تطوير<em&gt; في المختبر</em&gt; نظام نموذجي لدراسة تفاعل<em&gt; ايكوس</em&gt;<em&gt; الحصانية</em&gt; إيج مع مستقبلات لها عالية تقارب FcεRI

Summary

The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine FcεRIα gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.

Abstract

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (FcεRI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and FcεRI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine FcεRIα was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine α-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat β- and γ-chains ¹. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine FcεRIα transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using β-hexosaminidase release as a readout ^{2, 3}. Mediator release peaked at 36.68% ± 4.88% at 100 ng ml^-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses ^{4, 5}. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease ^{6, 2, 3}.

Introduction

وقد عرفت الحساسية لآلاف السنين. ووصف علاج الربو في النص الطبية المصرية القديمة المعروفة باسم بردية إبيرس (~ 1550 قبل الميلاد) وناقش العلاجات العشبية لعلاج النتيجة ^7.

وتصنف الحساسية اليوم كرد فعل فرط الحساسية من النوع الأول، حيث T نوع من الخلايا المساعد 2 (TH ₂₎ ذراع الجهاز المناعي يرسم إنتاج الغلوبولين المناعي E (IgE و) الأضداد استجابة لمستضدات البيئية تسمى المواد المسببة للحساسية. هذه هي المواد المتنوعة التي تتفاعل عادة مع الخلايا في جهاز المناعة، وتحفيز تخليق وإفراز السيتوكينات الموالية للالتهابات، بما في ذلك انترلوكين 4 وانترلوكين 13 ^{8، 9} كما لم الجسيمات في دخان السجائر أو جزيئات عادم الديزل التي تعزز إيج التوليف ^10.

ويعزى الارتفاع في مظاهر الحساسية في البلدان الصناعية في السنوات ال 50 الماضية لمزيج من تأثيرالملوثات البيئية والاتجاه إلى بيئة أكثر مطهرة، والتي تتضافر لتحول الاستجابة المناعية تجاه لمحة سادت قبل TH ₂ السيتوكينات، على النحو الذي اقترحه "فرضية النظافة" ^11.

كما ذكر أعلاه، والبشر ليسوا الثدييات الوحيدة التي تعاني من الحساسية. وخاصة الخيول والكلاب ويمكن أيضا تطوير استجابات حساسية الكلاسيكية وأظهرت دراسة أجرتها أن ^12، كما هو الحال في البشر، ويعزى الحساسية الخيول إلى العوامل الوراثية والبيئية. ونتيجة لذلك، فإن هذه الحيوانات تمثل نماذج جيدة لدراسة التفاعل بين الأسباب الوراثية والبيئية للحساسية، تقدمه من توعية لمرض، واستراتيجيات التدخل الممكنة مرة واحدة وضعت في المظاهر السريرية

في عام 1887، كان أول شخص Stömmer لوصف التشابه بين الإنسان والربو الخيلي ^13، وتأثير الهستامين على نظام القلب والأوعية الدموية الخيول هومشابهة جدا لتلك التي للبشر ^14. الخيول هي أيضا حجر الزاوية في صناعة سباقات الخيل، الذي يستحق 72 مليار دولار مع الرهان دوران من 115 مليار دولار سنويا ^15.

معظم خيول السباق المعاصرة هي من نسل عدد قليل من الخيول العربية ولدت من قبل السيدة آن بلنت من عام 1878 فصاعدا. والفطرية السباق الحديثة عادة لتحديد لقدرات الأداء. هم عرضة للاضطرابات وراثية، واحدة منها هي قابليتها لتركيب استجابات حساسية. لديهم أيضا 1000 مرة أعلى من المصل مستويات إيج حتى الأكثر حساسية شديدة البشر ^16. وعادة ما تتجلى الحصان استجابات حساسية مثل فرط الحساسية لدغة حشرة (IBH) ^{17، 18.} IBH النتائج في التهاب الجلد بسبب لدغات الحشرات تشكل في جنس البعضوضيات. شكل آخر من أمراض الحساسية الخيول هو انسداد لمجرى الهواء المتكررة (راو)، وهذا يتجلى في الرئتين والشعب الهوائية. ويتميز هذا الصفير ومختبرored التنفس. راو يحدث عادة استجابة لجراثيم العفن، وسجلت حساسية عالية خاصة بمستويات IgE في الخيول التي تعاني من راو في دراسة واحدة ¹⁹ على الرغم من تحقيق آخر لم يؤكد هذا ^20.

