פונקצית phenotyping עכבר ריאתי<em&gt; In vivo</em&gt; עם קיבולת הריאות לשדר

Summary

We describe a means to quickly and simply measure the lung diffusing capacity in mice and show that it is sufficiently sensitive to phenotype changes in multiple common lung pathologies. This metric thus brings direct translational relevance to the mouse models, since diffusing capacity is also easily measured in humans.

Abstract

העכבר הוא עכשיו בעלי החיים העיקריים המשמשים למודל מגוון של מחלות ריאה. כדי לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס פתולוגיות כגון, יש צורך בשיטות פנוטיפי שיכול לכמת את השינויים פתולוגיים. יתר על כן, על מנת לספק את הרלוונטיות translational למודלים של העכברים, מדידות מסוג זה צריכה להיות בדיקות שיכולים להיעשות בקלות בבני האדם ועכברים. למרבה הצער, בספרות בהווה יש לי כמה מדידות פנוטיפי של תפקוד ריאות יישום ישיר לבני אדם. חריג היחיד הוא היכולת לשדר לפחמן חד חמצני, שהוא מדידה שנעשית באופן שיגרתי בבני אדם. בדו"ח הנוכחי, אנו מתארים אמצעים למדידת יכולת לשדר את זה בעכברים במהירות ובפשטות. ההליך כרוך אינפלציה קצרה ריאות עם גזים נותב בעכבר הרדים, ואחרי זמן ניתוח גז 1 דקות. בדקנו את היכולת של שיטה זו כדי לזהות כמה פתולוגיות ריאה, כולל אמפיזמה, סיסטיק, פציעת ריאות חריפה, ושפעת וזיהומים פטרייתיים ריאות, כמו גם התבגרות ריאה ניטור בגורים צעירים. תוצאות מראות ירידה משמעותית בכל פתולוגיות הריאות, כמו גם עלייה ביכולת לשדר עם התבגרות ריאה. מדידה זו של קיבולת לשדר ריאות ובכך מספקת בדיקת תפקוד ריאתי שיש לו בקשה רחבה עם היכולת שלה לזהות שינויים מבניים פנוטיפי עם רוב דגמי ריאות פתולוגיים הקיימים.

Introduction

העכבר הוא עכשיו בעלי החיים העיקריים המשמשים למודל מגוון של מחלות ריאה. כדי לחקור את המנגנונים שנמצאים בבסיס פתולוגיות כגון, יש צורך בשיטות פנוטיפי שיכול לכמת את זה שינויים פתולוגיים. למרות שיש מחקרים רבים שבם עכבר מכניקת אוורור נמדדות, מדידות אלה הן בדרך כלל אינן קשורות להערכות סטנדרטי של תפקוד הריאתי נעשו בדרך כלל בבני אדם. זה מצער, שכן היכולת לבצע מדידות מקבילות בעכברים ובני אדם עשוי להקל על התרגום של תוצאות במודלים של עכברים למחלות בבני אדם.

אחת המדידות הנפוצות ביותר ונעשו בקלות בבני אדם הוא היכולת לשדר לפחמן חד חמצני (DLCO) ^1,2, אך מדידה זו כמעט ולא נעשתה רק במודלים של עכברים. באותם מחקרים שבם זה כבר דווח ^3-7, לא חלו מחקרי מעקב, בין שאר משום שהנהלים הם לעתים קרובות מסורבלים או עשוי require ציוד מורכב. גישה נוספת היא להשתמש בשיטה CO rebreathing במערכת במצב יציבה, שבו יש את היתרון של להיות מסוגל למדוד דיפוזיה CO בעכברים מודעים. עם זאת שיטה זו היא מסורבלת מאוד, ותוצאות יכולות להשתנות עם רמת האוורור של העכבר כמו גם O ₂ ו- CO ₂ ריכוזים ^8,9. קשיים אלה נראים שמנעו שימוש שיגרתי בלשדר יכולת לזהות פתולוגיות ריאות בעכברים, למרות כמה יתרונות משלה.

