Разработка<em&gt; В пробирке</em&gt; Модельной системой для изучения взаимодействия<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE с рецептором с высоким сродством FcεRI

Резюме

The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine FcεRIα gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.

Аннотация

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (FcεRI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and FcεRI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine FcεRIα was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine α-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat β- and γ-chains ¹. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine FcεRIα transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using β-hexosaminidase release as a readout ^{2, 3}. Mediator release peaked at 36.68% ± 4.88% at 100 ng ml^-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses ^{4, 5}. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease ^{6, 2, 3}.

Введение

Аллергия, как известно, на протяжении тысячелетий. Лечение астмы был описан в древнеегипетской медицинского текста, известного как папирусе Эберса (~ 1550 г. до н.э.) и обсудили трав для лечения его ^7.

Сегодня аллергии классифицируется как ответ гиперчувствительности типа I, где Т хелперов типа 2 (TH ₂₎ рычаг иммунной системы бычков производство иммуноглобулина Е (IgE) антител в ответ на антигены окружающей среды, называемых аллергенами. Эти различные вещества, которые обычно взаимодействуют с клетками иммунной системы и стимулируют синтез и секрецию провоспалительных цитокинов, в том числе интерлейкина-4 и интерлейкина-13 ^{8, 9,} как у частицы в сигаретном дыме или дизельное выхлопных частиц, которые усиливают синтез IgE ^10.

Рост аллергических проявлений в промышленно развитых странах в последние 50 лет было обусловлено сочетанием эффектазагрязнителями окружающей среды и тенденция к более облагороженная окружающей среды, сочетающие переложить иммунный ответ к профилю преобладали по ТН ₂ цитокинов, предложенные «гигиеническая гипотеза» ^11.

Как уже упоминалось выше, люди не единственные млекопитающие, страдающие аллергией. Примечательно лошади и собаки могут также развиваться классические аллергические реакции, а также исследование по ¹² показал, что, как и у людей, лошадей аллергия приписывается генетических и экологических факторов. Как следствие, эти животные представляют хорошие модели для изучения взаимосвязи между генетическими и экологическими причинами аллергии, ее развитие от чувствительности к болезни и возможных стратегий вмешательства, как только клинические проявления установили в

В 1887 году, Stömmer был первым человеком, чтобы описать сходство между человеком и лошадей астмы ^13, эффект гистамина на лошади сердечно-сосудистой системы являетсяочень похож на человека ^14. Лошади также краеугольным камнем скачки промышленности, которая стоит нам $ 72 млрд с оборотом ставок по US $ 115 млрд в год ^15.

Большинство современных спортивных лошадей являются потомками небольшого числа арабских лошадей разводят леди Энн Блант с 1878 года. Современные скаковых лошадей, как правило, инбредных выбрать для способностей производительности. Они склонны к генетических расстройств, одним из которых является их чувствительность к монтировать аллергические реакции. Они также имеют в 1000 раз выше сывороточных уровней IgE, чем даже наиболее сильно аллергия человека ^16. Верховая аллергические реакции, как правило, проявляется в виде укуса насекомого гиперчувствительности (IBH) ^{17, 18.} Результаты IBH в дерматита из-за укусов образуют насекомых в роду Culicoides. Другая форма лошадей аллергических заболеваний является рецидивирующие препятствия в дыхательных путях (РАО), это проявляется в легких и дыхательных путях. Она характеризуется хрипы и лабораторииORed дыхание. РАО обычно происходит в ответ на споры плесени, и высокие уровни IgE аллерген-специфическая были зафиксированы в лошадей, страдающих от РАО в одном исследовании ¹⁹ хотя новое расследование не подтвердило эту ^20.

Исследования лошадей аллергии вращалась вокруг попытки мониторинга и нейтрализующих лошадей IgE путем разработки анти-лошадей IgE моноклональных антител (моноклональные антитела,) ^{21, 22.} Кроме того, исследование, проведенное ²³ обсуждает производство внеклеточных доменов α лошадиный высоким сродством Fc рецептора цепь (FcεRIα) рецепторов в попытке обнаружить и количественного определения в сыворотке IgE лошадей. Связанный с этим исследование Ledin ²⁴ обсуждает новый подход, направленный на нейтрализацию сыворотке IgE путем заливки иммунную систему с помощью собственной / НЕСАМОУПРАВЛЯЮЩИХСЯ иммуногена. Все эти исследования, однако, отсутствует эффективная анализа для проверки безопасности и эффективности их протоколов. В этой статье, мы теперь представляем Такой анализ SYSма применимо к изучению диагностических и терапевтических стратегий, имеющих отношение к лошади системы, где β-гексозаминидазы релиз, в качестве индикатора клеток медиаторов дегрануляции, они были начислены на RBL-2H3.1 клеток, экспрессирующих лошадей FcεRIα. Этот протокол основан на предыдущих публикаций ^{25, 4, 5, 2, 3,} описывающих инженерии RBL клеток, трансфецированных геном, кодирующим связывающий домен IgE рецептора с высоким сродством к IgE из различных видов. Протокол объясняет, как выполнить анализе высвобождения β-гексозаминидазы, результаты которого представлены как среднее ± стандартное отклонение для трех экспериментов.