تدور دراسات عن حساسية الخيول حول محاولة لرصد وتحييد الخيول إيج من خلال تطوير إيج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة للالفروسية (MABS) ^{21، 22.} وعلاوة على ذلك الدراسة بنسبة ²³ تناقش إنتاج المجالات خارج الخلية من α من الخيول عالية تقارب-FC مستقبلات ل سلسلة (FcεRIα) مستقبلات في محاولة لكشف وquantitate مصل الخيول إيج. تناقش دراسة ذلك من قبل لدين ²⁴ نهج جديد يهدف إلى تحييد إيج المصل بواسطة فتيلة الجهاز المناعي باستخدام مستمنع الذات / غير المتمتعة بالحكم الذاتي. كل هذه الدراسات، ومع ذلك، تفتقر مقايسة فعالة لاختبار سلامة وفعالية بروتوكولاتها. في هذه المقالة، ونحن الآن تقديم مثل هذا الفحص SYSتيم ينطبق على دراسة الاستراتيجيات التشخيصية والعلاجية ذات الصلة لنظام الفروسية، حيث الإفراج β-هيكسوزامينيداز، كمؤشر الوسيط خلية تحبب، تم تقييمها على الخلايا ربل-2H3.1 معربا عن فرسي FcεRIα. ويعتمد هذا البروتوكول على المنشورات السابقة ^{25، 4، 5، 2، 3} اصفا الهندسة خلايا RBL transfected مع الجينات ترميز المجال الجلوبيولين ملزمة لمستقبلات عالية تقارب لفريق الخبراء الحكومي الدولي من مختلف الأنواع. ويوضح البروتوكول كيفية تنفيذ بيان فحص β-هيكسوزامينيداز، وتعرض نتائج التي كما يعني ± الانحراف المعياري للتجارب ثلاث نسخ.

وقد تم تطوير هذا الفحص من خلال إطلاق أول Siraganian وهوك ²⁵ لدراسة الحساسية الإنسان. كما وضعت المجموعة المختبر بقيادة الدكتور روبن Siraganian خط الخلية ربل. وقد وضعت هذه الخلايا ربل للتعبير عن FcεRIα البشرية ونشر بروتوكول بنسبة ^4. الجزء الاخيروجاء الفحص مع وضع البلازميد ايندهوفن في الورقة التي نويبيرغر ²⁶ التي وصفت إنتاج من الأجسام المضادة عن طريق الاستنساخ في سلسلة الجينات الثقيلة الخارجة من الجين الماوس لمنطقة متغيرة إيج التي تستهدف ناشبة 4-هيدروكسي-3 -nitro-phenacetyl (NP)، فإن الأجسام المضادة الناتجة خيالية وظيفية بالكامل. القدرة على تطوير أي فريق الخبراء الحكومي الدولي التي تستهدف نفس ناشبة، بينما الاستنساخ أيضا مستقبلات على سطح الخلايا ربل أدى إلى توحيد الفحص مما يجعل من بروتوكول مفيد لقياس تحبب الخلايا قعدة.

مقايسة لديه إيجابيات وسلبيات. الايجابيات من الفحص هو قدرتها على التكيف لاستخدامها في أي نظام الثدييات، وبالتالي تستخدم المختبر لاختبار للتحبب في النظم البشرية والكلاب والخيول، وهذا أمر يمكن تحقيقه ببساطة عن طريق تجميع فريق الخبراء الحكومي الدولي الكائن الحي واستنساخ مستقبله على سطح الخلايا ربل.

من ناحية أخرى،سلبيات الفحص هو أن خلايا RBL حساسة جدا للتغيرات الحرارية والميكانيكية ودرجة الحموضة، مما يجعلها تعطي تباين مستويات تحبب داخل نفس الفحص. وبالتالي ينصح بشدة أن المقايسات وتتكرر دائما في يثلث ثم يؤخذ بمعدل منها. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا ربل تميل إلى التحول نحو النمط الظاهري غير الإفراج إذا ما تركت في زراعة الأنسجة لمرات طويلة (> 10 أسبوعا) ^27، مما يجعل صيانتها مرهقة. هم أيضا عرضة للعدوى من البكتيريا الميكوبلازما، والتي هي غير مرئية من الضوء والمجهر لا تغيير مورفولوجيا الخلية، ولكن من شأنه أن يغير بشكل جذري مستويات تحبب لهم. وبالتالي هناك حاجة إلى اختبارات الميكوبلازما العادية.

