表型鼠标肺功能<em&gt;在体内</em&gt;与肺弥散功能

摘要

We describe a means to quickly and simply measure the lung diffusing capacity in mice and show that it is sufficiently sensitive to phenotype changes in multiple common lung pathologies. This metric thus brings direct translational relevance to the mouse models, since diffusing capacity is also easily measured in humans.

摘要

鼠标是目前用于模拟各种肺部疾病的主要动物。研究背后等病理机制，能够量化的病理改变是需要的表型的方法。此外，以提供平移的相关性的小鼠模型中，这样的测量应测试，可以很容易地在人类和小鼠中进行。不幸的是，在本文献中很少的表型肺功能的测量直接适用于人类。一个例外是对一氧化碳，这是一种测量被定期在人中进行的弥散能力。在本报告中，我们描述了快速，简单地衡量这种扩散能力的小鼠的一种手段。该过程涉及简要肺膨胀与示踪气体麻醉小鼠，接着是1分钟的气体分析时间。我们已经测试了该方法的检测几个肺病理学，包括肺气肿，纤维化，急性肺损伤，和流感和能力真菌肺部感​​染，以及在年轻幼仔监测肺成熟。结果表明在所有的肺病理学显著下跌，以及增加漫射容量与肺成熟。肺弥散量这一测量从而提供了一个肺功能测试有其检测与大多数现有的病理肺模型的表型的结构性变化的能力具有广阔的应用。

引言

鼠标是目前用于模拟各种肺部疾病的主要动物。研究认为underly这样的病理机制，可以量化它的病理改变是需要的表型的方法。虽然有许多小鼠研究，其中通风力学测量，这些测量通常是无关的肺功能的标准评估在人类正常完成。这是不幸的，因为要执行在小鼠和人类受试者等效测量可以便于结果的翻译在小鼠模型与人类疾病的能力。

一种在人受试者中最常见的，并很容易地进行的测量的是一氧化碳（弥散^）1,2-扩散能力，但是这种测量只有很少在小鼠模型中进行。在那些已经报道^3-7的研究，没有出现过的后续研究中，部分是因为程序往往笨重，或者可以REQuire复杂的设备。另一种方法是在稳定状态下的系统，其具有能够测量CO扩散在有意识的小鼠的优点使用CO再呼吸方法。然而，这种方法非常麻烦，而且结果可以用鼠标的通风的水平以及O ₂和CO ₂浓度的^8,9而改变。这些困难似乎已经排除了常规使用弥散量来检测小鼠肺病理学的，尽管它的几个优点。

规避问题漫射小鼠容量的测定中，一个简单的装置的细节，以测量它在小鼠中最近已报道^10。该过程消除了快速采样体积等于整个灵感气体采样未被污染的肺泡气难的问题。这个过程的结果在一个非常可重复的测量，称为扩散系数为一氧化碳（DFCO），即到主机PA的敏感thologic变化在肺表型。因此DFCO计算为1 - （CO ₉ / CO _C）/（氖₉ /氖_c）中 ，其中c和9标是指注入的校准气体的浓度和后9秒屏气时间除去气体，分别。 DFCO是无量纲变量，0和1之间变化，其中1反映所有的CO完全吸收，而0反映无吸收的CO。

在这份报告中，我们展示了如何让这个弥散量的测量，以及如何可以用来记录变化，几乎所有现有的小鼠肺疾病模型，包括肺气肿，肝纤维化，急性肺损伤，以及病毒和真菌感染。

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研究方案

注:所有动物方案批准了约翰·霍普金斯大学动物护理和使用委员会。

1.动物准备

1. 制备6的C57BL / 6对照小鼠为DFCO测定，通过如以下步骤2.3中概述用氯胺酮和赛拉嗪麻醉它们。
2. 通过使用相同的程序作为用于控制准备的所有其他小鼠在表1所示的不同的肺病理学。建立这些模型需要的具体细节中找到相关的文献。对照小鼠和那些在其他病理队列都是6-12周龄。