Релиз анализ был впервые разработан Siraganian и Хук ²⁵ для изучения аллергии человека. Лаборатория группа во главе с доктором Рувим Siraganian также разработал RBL клеточной линии. Эти RBL клетки были разработаны, чтобы выразить человеческую FcεRIα и протокол был опубликован ^4. Заключительная частьиз анализа пришли с развитием плазмиды ПСВ в работе Neuberger ^26, который, описанной производство антител IgE путем клонирования свою тяжелую цепь гена вниз по течению от мышиного гена для вариабельной области IgE, который нацелен на гаптен 4-гидрокси-3 нитро-phenacetyl (NP), в результате чего химерное антитело было полностью функциональной. Способность развивать любую IgE таргетинга то же гаптен, в то же время клонирования его рецептор на поверхности RBL клеток привело к стандартизации анализа, что делает его полезным протокол для измерения дегрануляцию базофилов клеток.

Анализ имеет плюсы и минусы. Профи из анализа является его адаптивность, которые будут использоваться в любой системе млекопитающих, наша лаборатория, таким образом, использовал его для проверки дегрануляции в человека, собак и лошадей систем, и это достижимо лишь путем синтеза IgE организма и клонирования его рецептор на поверхности клеток RBL.

С другой стороны,Недостатки анализа является то, что клетки RBL очень чувствительны к тепловых, механических и рН изменений, что делает их дать изменение уровней дегрануляции в пределах одной и той же тесте. Он, таким образом, настоятельно рекомендуется, что анализы всегда повторяется трижды, а затем берется среднее значение из них. Кроме того, RBL клетки, как правило, смещаются в сторону не-рилизинг фенотипа, если они остаются в культуре ткани в течение длительного времени (> 10 недель) ^27, что делает их обслуживание громоздкой. Они также склонны к инфекциям микоплазмой бактерий, которые не видны с помощью оптического микроскопа и не меняют морфологию ячейки, но кардинально изменить их уровни дегрануляции. Таким образом регулярные тесты микоплазмы необходимы.

протокол

1) Получение клеточной линии:

1. Разработка RBL-2H3.1 клеточную линию, выражающую лошадей FcεRI α:
   1. Использование основных методов культуры ткани для линий монослоя клеток, трансфекции родительских RBL-2H3.1 клеток с использованием плазмиды рЕЕ6, неся лошадиный ген FcεRIα (GenBank: Y18204.1) ^28. Добавить мкл 2 мкг ^-1 плазмидной ДНК в 0,8 мл клеток при плотности 1,2 x10 ⁷ клеток мл ^-1. Электропорации клетки при 250 В 960 мкФ с использованием 0,4 см electrocuvette затем сразу инкубировать на льду в течение 10 мин.
   2. Выберите трансформированных клеток с использованием средств массовой информации, содержащие 0,4 г сульфата генетицина G418, затем отсортировать оставшиеся живые клетки через FACS, помечая их флуоресцентным IgE антитела. Используйте полученную RBL-2H3.1 выражающее лошадей клеточной линии FcεRIα для расследования ^{2, 3.}
2. Предварительная проба антитела сенсибилизация:
   Урожай RBL-2H3.1 выражения лошадей FcεRIα клетки от сливной чашки Петри. Промыть затем повторно суспендирования клеток в культуральной среде до плотности клеток ^-1 5x10 ⁵ клеток мл.
   1. Добавьте IgE интерес взвешенных клеток в конечной концентрации 1 нг мл ^-1, то пластина 100 мкл клеток на 96-луночный планшет в столбцах 1-6, и инкубируют при температуре 37 ° С ± 5% CO ₂ + 90% относительной влажности в течение 16 ч. После инкубационного периода, и перед выполнением анализа высвобождения, проверить колодцы под микроскопом для а слияния и клеточной приверженности.

