Realizando Subretinal Injeções em roedores para entregar epitélio pigmentar da retina células em suspensão

Resumo

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Resumo

A conversão de luz em impulsos eléctricos ocorre na retina exterior e é feito em grande parte por bastonetes e cones da retina e fotorreceptores células epiteliais de pigmento (RPE). RPE oferecer apoio crucial para fotorreceptores e morte ou disfunção de células RPE é característica da relacionada com a idade degeneração macular (DMRI), a principal causa de perda permanente da visão em pessoas com 55 anos ou mais velhos. Enquanto nenhuma cura para a AMD tenha sido identificado, o implante de RPE doentes saudáveis ​​em olhos pode provar ser um tratamento eficaz, e um grande número de células EPR pode ser prontamente gerado a partir de células estaminais pluripotentes. Várias questões interessantes em relação à segurança e eficácia da distribuição de célula EPR podem ainda ser examinados em modelos animais, e protocolos bem aceites utilizados para injectar RPE foram desenvolvidos. A técnica descrita aqui tem sido utilizado por vários grupos em vários estudos e envolve a criação de um primeiro furo no olho com uma agulha fina. Em seguida, uma seringa com um blunt agulha carregada com células, é inserido através do orifício e passado através do vítreo até tocar suavemente o RPE. Usando este método de injecção, o que é relativamente simples e requer um equipamento mínimo, que a integração coerente e eficiente de células derivadas de células RPE em tronco entre a EPR hospedeiro que impede quantidade significativa de degeneração de fotorreceptores em modelos animais. Embora não faça parte do protocolo real, que também descrevem a forma de determinar a extensão do trauma induzido pela injecção, e como para verificar que as células foram injectados no espaço sub-retiniano através de modalidades de imagiologia in vivo. Finalmente, a utilização deste protocolo não está limitada a células RPE; ele pode ser utilizado para injectar qualquer composto ou célula para o espaço sub-retiniano.

Introdução

The sensory retina is organized in functional tiers of neurons, glia, and endothelial cells. Photoreceptors at the back of the retina are activated by light; through phototransduction they convert photons into electrical signals that are refined by interneurons and transmitted to the visual cortex in the brain. Phototransduction cannot occur without the coordinated efforts of Mueller glia and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE are organized in a monolayer directly behind the photoreceptors and perform multiple and diverse functions integral to photoreceptor function and homeostasis. In fact, RPE and photoreceptors are so co-dependent that they are considered to be one functional unit. Death or dysfunction of RPE results in devastating secondary effects on photoreceptors and is associated with age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of blindness in the elderly^1,2.

While no cure has been discovered for AMD, several clinical studies have shown that RPE cell replacement may be a promising therapeutic option^3-13. With the advent of stem cell technology, it is now possible to generate large numbers of RPE cells in vitro from embryonic and induced pluripotent stem cells (hES and hiPS) that strongly resemble their somatic counterparts functionally and anatomically^14-26. Stem cell-derived RPE have also been shown to function in vivo by multiple independent groups, including our own, to significantly slow retinal degeneration in rat and mouse lines with spontaneous retinal degeneration^{16,18,21,22,25,28,29}. This combination of clinical and preclinical supporting evidence is so compelling that several clinical trials to prevent retinal degeneration using stem cell-derived RPE cells are now ongoing^30,31.

RPE can be readily derived from hES and/or hiPS and implanted in the subretinal space of rodents using various derivation and injection techniques^32,33. (See Westenskow et al. for a methods paper in multimedia format demonstrating the directed differentiation protocol we employ)³⁴. There are critical remaining questions regarding the safety, survival, and functional capacity of exogenously delivered RPE cells upon implantation, therefore the ability to perform subretinal injections in rodents is a critical skill^{16,18,21,29,36,37}. The delivery of RPE is not trivial, and the field is divided on the most effective injection technique. The protocol we describe here is a simple and effective way to deliver of bolus of RPE cells subretinally, and was used in the first clinical trial for stem cell-derived RPE transplantation³¹. (The reader may also refer to another JoVE article by Eberle et al. for an alternative depiction of subretinal injections in rodents.³⁸)

The technique outlined in this manuscript cannot be visualized and trauma is unavoidable (as with any subretinal injection technique). It is performed by making a hole just under the limbus vessels and inserting a blunt needle along a transscleral route to inject a bolus of cells under the diametrically opposed retina. The person doing the injection will feel resistance as the blunt needle touches the retina. The cells may be directly visualized after the injection, however, and the degree of the induced retinal detachment can be determined by labeling the RPE cells with a transient fluorescent marker and detecting them with a confocal scanning ophthalmoscope (cSLO). An optical coherence tomography (OCT) system can also be used to monitor the trauma and easily identify the injection site.

Protocolo

NOTA: Todos os animais foram tratados de acordo com as diretrizes éticas estabelecidas pelo Instituto de Pesquisa Scripps.

1. Elaboração de Materiais para Injecção (~ 20 min)

1. Solução de dissociação de células pré-aquecida (de preferência um que é inactivado através da diluição, não com soro), PBS estéril e meio de cultura (Tabela 1).
2. Esteriliza-se a seringa com uma agulha romba de desmontá-lo e ferver as peças em água durante 15 min.