Protocol

1) إعداد الخط الخلوي:

1. تطوير خط الخلية ربل-2H3.1 معربا عن α FcεRI الفروسية:
   1. باستخدام تقنيات زراعة الأنسجة الأساسية للخطوط الخلايا أحادي الطبقة، بالنقل خلايا RBL-2H3.1 الأبوية استخدام البلازميد pEE6، تحمل الجين FcεRIα الخيول (بنك الجينات: Y18204.1) ^28. إضافة 2 ميكروغرام ميكرولتر ^-1 من DNA البلازميد إلى 0.8 مل من الخلايا في مناطق ذات كثافة من 1.2 X10 ⁷ خلايا مل ^-1. Electroporate الخلايا في 250 V 960 μF باستخدام 0.4 سم electrocuvette ثم احتضان فورا على الجليد لمدة 10 دقيقة.
   2. تحديد الخلايا تحولت باستخدام وسائل الإعلام التي تحتوي على 0.4 غرام من كبريتات geneticin G418، ثم فرز ما تبقى الخلايا الحية من خلال نظام مراقبة الأصول الميدانية من خلال وضع علامات عليها مع فريق الخبراء الحكومي الدولي الأجسام المضادة الفلورسنت. استخدام الناتج ربل-2H3.1 معربا عن الخيول خط الخلية FcεRIα للتحقيق ^{2، 3.}
2. قبل فحص الأجسام المضادة للتوعية:
   الحصاد وربل-2H3.1 معربا عن الخلايا FcεRIα الخيول من طبق بتري متموجة. يغسل ثم اعادة تعليق الخلايا في وسائل الإعلام ثقافة لكثافة خلية من الخلايا 5X10 ⁵ مل ^-1.
   1. إضافة إيج تهم الخلايا علقت لتركيز النهائي من 1 نانوغرام مل ^-1، ثم لوحة 100 ميكرولتر من الخلايا على 96 لوحة جيدا في الأعمدة 1-6 واحتضان عند 37 درجة مئوية + 5٪ CO ₂ + 90٪ الرطوبة النسبية لمدة 16 ساعة. بعد فترة الحضانة، وقبل إجراء الفحص الإفراج، والتحقق من الآبار تحت المجهر لconfluency جيدا والتقيد الخلية.

2) بيان الفحص:

1. غسل الخلايا:
   1. الإفراج الدافئ عازلة (25 ملم أنابيب، 120 ملي كلوريد الصوديوم، كلوريد البوتاسيوم 5 ملم، 0.04 ملم كلوريد المغنيسيوم وكلوريد الكالسيوم 1 ملم) عند 37 درجة مئوية للسماح للغسيل خلية لطيف.
   2. غسل الخلايا عن طريق التحريك لوحة لإزالة خلية الإعلام وإضافة 100 ميكرولتر الحارة 37 درجة مئوية، عازلة الإصدار. كرر مرتين.
2. التحدي مستضد:
   1. إعداد التخفيف التسلسلي للمستضد (NIP-HSA أو إدارة التخطيط الوطني-HSA) 0 نانوغرام مل ^-1، 0.1 نانوغرام مل ^-1، 1 نانوغرام مل ^-1، 10 نانوغرام مل ^-1، 100 نانوغرام مل ^-1، 1000 نانوغرام مل ^-1، 10000 نانوغرام مل ^-1 في المخزن الإفراج ودافئة عند 37 درجة مئوية.
   2. بعد غسل الخلية الثانية، تجاهل وسائل الإعلام واستبدالها مع 100 ميكرولتر من الحلول مستضد. ضمان آبار في نفس الصف (A1-6 على سبيل المثال) لديها تركيز المستضد نفسه إضافتها.
   3. إنشاء سيطرة سلبية في الصف وذلك بإضافة 0 نانوغرام مستضد ^-1 مل. إضافة زيادة تركيز المستضد أسفل الصفوف (BG)، يليه تريتون X-عازلة (5٪ تريتون X-100) في H خلايا الصف لليز الخلايا لاستخدامها كعنصر تحكم إيجابية. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للسماح للخلايا لاطلاق سراح الوسطاء لها.
3. وضع الضوابط جيدا الفردية:
   1. بعد الحضانة، ونقل 50 ميكرولتر من طاف الخلية إلى النصف الآخر من لوحة (الآبار A1-6 A7-12 إلى الآبار، وغيرها). تجاهل 50 ميكرولتر المتبقية من طاف واستبدالها مع 50 ميكرولتر من تريتون X-عازلة للسماح بقياس كمية من الوسطاء أفرج عنه في كل بئر في الأعمدة 7-12 كنسبة مئوية من إجمالي الوسطاء داخل الخلايا في العمود 1-6 .
4. الركيزة انزيم:
5. إضافة 50 ميكرولتر من الركيزة β-هيكسوزامينيداز (50 ملي 4-nitrophenyl N-أسيتيل-β-D-glucosaminide أعد DMSO المخفف الى 2 مم عن طريق إضافته إلى عازلة سترات 0.2 M حمض الستريك و 0.2 M خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 4.5) لجميع الآبار لتسهيل تحويل الركيزة ل4-نيتروفينول بواسطة انزيم β-هيكسوزامينيداز. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.

