справочниках. Контрольные мыши и тех, и в других патологических когорт все 6-12-недельного возраста.

2. Измерение диффузионной фактором для угарного газа (DFCO)

1. Настройка модуля газового хроматографа в комплект поставки машины для измерения пики азота, кислорода, неона и моноксида углерода. Для этого используют приложение только неоновые и CO данные.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот прибор использует молекулярные Sieve колонка с гелием в качестве газа-носителя, с 12.00 мкм пленки, 320,00 мкм ID и 10 м длиной. В столбце хроматограф имеет объем 0,8 мл, а мы использовали 2 мл, чтобы обеспечить адекватную очистку соединительной трубки с образцом.
2. В начале каждой экспериментальной день, до проведения измерений образцов у мышей, принимают образец 2 мл непосредственно из газовой смеси мешка, содержащего приблизительно 0,5% Ne, 0,5% CO, и баланс воздуха, и использовать этот образец для калибровки газовый хроматограф.
3. Обезболить мышей с кетамином (90 мг / кг) и ксилазина (15 мг / кг), и подтвердить анестезии отсутствием рефлекторной движения. Применить ветеринарной мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость. Tracheostomize мышей с заглушкой канюли иглы (18 G у взрослых или 20 G в очень молодых мышей).
   ПРИМЕЧАНИЕ: DFCO завершены менее чем за 10 минут после анестезии, и перед каждой искусственной вентиляции легких или других процедур.
4. У мышей больше, чем 6 недель возраста, используют 3 мл шприц тO вывести 0,8 мл газа из газовой смеси мешка. Соедините шприц с трахеи канюли и быстро надуть легких. Использование метронома, рассчитывать 9 сек, а затем быстро вывести 0,8 мл (выдыхаемый воздух).
5. Развести этот изъятые 0,8 мл выдыхаемого воздуха до 2 мл с комнатным воздухом, дайте ему отдохнуть в течение по крайней мере 15 сек. Затем вводят весь образец в газовый хроматограф для анализа.
6. При анализе этого первый образец DFCO, раздувать легкие мыши со вторым 0,8 мл из газовой смеси мешок, а затем обработать этот образец, идентичный первого образца. Нормальное два измерения DFCO.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерений в мышей, молодых, как 2-недельного возраста, используйте объем 0,4 мл, с 0,8 мл слишком большой объем для выполнения измерений в легких очень молодых мышей. Лучше использовать объем 0,8 мл для мышей в возрасте старше 6 недель, и что, если объем 0,4 мл необходим для некоторых мышей, он должен быть использован последовательно для всех мышей в группе изучается.
7. Рассчитать DFCOкак 1 - (CO ₉ / CO _C) / (Ne ₉ / Ne _С), где С и 9 индексы относятся к концентрации калибровочных газов Литьевая и газов, удаленных после 9 сек времени задержку дыхания, соответственно.
8. Анализ и сравнения различий с односторонним ANOVA и оценить уровень значимости с коррекцией Тьюки для множественных сравнений во всех групповых мышей. Рассмотрим р <0,05, как значительную ценность.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все мыши, используемые здесь, являются частью экспериментальных исследований с участием нескольких последующих измерений вентиляции легких, механики, легких промывания или гистологии, которые здесь не приводятся. Кроме того, поскольку этот метод является одинаковым во всех экспериментальных моделях, как это было сделано выше в контрольных мышей, только результаты из различных патологических моделей представлены. Дополнительную информацию об этих моделей представлена ​​в дополнительном таблице.
9. Усыпить животных от глубокой anestheкрестики передозировки с последующим смещением шейных позвонков или обезглавливание. В случае необходимости, удалите клетки легких и / или тканей от мертвых мышей для дальнейшего биологических или гистологического обработки и анализа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

На рисунке 1 показаны измерения DFCO от взрослых мышей в группах А, В, С, D, E и F. Были значительное снижение с обеих инфекций Aspergillus и гриппа, а также значительное снижение фиброзной, эмфизематозных и острый Модели повреждения легких. Рисунок 2 показывает изменения группы G ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В настоящей работе мы определили новую метрику для количественной оценки газового обмена способность легких мышей. Этот показатель аналогичен диффузионной способности, общей клинической оценки, который измеряет основную функцию легких, то есть его способности газообмена. Диффузион?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gas Chromatograph	Inficon	Micro GC Model 3000A	Agilent makes a comparable model
18 G Luer stub needle	Becton Dickenson		Several other possible vendors
3 ml plastic syringe	Becton Dickenson		Several other possible vendors
Polypropylene gas sample bags	SKC	1 or 2 L capacity works well	Other gas tight bags will work well
Gas tank, 0.3% Ne, 0.3% CO, balance air; (size ME)	Airgas, Inc	Z04 NI785ME3012	This is the standard mixture used for DLCO in humans
25 TCID50/mouse of influenza virus A/PR8 diluted in phosphate buffered saline.
Porcine pancreatic elastase	Elastin Products, Owensville, MO		5.4 U
Bleomycin	APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL		0.25 U
Escherichia coli LPS	Sigma L2880		3 μg/g body weight; O55:B5
Aspergillus fumigatus (isolate Af293) conidia were collected from mature colonies grown on potato dextrose agar.