Función Fenotipificación ratón pulmonar<em&gt; En Vivo</em&gt; Con la capacidad de difusión pulmonar

Resumen

We describe a means to quickly and simply measure the lung diffusing capacity in mice and show that it is sufficiently sensitive to phenotype changes in multiple common lung pathologies. This metric thus brings direct translational relevance to the mouse models, since diffusing capacity is also easily measured in humans.

Resumen

El ratón es ahora el animal principal utilizada para modelar una variedad de enfermedades pulmonares. Para estudiar los mecanismos que subyacen a este tipo de patologías, se necesitan métodos fenotípicos que pueden cuantificar los cambios patológicos. Además, para proporcionar relevancia de traslación a los modelos de ratón, tales medidas deben ser las pruebas de que se puede hacer fácilmente en los seres humanos y ratones. Desafortunadamente, en el presente literatura pocas mediciones fenotípicas de la función pulmonar tienen aplicación directa a los seres humanos. Una excepción es la capacidad de difusión del monóxido de carbono, que es una medida que se realiza de forma rutinaria en los seres humanos. En el presente informe se describe un medio para medir de forma rápida y sencilla esta capacidad de difusión en ratones. El procedimiento consiste en breve la inflación pulmonar con gases trazadores en un ratón anestesiado, seguido de una 1 min tiempo de análisis de gas. Hemos probado la capacidad de este método para detectar varias patologías pulmonares, incluyendo el enfisema, fibrosis, lesión pulmonar aguda, y la influenza yinfecciones pulmonares por hongos, así como el seguimiento de maduración pulmonar en los cachorros. Los resultados muestran una disminución significativa en todas las patologías pulmonares, así como un aumento en la capacidad de difusión con la maduración pulmonar. Esta medición de la capacidad de difusión del pulmón por lo tanto proporciona una prueba de la función pulmonar que tiene una amplia aplicación con su capacidad para detectar cambios estructurales fenotípicas con la mayoría de los modelos patológicos pulmonares existentes.

Introducción

El ratón es ahora el animal principal utilizada para modelar una variedad de enfermedades pulmonares. Para el estudio de los mecanismos que subyacen en estas patologías, se necesitan métodos fenotípicos que pueden cuantificar el que los cambios patológicos. Aunque hay muchos estudios en ratones donde se miden la mecánica de ventilación, estas mediciones son generalmente no relacionada con las evaluaciones estándar de la función pulmonar hace normalmente en seres humanos. Esto es lamentable, ya que la capacidad de realizar mediciones equivalentes en ratones y seres humanos puede facilitar la traducción de los resultados en modelos de ratón de la enfermedad humana.

Una de las medidas más comunes y fácilmente realizados en sujetos humanos es la capacidad de difusión del monóxido de carbono (DLCO) ^1,2, pero esta medida ha rara vez sólo ha hecho en modelos de ratón. En los estudios donde se ha reportado ^3-7, no ha habido estudios de seguimiento, en parte debido a que los procedimientos son a menudo difíciles de aplicar o pueden reqUIRE equipos complejos. Otro enfoque consiste en utilizar un método de CO respiración del aire exhalado en un sistema en estado estacionario, que tiene la ventaja de ser capaz de medir la difusión de CO en ratones conscientes. Sin embargo, este método es muy engorroso, y los resultados pueden variar con el nivel de ventilación del ratón, así como O ₂ y CO ₂ concentraciones de ^8,9. Estas dificultades parecen haber impedido el uso rutinario de la capacidad de difusión para detectar patologías pulmonares en ratones, a pesar de sus muchas ventajas.

Para evitar los problemas con la capacidad de difusión en ratones, los detalles de un simple medio para medirlo en ratones han sido recientemente reportado ^10. El procedimiento elimina el difícil problema de muestreo de gas alveolar no contaminado por muestreo rápidamente un volumen igual a todo el gas inspirado. Este procedimiento resulta en una medida muy reproducible, denominado el factor de difusión para el monóxido de carbono (DFCO), que es sensible a una serie de pathologic cambios en el fenotipo de pulmón. El DFCO se calcula como 1 - (CO ₉ / CO _c) / (Ne ₉ / Ne _c), donde el C y 9 subíndices se refieren a concentraciones de los gases de calibración inyectado y los gases eliminados después de un tiempo de 9 segundos apnea, respectivamente. DFCO es una variable sin dimensiones, que varía entre 0 y 1, donde 1 refleja la absorción completa de todos CO, y 0 refleja ausencia de captación de CO.

En esta presentación se muestra cómo hacer que esta medida la capacidad de difusión, y la forma en que se puede utilizar para documentar los cambios en casi todos los modelos de enfermedad de pulmón de ratón existentes, incluyendo el enfisema, fibrosis, lesión pulmonar aguda y las infecciones víricas y fúngicas.

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Protocolo

NOTA: Todos los animales protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Johns Hopkins y Uso.

1. Preparación de los animales

1. Preparar los ratones C57BL / 6 6 de control para la medición DFCO, anestesiando con ketamina y xilazina como se indica en el paso 2.3.
2. Preparar todos los otros ratones con las diferentes patologías pulmonares que se muestran en la Tabla 1 utilizando el mismo procedimiento que para los controles. Los detalles específicos necesarios para establecer cada uno de estos modelos se encuentran en las referencias pertinentes. Los ratones de control y los de las otras cohortes patológicos son todos de 6-12 semanas de edad.