כדי לעקוף בעיות עם מדידה של קיבולת לשדר בעכברים, פרטים של אמצעים פשוטים למדוד את זה בעכברים כבר דיווח לאחרונה ^10. ההליך מבטל את הבעיה הקשה של דגימת גז alveolar שאינו נגוע בדגימת נפח שווה לגז ההשראה כל מהירות. תוצאות הליך זה במדידה מאוד לשחזור, כינו את גורם דיפוזיה לפחמן חד חמצני (DFCO), כי הוא רגיש למארח של הרשות הפלסטיניתשינויי thologic בפנוטיפ הריאות. DFCO מחושב כך כ1 - (CO ₉ / CO _ג) / (Ne ₉ / Ne _ג), שבו ג ו9 התחתיים מתייחסים לריכוזים של גזי הכיול המוזרקים והגזים הוסרו לאחר זמן לעצור את נשימת 9 שניות, בהתאמה. DFCO הוא משתנה ממדים, אשר משתנה בין 0 ל -1, כאשר 1 משקף ספיגה של כל CO מלא, ומשקפים 0 אין ספיגה של CO.

במצגת זו אנו מראים כיצד לבצע מדידת קיבולת לשדר זה, וכיצד ניתן להשתמש בו כדי לתעד שינויים כמעט בכל האחד מהמודלים הקיימים ריאות עכבר המחלה, כולל אמפיזמה, ציסטיק, פציעת ריאות חריפה, וזיהומים נגיפיים ופטריות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: כל פרוטוקולי בעלי החיים אושרו על ידי ועדת אוניברסיטת הטיפול בבעלי חיים והשימוש בג'ונס הופקינס.

1. הכנת בעלי החיים

1. הכן עכברי 6 C57BL / 6 שליטה למדידת DFCO, על ידי הרדמתם עם קטמין וxylazine כפי שמתוארת בשלב 2.3 להלן.
2. הכן את כל עכברים האחרים עם פתולוגיות ריאות השונות מוצגות בטבלה 1 על ידי שימוש באותו הליך כלבקרה. פרטים ספציפיים הנחוצים להקמה כל אחד ממודלים אלה נמצאים באזכור הרלוונטי. עכברי בקרה ואלה בקבוצות פתולוגיים האחרות הם כל 6-12 השבועות של גיל.

2. מדידה של פקטור Diffusion לפחמן חד חמצני (DFCO)

