أداء تحت الشبكية الحقن في القوارض لتسليم خلايا الظهارة الصبغية الشبكية في تعليق

Summary

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Abstract

تحويل الضوء إلى نبضات كهربائية يحدث في شبكية العين الخارجي ويتم إنجاز إلى حد كبير قضيب ومخروط المستقبلات الضوئية في شبكية العين والظهارة الصبغية (RPE) الخلايا. RPE تقديم الدعم الحاسم لخلايا مستقبلة للضوء وفاة أو خلل في الخلايا RPE هو سمة من-الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD)، والسبب الرئيسي لفقدان البصر الدائم في الناس سن 55 فما فوق. في حين لم يتم التعرف على علاج لAMD، زرع RPE صحي في عيون المريضة قد يثبت أنه علاج فعال، وأعداد كبيرة من الخلايا RPE يمكن أن تتولد بسهولة من الخلايا الجذعية المحفزة. عدة أسئلة مثيرة للاهتمام فيما يتعلق بسلامة وفعالية تسليم خلية RPE لا يزال من الممكن فحص في النماذج الحيوانية، ولقد تم تطوير بروتوكولات مقبولة تماما تستخدم لحقن RPE. وقد استخدمت هذه التقنية الموصوفة هنا من قبل جماعات متعددة في مختلف الدراسات وتتضمن إنشاء أول حفرة في العين مع إبرة حادة. ثم حقنة مع بلويتم إدخال إبرة الإقليم الشمالي محملة الخلايا من خلال ثقب ومرت من خلال الجسم الزجاجي حتى يلمس بلطف RPE. باستخدام هذه الطريقة حقن، التي هي بسيطة نسبيا وتتطلب الحد الأدنى من المعدات، ونحن تحقيق التكامل متسقة وفعالة من الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا RPE في فترة ما بين RPE المضيف الذي يمنع كمية كبيرة من انحطاط مستقبلة للضوء في النماذج الحيوانية. بينما لا تشكل جزءا من بروتوكول الفعلي، نحن تصف أيضا كيفية تحديد مدى الصدمة الناجمة عن الحقن، وكيفية التحقق من أن الخلايا تم حقن في الفضاء تحت الشبكية باستخدام طرائق التصوير في الجسم الحي. وأخيرا، فإن استخدام هذا البروتوكول لا يقتصر على الخلايا RPE. يمكن استخدامه لحقن أي مركب أو خلية في الفضاء تحت الشبكية.

Introduction

The sensory retina is organized in functional tiers of neurons, glia, and endothelial cells. Photoreceptors at the back of the retina are activated by light; through phototransduction they convert photons into electrical signals that are refined by interneurons and transmitted to the visual cortex in the brain. Phototransduction cannot occur without the coordinated efforts of Mueller glia and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE are organized in a monolayer directly behind the photoreceptors and perform multiple and diverse functions integral to photoreceptor function and homeostasis. In fact, RPE and photoreceptors are so co-dependent that they are considered to be one functional unit. Death or dysfunction of RPE results in devastating secondary effects on photoreceptors and is associated with age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of blindness in the elderly^1,2.

While no cure has been discovered for AMD, several clinical studies have shown that RPE cell replacement may be a promising therapeutic option^3-13. With the advent of stem cell technology, it is now possible to generate large numbers of RPE cells in vitro from embryonic and induced pluripotent stem cells (hES and hiPS) that strongly resemble their somatic counterparts functionally and anatomically^14-26. Stem cell-derived RPE have also been shown to function in vivo by multiple independent groups, including our own, to significantly slow retinal degeneration in rat and mouse lines with spontaneous retinal degeneration^{16,18,21,22,25,28,29}. This combination of clinical and preclinical supporting evidence is so compelling that several clinical trials to prevent retinal degeneration using stem cell-derived RPE cells are now ongoing^30,31.