5. إنهاء رد فعل:
   1. وقف رد فعل من قبل مضيفا 150 ميكرولتر تريس العازلة (1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 9) إلى كل جانب من درجة الحموضة العالية العازلة يتوقف رد الفعل، ويحول نيتروفينول 4 إلى اللون الأصفر.
6. قراءة وتحليل النتائج:
   1. قراءة لوحة باستخدام لوحة معمل في 405 نانومتر لقياس الامتصاصية من اللون الأصفر. تحسب النسبة المئوية للصدر β-هيكسوزامينيداز باستخدام الصيغة التالية:

2. تطبيق هذه الصيغة على كل بئر، وبعد ذلك يؤخذ في المتوسط ​​لكل صف. A1 و A7 يمثل الموقع من الآبار في 96 لوحة جيدا. رسم بياني لنسبة الإفراج β-هيكسوزامينيداز (وهو ما يعادل إجمالي الإفراج الوسيط) ضد هبوطNST تركيز المستضد ^{2، 3.}

النتائج

تمت توعية الخلايا ربل-2H3.1 الأبوية وتلك transfected مع والخيول FcεRIα مستقبلات الجينات أولا مع الماوس فريق الخبراء الحكومي الدولي لمكافحة DNP-HSA وتحدى مع المستضد إدارة التخطيط الوطني، هائل سعيد أنعم. الماوس إيج تربط لمستقبلات الفئران الذاتية في كل من خطوط الخلايا وبالتالي تقو...

Discussion

في ملخص أظهرت نتائج هذا التحقيق أنه عندما يتم توعية خلايا RBL-2H3.1 معربا عن FcεRIα مع فرسي فرسي إيج وتحدى من قبل المستضد، فإنها تعطي بيان الذروة سيط 36.68٪ ± 4.88٪ من المبلغ الإجمالي الوسيط داخل الخلايا، مقارنة مع ربل-2H3.1 الخلايا الأبوية لا تعبر عن فرسي FcεRIα.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα	-	-	Produced in the lab
Equine IgE anti NIP-HSA	-	-	Produced in the lab
96 Well Plate	Sigma	CLS3595	-
Multi Channel Pipette	Anachem	-	-
Incubator	Galaxy R	-	-
4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid	Cambridge Research Biochemicals	N-1070-1	NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab
Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin	Sigma	A6661	Abbreviated DNP-HSA
Plate Spectrophotometer	Anthos Labtec HT2	-	-
Pipes	Sigma	P1851	-
Sodium Chloride	Sigma	S7653	-
Potassium Chloride	Sigma	P9333	-
Magnesium Chloride	Sigma	M2670	-
Calcium Chloride	Sigma	C1016	-
Triton x100	Sigma	X100	-
4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide	Sigma	N9376	Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D2650	-
Citric Acid	Sigma	251275	-
Sodium Acetate	Sigma	S7670	-
Tris	Sigma	T5941	-