2) Анализ выпуска:

1. Стиральная клетки:
   1. Буфер Теплый выпуск (25 мм труб, 120 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида калия, 0,04 мМ хлорида магния и 1 мМ хлорида кальция) при 37 ° С, чтобы обеспечить осторожного промывания клеток.
   2. Вымойте клеток, щелкая пластину, чтобы удалить клеточную среду и добавлением 100 мкл теплой, 37 ° C, релиз буфер. Повторите два раза.
2. Антигена:
   1. Приготовьте серийное разведение антигена (NIP-HSA или DNP-HSA) в 0 нг мл ^-1, 0,1 нг мл ^-1, 1 нг мл ^-1, 10 нг мл ^-1, 100 нг мл ^-1, 1000 нг мл ^-1, 10000 нг мл ^-1 в буфере выпуска и тепло при 37 ° С.
   2. После второй промывки клеток, отбросить носитель и заменяют 100 мкл антигена решений. Убедитесь, что скважины в той же строке (A1-6 например) имеют одинаковую концентрацию антигена добавленную к ним.
   3. Настройка негативного контроля в строке А, добавив 0 нг мл ^-1 антиген. Добавить возрастающую концентрацию антигена вниз по строкам (BG) с последующим Triton-X-буфера (5% Тритон Х-100) в строки H клеток, чтобы лизировать клетки, которые будут использоваться в качестве положительного контроля. Инкубируют при 37 ° С в течение 20 мин, чтобы позволить клетки, чтобы освободить ее медиаторы.
3. Настройка отдельных элементов управления также:
   1. После инкубации передачи 50 мкл клеточного супернатанта к другой половине пластины (A1-6 скважин в скважинах A7-12 и т.д.). Отменить оставшиеся 50 мкл супернатанта и заменить с 50 мкл тритона-X буфера, чтобы позволить измерение количества выпущенных медиаторов в каждую лунку в колонках 7-12, как процент от общего объема медиаторов внутри клеток в колонке 1-6 ,
4. Фермент субстрата:
5. Добавить 50 мкл β-гексозаминидазы субстрата (50 мМ 4-нитрофенил N-ацетил-β-D-глюкозаминида подготовлен в ДМСО разбавляли до 2 мМ, добавляя его в цитратном буфере 0,2 М лимонной кислоты и 0,2 М ацетата натрия, рН 4,5) во все лунки, чтобы способствовало превращение субстрата в 4-нитрофенола в β-гексозаминидазы фермента. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение 2 часов.

5. Завершение реакции:
   1. Остановить реакцию, добавив в 150 мкл трис-буфера (1 М Трис-HCl, рН 9) в каждую лунку в качестве высоких рН буфера останавливает реакцию и превращает 4-нитрофенол в желтый цвет.
6. Чтение и анализ результатов:
   1. Read пластину с использованием планшет-спектрофотометре при длине волны 405 нм для измерения оптической плотности желтого цвета. Расчетное процентное содержание β-опубликованном гексозаминидазы, используя следующую формулу:

2. Применить эту формулу в каждую лунку, после чего берется среднее значение для каждой строки. A1 и A7 представляют расположение скважин в 96-луночный планшет. Показать график процент β-гексозаминидазы выпуска (что соответствует общей выпуска медиатора) AgaiНСТ антиген концентрация ^{2, 3.}

Результаты

Родительские RBL-2H3.1 клетки и те, трансфицируют с лошадиного гена рецептора FcεRIα были впервые сенсибилизированные мыши с IgE анти DNP-HSA и вызов с антигена DNP-HSA. Мышь IgE связывается с эндогенным рецептором крыс в обеих клеточных линий и, таким образом, действует в качестве контроля для провер?...

Обсуждение

В целом результаты этого исследования показали, что, когда RBL-2H3.1 клетки, экспрессирующие лошадей FcεRIα были осведомлены с лошади IgE и оспорены антигена, они дают пик высвобождения медиаторов из 36,68% ± 4,88% от общего количества медиатора внутри клетки, по сравнению с RBL-2H3.1 родительские клет?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα	-	-	Produced in the lab
Equine IgE anti NIP-HSA	-	-	Produced in the lab
96 Well Plate	Sigma	CLS3595	-
Multi Channel Pipette	Anachem	-	-
Incubator	Galaxy R	-	-
4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid	Cambridge Research Biochemicals	N-1070-1	NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab
Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin	Sigma	A6661	Abbreviated DNP-HSA
Plate Spectrophotometer	Anthos Labtec HT2	-	-
Pipes	Sigma	P1851	-
Sodium Chloride	Sigma	S7653	-
Potassium Chloride	Sigma	P9333	-
Magnesium Chloride	Sigma	M2670	-
Calcium Chloride	Sigma	C1016	-
Triton x100	Sigma	X100	-
4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide	Sigma	N9376	Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D2650	-
Citric Acid	Sigma	251275	-
Sodium Acetate	Sigma	S7670	-
Tris	Sigma	T5941	-