RPE can be readily derived from hES and/or hiPS and implanted in the subretinal space of rodents using various derivation and injection techniques^32,33. (See Westenskow et al. for a methods paper in multimedia format demonstrating the directed differentiation protocol we employ)³⁴. There are critical remaining questions regarding the safety, survival, and functional capacity of exogenously delivered RPE cells upon implantation, therefore the ability to perform subretinal injections in rodents is a critical skill^{16,18,21,29,36,37}. The delivery of RPE is not trivial, and the field is divided on the most effective injection technique. The protocol we describe here is a simple and effective way to deliver of bolus of RPE cells subretinally, and was used in the first clinical trial for stem cell-derived RPE transplantation³¹. (The reader may also refer to another JoVE article by Eberle et al. for an alternative depiction of subretinal injections in rodents.³⁸)

The technique outlined in this manuscript cannot be visualized and trauma is unavoidable (as with any subretinal injection technique). It is performed by making a hole just under the limbus vessels and inserting a blunt needle along a transscleral route to inject a bolus of cells under the diametrically opposed retina. The person doing the injection will feel resistance as the blunt needle touches the retina. The cells may be directly visualized after the injection, however, and the degree of the induced retinal detachment can be determined by labeling the RPE cells with a transient fluorescent marker and detecting them with a confocal scanning ophthalmoscope (cSLO). An optical coherence tomography (OCT) system can also be used to monitor the trauma and easily identify the injection site.

Protocol

ملاحظة: تم علاج جميع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية التي وضعها معهد سكريبس للأبحاث.

1. إعداد مواد لحقن (~ 20 دقيقة)

1. قبل دافئ الحل تفارق الخلية (ويفضل أن يكون واحد هو أن المعطل من خلال التخفيف، وليس مع المصل)، برنامج تلفزيوني العقيمة، وسائل الإعلام والثقافة (الجدول 1).
2. تعقيم حقنة بإبرة حادة من قبل تفكيك ذلك والمغلي الأجزاء في الماء لمدة 15 دقيقة.

2. إعداد خلايا RPE للحقن (~ 30 دقيقة إلى 1 ساعة)

1. فصل الخلايا RPE باستخدام قبل تحسنت الحل تفارق خلية لمدة 5-8 دقيقة عند 37 ° C.
2. كشط الخلايا برفق لاطلاق سراح أي التي لا تزال تعلق.
3. تمييع الخلايا مع حجم كبير من وسائل الإعلام ثقافة (ملء أنبوب 15 مل) لتعطيل الحل التفكك وعدها.
4. أجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 5 دقائق لخلايا بيليه.
5. resuspend الخلايا في 200،000 خلية / ميكرولتر (لتقديم 100،000 الخلايا في حجم 0.5 ميكرولتر) في برنامج تلفزيوني قبل تحسنت معقم وتحويلها في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
6. اختياريا، إضافة خلية حية عابرة علامة فلوري واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة.
7. تحميل المحاقن مع إبرة حادة مع 0.5 ميكرولتر من الخلايا. حقن الخلايا في أقرب وقت ممكن.

3. الشبكية الفرعية حقن (~ 5 دقائق في حقن)

ملاحظة: إذا كان ذلك ممكنا، وتعلم هذه التقنية مع الجرذان الكبار منذ الأوعية حوف هي أسهل بكثير لتصور. حقن محلول الأخضر سريع عندما تعلم (قبل محاولة حقن الخلايا) لتسهيل التصور أكثر سهولة من موقع الحقن.