2.测量扩散系数一氧化碳（DFCO）

1. 建立与机器供给至测量为氮，氧，氖，和一氧化碳峰的气相色谱仪模块。对于这个应用程序只使用霓虹灯和CO的数据。
   注:本仪器采用分子sieve柱以氦作为载气，用12.00微米膜，320.00微米ID和10米长。色谱仪柱具有0.8毫升的体积，但我们用来2毫升确保连接管与样品的充分清除。
2. 在每个实验日的开始之前，使得从小鼠的样品的测量结果，取2ml样品直接从含有大约0.5％的氖，0.5％的CO的气体混合物包，和平衡空气，并且使用该样本来校准气相色谱仪。
3. 麻醉小鼠用氯胺酮（90毫克/千克）和赛拉嗪（15毫克/千克），并由于没有反射运动的确认麻醉。取适量涂抹于眼睛兽医药膏，以防止干燥。 Tracheostomize的小鼠存根针管（18克成人或20G的非常年轻小鼠）。
   注:DFCO完成在麻醉后不到10分钟，并优先于任何机械通风或其他程序。
4. 在小鼠中大于6周龄，使用3毫升注射器吨ø撤回0.8毫升气体从气体混合物包。注射器连接到气管插管，迅速膨胀的肺。使用节拍器，算上9秒，然后迅速撤回0.8毫升（呼出的空气）。
5. 淡化这种撤回0.8毫升呼出的空气〜2毫升室内空气，让它休息至少15秒。然后注入整个样品注入气相色谱仪进行分析。
6. 在分析该第一DFCO样品，膨胀的小鼠肺与第二0.8毫升从气体混合物包，然后处理该样品与第一样品。平均两个DFCO测量。
   注:有关小鼠年仅2周龄时测量，用0.4毫升的体积，因为0.8毫升过大的体积，使测量非常年轻小鼠的肺部。最好是使用0.8毫升体积超过6周小鼠，而且如果是需要一些小鼠0.4毫升体积，应当一致地用于正在研究中的队列的所有小鼠。
7. 计算DFCO如1 - （CO ₉ / CO _C）/（氖₉ /氖_c）中 ，其中c和9标是指注入的校准气体的浓度，并分别经过9秒屏气时间除去气体。
8. 分析和比较用单向ANOVA差异和评估与Tukey的校正中的所有队列小鼠多重比较的显着性水平。考虑P <0.05为显著的价值。
   注意:所有在这里所用的小鼠是涉及肺通气，力学，肺灌洗，或组织学的几个后续测量，这未在此处报道的实验研究的一部分。此外，由于该方法是在所有的实验模型如在对照小鼠上面做了同样的，只能从各种病理模型的结果。这些模型的进一步信息呈现在补充表。
9. 安乐死的动物深anesthe抽动过量颈椎脱位或斩首。在需要的地方，从死老鼠进一步生物或组织学处理和分析取出肺细胞和/或组织。

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结果

图1示出了从成年小鼠在组A，B，C，D，E和F的DFCO测量有显著下跌同时与曲霉属和流行性感冒感染，以及在纤维化，气肿显著减少，急性肺损伤的模型。 图2示出在DFCO随时间小鼠年龄2-6周的G组的发展变化。有轻微但显著增加与肺发育超过这个时间过程。使用较小的膨胀体积的效果也是在6周的时间点相当明显。有对女性具有稍高DFCO的倾向，但是这只是在5周时间点显著。

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讨论

在目前的工作中，我们定义了一个新的指标来量化小鼠肺的气体交换能力。这个度量类似于扩散能力，临床上常见的测量，其测量肺的主要功能，也就是它的交换气体的能力。扩散能力是唯一的肺功能测量，可以在小鼠和人类可容易且快速地进行。对于肺部疾病的小鼠的检测中，一个主要的目的是量化控制和实验队列之间肺功能的变化。为了实现这一目标，我们已经定义和使用的DFCO展示quanitfying?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gas Chromatograph	Inficon	Micro GC Model 3000A	Agilent makes a comparable model
18 G Luer stub needle	Becton Dickenson		Several other possible vendors
3 ml plastic syringe	Becton Dickenson		Several other possible vendors
Polypropylene gas sample bags	SKC	1 or 2 L capacity works well	Other gas tight bags will work well
Gas tank, 0.3% Ne, 0.3% CO, balance air; (size ME)	Airgas, Inc	Z04 NI785ME3012	This is the standard mixture used for DLCO in humans
25 TCID50/mouse of influenza virus A/PR8 diluted in phosphate buffered saline.
Porcine pancreatic elastase	Elastin Products, Owensville, MO		5.4 U
Bleomycin	APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL		0.25 U
Escherichia coli LPS	Sigma L2880		3 μg/g body weight; O55:B5
Aspergillus fumigatus (isolate Af293) conidia were collected from mature colonies grown on potato dextrose agar.