1. להגדיר את מודול כרומטוגרף גז המסופק עם המכשיר למדידת פסגות לחנקן, חמצן, ניאון, ופחמן חד חמצני. לשימוש ביישום זה רק את נתוני הניאון וCO.
   הערה: מכשיר זה משתמש בs מולקולריתטור ieve עם הליום כגז מוביל, עם 12.00 מיקרומטר סרט, מזהה מיקרומטר 320.00 ו -10 מ 'אורך. יש עמודת כרומטוגרף נפח של 0.8 מיליליטר, אבל השתמשנו 2 מיליליטר כדי להבטיח סליקה נאותה של צינורות חיבור עם המדגם.
2. בתחילתו של כל יום ניסיוני, לפני ביצוע מדידות של דגימות מהעכברים, לקחת דגימת 2 מיליליטר ישירות משקית תערובת גז המכילה כ -0.5% Ne, CO 0.5%, ולאזן אוויר, ולהשתמש במדגם זה לכייל גז כרומטוגרף.
3. הרדימי עכברים עם קטמין (90 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (15 מ"ג / קילוגרם), ולאשר הרדמה על ידי היעדר תנועת רפלקס. החל משחה טרינריים המשפיעה על העיניים כדי למנוע יובש. Tracheostomize עכברים עם צינורית מחט בדל (18 G במבוגרים או 20 G בעכברים צעירים מאוד).
   הערה: DFCO הושלם בתוך פחות מ -10 דקות לאחר הרדמה ולפני כל הנשמה מלאכותית או הליכים אחרים.
4. בעכברים יותר מ -6 שבועות של גיל, השתמש t מזרק 3 מיליליטרo לסגת 0.8 מיליליטר של גז משקית תערובת גז. חבר את המזרק לצינורית לקנה הנשימה ולנפח את הריאות במהירות. שימוש במטרונום, לספור 9 שניות, ולאחר מכן במהירות למשוך את 0.8 מיליליטר (אוויר ננשף).
5. לדלל 0.8 מיליליטר למשיכה זו נשף אוויר עד 2 מיליליטר עם אוויר חדר, לאפשר לו לנוח לפחות 15 שניות. אז להזריק את כל המדגם לגז כרומטוגרף לניתוח.
6. תוך ניתוח מדגם DFCO הראשון, לנפח את ריאות עכבר עם 0.8 מיליליטר שני משקית תערובת גז, ולאחר מכן לעבד מדגם זה זהה למדגם הראשון. ממוצע שתי מדידות DFCO.
   הערה: למדידות בעכברים צעירים כמו 2 שבועות של גיל, השתמש בהיקף של 0.4 מיליליטר, מאז 0.8 מיליליטר גדול מדי נפח לבצע מדידות בריאות של עכברים צעירים מאוד. עדיף להשתמש בנפח 0.8 מיליליטר לעכברים מבוגרים מ -6 שבועות, ושאם יש צורך בנפח 0.4 מ"ל לכמה עכברים, יש להשתמש בו באופן עקבי לכל העכברים בקבוצה הנחקרים.
7. לחשב DFCOכ1 - (CO ₉ / CO _ג) / (Ne _{9 ג} / Ne), שבו subscripts ג ו9 מתייחס לריכוזים של גזי הכיול המוזרקים והגזים הוסרו לאחר זמן לעצור את נשימת 9 שניות, בהתאמה.
8. לנתח ולהשוות הבדלים עם ANOVA חד-כיווני ולהעריך את הרמה מובהקת עם התיקון של Tukey להשוואות מרובות בכל עכברי העוקבה. שקול p <0.05 ערך משמעותי כ.
   הערה: כל העכברים משמשים כאן היה חלק ממחקרי ניסויים מעורבים מספר מדידות עוקבות של אוורור ריאות, מכניקה, שטיפת ריאות, או היסטולוגיה, אשר אינן מדווחות כאן. בנוסף, מאז השיטה היא זהה בכל הדגמים הניסיוניים כפי שנעשה לעיל בעכברי השליטה, רק התוצאות מדגמי פתולוגיים השונים מוצגות. מידע נוסף על דגמים אלה מוצג בטבלה משלימה.
9. להרדים בעלי החיים על ידי anesthe העמוקמנת יתר של טיקים ואחריו נקע או עריפת ראש צוואר רחם. במידת צורך, להסיר את תאי ריאה ו / או רקמות מהעכברים המתים עבור ביולוגי נוספים או עיבוד היסטולוגית וניתוח.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

איור 1 מציג את מדידות DFCO מהעכברים הבוגרים בקבוצות A, B, C, D, E, ופ היו ירידה משמעותית בשני זיהומי אספרגילוס ושפעת, כמו גם לירידה משמעותית בfibrotic, emphysematous, ואקוטי מודלים פציעת ריאות. איור 2 מראה את השינויים בקבוצה G התפתחותיים בDFCO לאורך זמן כמו עכברים מגיל 2-6...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בעבודה הנוכחית, שהגדרנו מדד חדש לכמת את יכולת גז החלפה של ריאות העכבר. מדד זה מקביל ליכולת לשדר, מדידה קלינית נפוצה המודדת את התפקיד העיקרי של הריאות, כלומר, יכולתו להחליף גז. היכולת לשדר היא מדידת הריאות רק פונקציונלית, כי יכול לעשות זאת בקלות ובמהירות בשני עכברים ובנ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gas Chromatograph	Inficon	Micro GC Model 3000A	Agilent makes a comparable model
18 G Luer stub needle	Becton Dickenson		Several other possible vendors
3 ml plastic syringe	Becton Dickenson		Several other possible vendors
Polypropylene gas sample bags	SKC	1 or 2 L capacity works well	Other gas tight bags will work well
Gas tank, 0.3% Ne, 0.3% CO, balance air; (size ME)	Airgas, Inc	Z04 NI785ME3012	This is the standard mixture used for DLCO in humans
25 TCID50/mouse of influenza virus A/PR8 diluted in phosphate buffered saline.
Porcine pancreatic elastase	Elastin Products, Owensville, MO		5.4 U
Bleomycin	APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL		0.25 U
Escherichia coli LPS	Sigma L2880		3 μg/g body weight; O55:B5
Aspergillus fumigatus (isolate Af293) conidia were collected from mature colonies grown on potato dextrose agar.