2. Preparação das células de RPE para Injecção (~ 30 min a 1 h)

1. Separar as células RPE usando solução de dissociação de células pré-aquecido para 5-8 min a 37 ° C.
2. Raspe as células suavemente para liberar qualquer que ainda estão presos.
3. Dilui-se as células com um grande volume de meios de cultura (encher um tubo de 15 ml) para inactivar a solução de dissociação e contá-las.
4. Centrifugar a 800 xg durante 5 min para sedimentar as células.
5. Ressuspender as células em 200.000 células / ul (para entregar 100.000 células num volume de 0,5 ul) em PBS estéril pré-aquecida e transferi-los para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
6. Opcionalmente, adicionar um marcador fluorescente transiente de células vivas e incubar a 37 ° C durante 30-45 min.
7. Carregar a seringa com uma agulha romba com 0,5 ul de células. Injectar as células mais rapidamente possível.

3. Sub-retinal Injection (~ 5 min por Injection)

NOTA: Se possível, aprender a técnica com ratos albinos adultos vez que os navios límbicas são muito mais fáceis de visualizar. Injetar solução Verde Rápido quando aprender (antes de tentar injetar células) para facilitar mais facilmente a visualização do local da injeção.

1. Anestesiar o roedor. Use injecções intraperitoneais de 100 mg / ml de cetamina e 10 mg / ml de xilazina (20 mL / 10 g de corpo woito) ao longo de inalação de isofluorano, uma vez que é difícil de manobrar o roedor e injectar no olho com o focinho no inalador.
   1. Certifique-se de que o animal é anestesiado profundamente por beliscar uma das suas patas. Se ele se encolhe, esperar mais alguns minutos e tente novamente antes de iniciar a injeção sub-retiniana.
2. Posicionar o roedor para o lado, de modo que o olho que vai ser injectado é virado para o tecto.
3. Sob um microscópio de dissecação esticar suavemente a pele de modo que o olho aparece ligeiramente para fora do socket (proptose temporária) e torna-se mais acessível, segurando sua cabeça com apenas dois dedos acima da orelha e por sua mandíbula e se estendem suavemente a pele paralelo às pálpebras de modo que o olho aparece ligeiramente para cima para fora do soquete (Figura 1C). Não segure o roedor muito perto da garganta.
4. Com uma agulha afiada pré-esterilizadas descartáveis ​​30 G, faça um buraco logo abaixo do limbo (se os vasos são atingidos, o sangramento vai bum e significativa e que seja difícil encontrar o buraco mais tarde) e a um ângulo para evitar tocar na lente com a agulha (Figura 1D). Evite tocar na lente com a agulha fina (ou cega) ou formação de catarata imediato ocorrerá.
   NOTA: Injeções trabalhar melhor com duas pessoas. Desta forma, uma pessoa pode passar a seringa com a agulha romba para a pessoa que executa a injeção depois de terem criado o primeiro buraco com a agulha descartável afiada para manter o foco no que o buraco é.
5. Retirar a agulha afiada descartável do olho, mantendo o controle sobre a cabeça. Lembre-se exatamente onde o buraco é.
6. Depois de tanto montagem da seringa pré-carregada com uma agulha cega em um micromanipulator ou segurando-o pela mão, insira a ponta da seringa com a agulha romba através do buraco, tendo o cuidado de novo para não tocar na lente, e empurre suavemente através do olho muito delicadamente até sentir resistência (Figura 1D).
7. Keeping todos os movimentos a um mínimo, cuidadosamente injectar as células RPE lentamente no espaço sub-retiniano.
   NOTA: RPE / retina desapego será induzida; isso é inevitável. No entanto, uma injeção de mais limpo minimiza o desprendimento e melhora consideravelmente as chances de reinserção (Figura 1E). Quaisquer movimentos exagerados podem mover a agulha de volta para a retina, e movimentos laterais pode danificar a retina. A utilização de uma bomba de injecção é opcional, mas permite uma entrega muito preciso.
8. Retirar a seringa lentamente. Aplicar hidratante colírio para manter o olho hidratado.
9. Continue a acompanhar o animal até que ele recupere decúbito esternal. Não deixe animais autônoma ou voltar para uma gaiola com outros animais de alerta até que ele recupere a decúbito esternal.

Resultados

Podemos fornecer uma suspensão de células de RPE para o espaço sub-retiniano de roedores rapidamente e de forma consistente utilizando a técnica descrita neste manuscrito. Embora não seja obrigatório, traumas pode ser bastante minimizado utilizando a configuração mostrada com uma micromanipulator na Figura 1A & B. Segurar o roedor tal como mostrado na Figura 1C para a proptose temporária. Os passos são os mesmos se realizado com a micromanipulator ou à mão; estes estão ...

Discussão

Neste artigo vamos descrever um método relativamente simples para a realização de injecções subretinal de células EPR em suspensão em ratos e camundongos. O protocolo é fácil de aprender e mais experiências com a técnica irá traduzir em menos trauma (Figura 3, o que representa um dos melhores injecções), especialmente se for usado um micromanipulador (Figura 1A). Qualquer trauma pode ser monitorizada in vivo com um sistema cSLO e outubro (Figura 2)

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 µg x 20
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 G, 0.5", point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Magnetic Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD  (3 ml)	VWR	BD309656	Pack x 1
Specialty-Use Needles BD  (30 G, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100 ml x 1