2. Medición del Factor de Difusión de monóxido de carbono (DFCO)

1. Configure el módulo cromatógrafo de gas suministrado con la máquina para medir picos de nitrógeno, oxígeno, neón, y monóxido de carbono. Para este uso de la aplicación sólo los datos de neón y CO.
   NOTA: Este instrumento utiliza un s molecularescolumna IEVE con helio como gas portador, con un 12,00 micras película, 320.00 ID my 10 m de longitud. El cromatógrafo de columna tiene un volumen de 0,8 ml, pero se utilizó 2 ml para asegurar la compensación adecuada de los tubos de conexión con la muestra.
2. Al comienzo de cada día experimental, antes de realizar las mediciones de las muestras de los ratones, tomar una muestra de 2 ml directamente de una bolsa de mezcla de gas que contiene aproximadamente 0,5% Ne, 0,5% de CO, y equilibrar el aire, y utilizar esta muestra para calibrar el cromatógrafo de gases.
3. Anestesiar a los ratones con ketamina (90 mg / kg) y xilazina (15 mg / kg), y confirmar la anestesia por la ausencia de movimiento reflejo. Aplique un ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad. Tracheostomize los ratones con una cánula de aguja talón (18 G en adultos o 20 G en ratones muy jóvenes).
   NOTA: El DFCO se completa en menos de 10 min después de la anestesia y antes de cualquier ventilación mecánica u otros procedimientos.
4. En los ratones de más de 6 semanas de edad, utilizar una jeringa de 3 ml to retirar 0,8 ml de gas de la bolsa de mezcla de gas. Conectar la jeringa a la cánula traqueal e inflar rápidamente el pulmón. El uso de un metrónomo, cuente 9 s, y luego rápidamente retirar los 0,8 ml (aire exhalado).
5. Diluir esta retirados 0,8 ml aire exhalado a 2 ml con aire ambiental, deje reposar durante al menos 15 segundos. Se inyecta toda la muestra en el cromatógrafo de gases para su análisis.
6. Mientras que el análisis de esta primera muestra de DFCO, inflar el pulmón de ratón con una segunda 0,8 ml de la bolsa de mezcla de gas, y luego procesar esta muestra idéntica a la primera muestra. La media de los dos mediciones DFCO.
   NOTA: Para las mediciones en ratones de tan sólo 2 semanas de edad, use un volumen de 0,4 ml, desde 0,8 ml es un volumen demasiado importante para hacer mediciones en los pulmones de los ratones muy jóvenes. Es mejor utilizar el volumen de 0,8 ml para los ratones de más edad de 6 semanas, y que si se necesita el volumen de 0,4 ml para algunos ratones, que debe ser usado consistentemente para todos los ratones en la cohorte se está estudiando.
7. Calcular DFCOcomo 1 - (CO ₉ / CO _c) / (Ne ₉ / Ne _c), donde C y 9 subíndices se refieren a las concentraciones de los gases de calibración inyectadas y los gases eliminados después de un 9 seg tiempo en apnea, respectivamente.
8. Analizar y comparar las diferencias con un ANOVA de una vía y evaluar el nivel de significación con la corrección de Tukey para comparaciones múltiples en todos los ratones de cohortes. Considere p <0,05 valor como significativo.
   NOTA: Todos los ratones utilizados aquí fueron parte de los estudios experimentales que involucran varias mediciones posteriores de ventilación pulmonar, la mecánica, lavado pulmonar, o la histología, que no se reportan aquí. Además, ya que el método es el mismo en todos los modelos experimentales como se hizo anteriormente en los ratones de control, sólo se presentan los resultados de los diversos modelos patológicos. Para más información sobre estos modelos se presenta en la tabla suplementaria.
9. La eutanasia a los animales por anesthe profundasobredosis tic seguido por dislocación cervical o decapitación. Cuando sea necesario, eliminar las células y / o tejidos pulmonares de los ratones muertos para más biológico o procesamiento histológico y análisis.

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Resultados

La Figura 1 muestra las mediciones DFCO de los ratones adultos en los grupos A, B, C, D, E, y F. No hubo disminuciones significativas tanto con las infecciones por Aspergillus y la gripe, así como una disminución significativa en la fibrótica, enfisematosa, y aguda modelos de lesión pulmonar. La Figura 2 muestra los cambios en el desarrollo del Grupo G en DFCO lo largo del tiempo como la edad los ratones de 2-6 semanas. Hubo un aumento ligero pero significativo con el desarrollo del...

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Discusión

En el presente trabajo, hemos definido una nueva métrica para cuantificar la capacidad de intercambio de gases del pulmón de ratón. Esta métrica es análoga a la capacidad de difusión, una medición clínica común que mide la función principal del pulmón, es decir, su capacidad de intercambio de gases. La capacidad de difusión es la única medida funcional de pulmón que se puede hacer fácil y rápidamente tanto en ratones y seres humanos. Para la detección de la enfermedad pulmonar en ratones, un objetivo im...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gas Chromatograph	Inficon	Micro GC Model 3000A	Agilent makes a comparable model
18 G Luer stub needle	Becton Dickenson		Several other possible vendors
3 ml plastic syringe	Becton Dickenson		Several other possible vendors
Polypropylene gas sample bags	SKC	1 or 2 L capacity works well	Other gas tight bags will work well
Gas tank, 0.3% Ne, 0.3% CO, balance air; (size ME)	Airgas, Inc	Z04 NI785ME3012	This is the standard mixture used for DLCO in humans
25 TCID50/mouse of influenza virus A/PR8 diluted in phosphate buffered saline.
Porcine pancreatic elastase	Elastin Products, Owensville, MO		5.4 U
Bleomycin	APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL		0.25 U
Escherichia coli LPS	Sigma L2880		3 μg/g body weight; O55:B5
Aspergillus fumigatus (isolate Af293) conidia were collected from mature colonies grown on potato dextrose agar.