1. تخدير القوارض. استخدام الحقن داخل الصفاق من 100 ملغ / مل الكيتامين و 10 ملغ / مل زيلازين (20 ميكرولتر / 10 ز الجسم ثثمانية) عبر استنشاق isofluorane لأنه من الصعب على المناورة والقوارض وحقن داخل العين مع خطم في الاستنشاق.
   1. التأكد من أن الحيوان هو تخدير عميق من معسر واحد من الكفوف. إذا كان flinches، انتظر عدة دقائق أكثر وحاول مرة أخرى قبل البدء في الحقن تحت الشبكية.
2. ضع القوارض على جانبها حتى أن العين التي سيتم حقنها يواجه السقف.
3. تحت المجهر تشريح تمتد برفق الجلد حتى العين للملوثات العضوية الثابتة قليلا للخروج من مقبس (جحوظ مؤقت) ويصبح أكثر سهولة من خلال عقد رأسه مع اثنين من أصابع فقط فوق الأذن والفك وتمتد بلطف بالتوازي الجلد على الجفون ذلك أن العين للملوثات العضوية الثابتة قليلا للخروج من مقبس (انظر الشكل 1C). لا فهم القوارض قريبة جدا من الحلق.
4. مع 30 G حادة المتاح تعقيم قبل إبرة، وجعل ثقب مباشرة أسفل حوف (إذا ضرب السفن، ونزيف بالبريد كبيرة ويكون من الصعب العثور على ثقب في وقت لاحق) وفي زاوية لتجنب لمس العدسة مع الإبرة (الشكل 1D). تجنب لمس العدسة مع حادة (أو حادة) إبرة أو تشكيل الساد فوري سيحدث.
   ملاحظة: الحقن تعمل على نحو أفضل مع شخصين. وبهذه الطريقة يمكن لشخص واحد تمر الحقنة مع إبرة حادة إلى الشخص أداء الحقن بعد أن يكونوا قد أنشأ أول حفرة مع إبرة حادة القابل للتصرف للحفاظ على التركيز على حيث الثقب.
5. التراجع عن إبرة حادة المتاح من العين مع الحفاظ على قبضة على رأسه. أتذكر بالضبط حيث كان الثقب.
6. بعد إما تركيب حقنة محملة مسبقا مع إبرة حادة على micromanipulator أو إمساكه باليد، إدراج غيض من المحاقن مع إبرة حادة من خلال ثقب، مع الحرص مرة أخرى على عدم لمس العدسة وبلطف يدفع به عن طريق العين بلطف شديد حتى الشعور المقاومة (1D الشكل).
7. Keeping جميع الحركات إلى أدنى حد ممكن، وضخ بعناية الخلايا RPE ببطء في الفضاء تحت الشبكية.
   سوف يكون ذلك حافزا RPE / شبكية العين مفرزة. ملاحظة: هذا أمر لا مفر منه. ومع ذلك، فإن حقن أنظف يقلل من مفرزة ويحسن كثيرا من فرص إعادة المرتكز (الشكل 1E). أي حركات مبالغ فيها قد تتحرك الإبرة مرة أخرى في شبكية العين، ويمكن أن حركات جانبية تضر شبكية العين. استخدام مضخة الحقن هو اختياري ولكن يسمح لتسليم دقيق جدا.
8. التراجع المحقنة ببطء. تطبيق ترطيب قطرات العين للحفاظ على العين رطبة.
9. تواصل رصد الحيوان حتى يستعيد الاستلقاء القصية. لا تترك الحيوان غير المراقب أو العودة إلى قفص مع الحيوانات الأخرى في حالة تأهب حتى يستعيد الاستلقاء القصية.

النتائج

يمكننا تقديم تعليق الخلايا RPE في الفضاء تحت الشبكية من القوارض بسرعة وباستمرار باستخدام تقنية الموضحة في هذه المخطوطة. في حين ليس مطلوبا، صدمات يمكن التقليل إلى حد كبير باستخدام الإعداد يظهر مع مياداة مجهرية في الشكل 1A & B. عقد القوارض كما هو مبين في ال?...

Discussion

في هذه المقالة وصفنا طريقة بسيطة نسبيا لأداء الحقن تحت الشبكية من خلايا RPE معلق في الجرذان والفئران. بروتوكول من السهل تعلم والمزيد من الخبرة مع هذه التقنية سوف تترجم في أقل الصدمات (الشكل 3، وهذا يمثل واحدا من أفضل الحقن)، وخاصة إذا تم استخدام مياداة مجهرية

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 µg x 20
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 G, 0.5", point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Magnetic Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD  (3 ml)	VWR	BD309656	Pack x 1
Specialty-Use Needles BD  (30 G, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100 ml x 1